Tuning en la banda Theta Hippocampal In Vitro: Metodologías para la grabación del circuito septohippocampal de roedores aislados

Las oscilaciones de la teta del hipocampo (4 - 12 Hz) están entre las formas más predominantes de actividad rítmica en el cerebro de los mamíferos y se cree que desempeñan papeles clave en funciones cognitivas como el procesamiento de la información espaciotemporal y la formación de memorias episódicas ^{1 , 2 , 3} . Mientras que varios estudios in vivo que ponen de relieve la relación de la teta modulada lugar de las células con la navegación espacial y la lesión estudios, así como la evidencia clínica, apoyan la opinión de que el hipocampo theta oscilaciones están involucrados en la memoria formación ^{4 , 5 , 6} , los mecanismos asociados Con la generación de oscilaciones de la teta del hipocampo todavía no se entienden completamente. Las investigaciones tempranas in vivo sugirieron que la actividad de theta dependía principalmente de osciladores extrínsecos, en particular de entrada rítmicaDe estructuras cerebrales aferentes como el septo y la corteza entorrinal ^{7 , 8 , 9 , 10} . Un papel para los factores intrínsecos - conectividad interna de las redes neuronales del hipocampo junto con las propiedades de las neuronas del hipocampo - también se postuló sobre la base de observaciones in vitro ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} . Sin embargo, aparte de unos cuantos estudios históricos ^{19 , 20 , 21} , las dificultades en el desarrollo de enfoques que podrían reproducir las actividades fisiológicamente realistas de la población en la preparación de la rebanada in vitro simpleS han retrasado durante mucho tiempo un examen experimental más detallado de las capacidades intrínsecas del hipocampo y áreas relacionadas para autogenerar oscilaciones teta.

Un inconveniente importante de la norma in vitro de corte fino de ajuste experimental es que la organización celular 3D y sináptica de las estructuras cerebrales se ve generalmente comprometida. Esto significa que no se pueden apoyar muchas formas de actividades de redes concertadas basadas en conjuntos de células distribuidas espacialmente, que van desde grupos localizados (≤1 mm de radio) hasta poblaciones de neuronas diseminadas a través de una o más áreas cerebrales (> 1 mm). Teniendo en cuenta estas consideraciones, un tipo diferente de enfoque fue necesario para estudiar cómo teta oscilaciones emergen en el hipocampo y propagar a corticales relacionados y subcortical las estructuras de salida.

En los últimos años, el desarrollo inicial de la "completa septo-hipocampo" preparación para examinar intera bidireccionalCiones de las dos estructuras ²² y la consiguiente evolución de la preparación del "hipocampo aislado", han revelado que las oscilaciones intrínsecas de la teta ocurren espontáneamente en el hipocampo sin entrada rítmica externa ²³ . El valor de estos enfoques reside en la idea inicial de que toda la estructura funcional de estas regiones tenía que ser conservado con el fin de funcionar como un generador de ritmos theta in vitro [ ^22] .

Todos los procedimientos se han realizado de acuerdo con los protocolos y directrices aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de McGill y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

1. Preparación in vitro del hipocampo agudo

NOTA: El aislamiento de la preparación intacta del hipocampo implica tres pasos principales: (1) Preparación de soluciones y equipo, (2) Disección del hipocampo y (3) Configuración del sistema de velocidad de perfusión rápida necesario para la generación de oscilaciones intrínsecas de teta. En este protocolo, el desempeño oportuno de los procedimientos -desde la disección hasta el registro- es particularmente importante porque el hipocampo aislado constituye una preparación tan densa, pero delicada, que el mantenimiento de la conectividad funcional de la estructura in vitro requiere gran cuidado. Preparar todo de antemano asegura que un nivel adecuado de perfusión está disponible tan pronto como sea posible para minimizar la celda dAmage y mantener la función fisiológica.

