Aquí, presentamos un protocolo para la grabación de la red neuronal rítmica teta y oscilaciones gamma de una preparación de hipocampo aislado todo. Describimos los pasos experimentales desde la extracción del hipocampo hasta los detalles de las grabaciones de parches de campo, unitarios y de células enteras, así como la estimulación optogenética del ritmo teta.
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Artículo de método
Tuning en la banda Theta Hippocampal
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe los procedimientos para la preparación y registro del hipocampo entero aislado, de WT y ratones transgénicos, junto con mejoras recientes en metodologías y aplicaciones para el estudio de las oscilaciones de theta. Se presenta una caracterización simple de la preparación aislada del hipocampo mediante la cual se examina la relación entre los osciladores internos de la teta del hipocampo junto con la actividad de las células piramidales y las interneuronas GABAérgicas de las áreas cornu ammonis-1 (CA1) y subiculum (SUB). En general, se demuestra que el hipocampo aislado es capaz de generar oscilaciones intrínsecas de theta in vitro y que la ritmicidad generada dentro del hipocampo puede manipularse con precisión mediante la estimulación optogenética de interneuronas positivas a parvalbúmina (PV). La preparación hippocampal aislada in vitro ofrece una oportunidad única de usar grabaciones simultáneas en campo y intracelular de patch-clamp de neu visualmente identificadoPara comprender mejor los mecanismos subyacentes a la generación del ritmo theta.
Introducción
Las oscilaciones de la teta del hipocampo (4 - 12 Hz) están entre las formas más predominantes de actividad rítmica en el cerebro de los mamíferos y se cree que desempeñan papeles clave en funciones cognitivas como el procesamiento de la información espaciotemporal y la formación de memorias episódicas 1 , 2 , 3 . Mientras que varios estudios in vivo que ponen de relieve la relación de la teta modulada lugar de las células con la navegación espacial y la lesión estudios, así como la evidencia clínica, apoyan la opinión de que el hipocampo theta oscilaciones están in....
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Protocolo
Todos los procedimientos se han realizado de acuerdo con los protocolos y directrices aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de McGill y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.
1. Preparación in vitro del hipocampo agudo
NOTA: El aislamiento de la preparación intacta del hipocampo implica tres pasos principales: (1) Preparación de soluciones y equipo, (2) Disección del hipocampo y (3) Configuración del sistema de velocidad de perfusión rápida necesario para la generación de oscilaciones intrínsecas de teta. En este protocolo, el desempeño oportuno de los procedimientos -d....
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Resultados
Esta sección ilustra ejemplos de resultados que pueden obtenerse estudiando las oscilaciones de theta en la preparación hipocampal aislada de ratón in vitro . El procedimiento de disección para extraer el hipocampo aislado se ilustra en la Figura 1 . Usando esta preparación, se pueden examinar las oscilaciones intrínsecas de la teta durante la colocación de múltiples electrodos de campo, registrando la actividad total y las entradas sinápticas.......
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Discusión
Mientras que las grabaciones electrofisiológicas de cortes de hipocampo agudo constituyen una técnica in vitro estándar, los métodos aquí presentados difieren sustancialmente del enfoque clásico. A diferencia de las preparaciones de rebanadas finas donde las capas celulares específicas son visibles en la superficie y pueden ser examinadas directamente, las preparaciones intactas del hipocampo se asemejan más a configuraciones in vivo en las que los electrodos se bajan en regiones cerebrales dirigidas m.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran ningún interés comercial o financiero competitivo.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Ciencias Naturales.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de sodio | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sacarosa | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - fosfato de sodio monobásico | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Sulfato de magnesio | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Cloruro de potasio | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-glucosa | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Cloruro de calcio dihidratado | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Ascorbato de sodio | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Equipo | |||
| Standard Tijeras de disección | Fisher Scientific | 08-951-25 | cerebro |
| Mango de bisturí #4, 14 cm | WPI | 500237 | de cerebro |
| Filtro pinzas de mandíbula plana, rectas (11 cm) | WPI | 500456 | extracción de cerebro |
| Hojas de bisturí de acero inoxidable Paragon #20 | Ultident | 02-90010-20 | extracción de cerebro |
| Tijeras de disección curvas de punta fina | Thermo Fisher Scientific | 711999 | extracción cerebral |
| Espátula fina recubierta de teflón (PTFE) | VWR | 82027-534 | Preparación |
| para el hipocampoMicroespátula estilo Hayman | Fisher Scientific | 21-401-25A | para el hipocampo |
| Cuchara de laboratorio | Fisher Scientific | 14-375-20 | para el hipocampo |
| Vidrio de borosilicato Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | preparación para el hipocampo |
| Droper | Fisher Scientific | preparación para el hipocampo | |
| Hojas de afeitar Un solo filo | VWR | 55411-055 | Preparación del hipocampo |
| Papel para lentes (4 x 6") | VWR | 52846-001 | Preparación del hipocampo |
| Placas de Petri de vidrio (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | Preparación del hipocampo |
| Bandeja de plástico para hielo; tamaño 30 x 20 x 5 cm | n.a.n.a.Preparación | del hipocampo | |
| Calentador de solución en línea simple | Warner Instruments | Sistema de perfusión SH-27B | |
| Piedras difusoras de acuario para burbujear | n.a.n.a.sistema | perfusión | |
| Tygon E-3603 tubo (ID 1/16 OD 1/8) | perfusión | Fisherbrand | 14-171-129 |
| Sartén eléctrica | Black & Sistema de perfusión Decker | n.a. | : |
| 95% O2/5% CO2 mezcla de gases (carbógeno) | de | perfusión | SG466204A Vitalaire |
| Frascos/frascos de vidrio (4 x 1 L) | n.a.n.a.sistema | perfusión | |
| Cámara sumergida | Diseño personalizado de la cámara (FM) | n.a.Se | puede utilizar una alternativa comercial |
| Pipetas de vidrio (1,5/0,84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrofisiología |
| Hum Bug 50/60 Hz Eliminador de ruido | Quest Scientific | Electrofisiología | Q-Humbug |
| Amplificador de pinza parche Multiclamp 700B | Dispositivos moleculares | Electrofisiología | MULTICLAMP |
| Programa Commander Multiclamp 700B | Dispositivos moleculares | Electrofisiología | MULTICLAMP |
| Convertidor digital/analógico | Dispositivos moleculares | Electrofisiología | DDI440 |
| PCLAMP10 | Dispositivos | molecularesPCLAMP10 | electrofisiología |
| Mesa de aislamiento de vibraciones | Newport | n.a.electrofisiología | |
| Micromanipuladores (operados manualmente) | Siskiyou | MX130 | electrofisiología (LFP) |
| Micromanipuladores (automatizados) | Siskiyou | MC1000e | electrofisiología (parche) |
| Monitor de audio | A-M Systems | Modelo 3300 | electrofisiología |
| Micropipeta/Extractor de pipetas | Sutter | P-97 | electrofisiología |
| Microscopio de fluorescencia vertical hecho a medida | Siskiyou | n.a.Imaging | |
| Cámara de vídeo analógica | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging Capturador |
| fotogramas digital con software de imagen | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imagen |
| Olympus 2.5X | objetivo Olympus | MPLFLN | Imagen |
| Olympus 40X objetivo de inmersión en agua | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imagen |
| Sistema de diodo emisor de luz (LED) hecho a medida | Estimulación | optogenética personalizada (Amhilon et al., 2015) | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Animals | |||
| stock de | Jackson Laboratory | Permitir Expresión génica dirigida por Cre en interneuronas PV | |
| Ratones Ai9 constitutivos-condicionales (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))Número | Jackson Laboratory | 007905 | Express TdTomato después de la recombinación mediada por Cre |
| Ratones Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP Número de | Jackson Laboratory | 012569 | Expresar la proteína de fusión canalrodopsina-2/EYFP mejorada después de la exposición a Cre Ratones recombinasa |
| PVChY | Cría interna | n.a.Descendencia | obtenida a partir del cruzamiento de la línea PV-Cre con ratones Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Referencias
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J.
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Reimpresiones y permisos