1. Solución de líquido espinal cerebral artificial a base de sacarosa (aCSF)
   1. Preparar 1 x solución de sacarosa de reserva para ser utilizado para la disección y la incubación post-disección. Combinar todos los componentes enumerados en la Tabla 1, a excepción de CaCl _2, en 1 L de agua desionizada, y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
2. Solución estándar aCSF
   1. Preparar aCSF estándar para la perfusión de alto caudal del hipocampo aislado durante las grabaciones electrofisiológicas. Para hacer que el concentrado (5X) stock LCRa, disolver todos los componentes enumerados en la Tabla 2, excepto CaCl _2, en 2 L de agua desionizada y almacenar a 4 ° C.
3. Preparar el equipo
   1. Antes de iniciar la disección, configure el área del banco con una bandeja de plástico rellena de hielo (30 x 20 x 5 cm), tuberías de tuberías conectadas al carbógeno yEe de vidrio (10 x 2 cm) (Ver Figura 1 ).
   2. Añadir 300 ml de solución de sacarosa (1 x stock) a un vaso de precipitados de 500 ml, burbujearlo con carbógeno (95% de O ₂ , 5% de CO ₂ ) y añadir Ca ²⁺ [1,2 mM].
   3. Transferir 60 ml de esta solución de sacarosa a una placa de Petri de vidrio y dejar a temperatura ambiente. Coloque el resto en un congelador de 4 ° C durante 10 - 15 min.
   4. Burbujear la solución de sacarosa helada con carbógeno a lo largo de la disección.
   5. Llenar una segunda placa de Petri (cámara fría) con solución de sacarosa (4 ° C) y mantener en hielo.
   6. Añadir 30 ml de solución de sacarosa enfriada con hielo a un vaso de precipitados de 50 ml.

2. Dissección del hipocampo entero

NOTA: El método para diseccionar el hipocampo aislado es esencialmente idéntico al desarrollado y descrito originalmente ²² , pero con detalles adicionales y cambios con respecto al peVelocidad de grabación y técnicas de grabación.

1. Disección cerebral
   1. Anestesiar el ratón (P20 - 35) bajo una campana extractora de humos con una pequeña toalla de papel empapada con 1 ml de isoflurano (100%) que se agrega a la jaula.
   2. Decapitar el ratón anestesiado y sumergir rápidamente la cabeza en solución de sacarosa helada (vaso de precipitados de 50 ml, ~ 5 s). Transferir sobre una toalla de papel.
   3. Utilice un bisturí para realizar una incisión cutánea medial (caudal a rostral) y empuje la piel por los lados para exponer el cráneo.
   4. Cortar el cráneo con una pequeña tijeras y utilizar una espátula para extraer rápidamente el cerebro y dejarlo caer en la placa de Petri que contiene solución de sacarosa helada. Deje 1-2 min para que el cerebro se enfríe.
   5. Mientras el cerebro se está recuperando, agregue 2 - 3 mL de solución de sacarosa sobre un plato de Petri (disección) cubierto de papel para lentes sobre hielo.
2. Aislamiento del hipocampo
   1. Coloque el cerebro sobre el plato de disección en posición verticalnorte.
   2. Retire el cerebelo y la corteza frontal con una cuchilla de afeitar. Cortar el cerebro por la mitad a lo largo del plano midsagittal y devolver los dos hemisferios aislados a la cámara de contención. Deje 1 - 2 min más para la recuperación.
   3. Coloque el cerebro hemisectado solo en posición vertical sobre el plato de disección.
   4. Gire el plato hasta que las estructuras centro-medianas se enfrenten al observador y el contorno incrustado del complejo septal sea visible como una delgada capa de tejido en forma de pera anterior al tálamo.
   5. Mantenga firme el cerebro con la microspátula y coloque el extremo pequeño de la espátula recubierta de PTFE (politetrafluoroetileno) inmediatamente detrás del área septal (caudal).
   6. Inserte la espátula recubierta debajo del tabique y mueva la punta hacia abajo hasta alcanzar el plato de disección. Separar las fibras que conectan el área septal caudalmente. Repita la misma operación a lo largo del borde anterior del septo y corte las fibras que se conectan a la parte frontal del cerebro.
   7. Con la espátula sosteniendo ligeramente la parte interna de la corteza justo por encima del hipocampo en posición vertical, use la microspátula para tirar con cuidado hacia abajo del talámico, el hipotálamo y el resto de los núcleos del tronco encefálico. Utilice la espátula para cortar y quitar el tejido extraído.
   8. Girar el hemisferio aislado en su lado e identificar el contorno del hipocampo.
   9. Inserte la espátula recubierta en el ventrículo lateral, debajo del extremo rostral del hipocampo dorsal.
   10. Sostenga la espátula horizontalmente alineada con el plano medio sagital del cerebro hemipediado y deslícela a través del contorno liso de las paredes ventriculares hasta que la punta emerja caudalmente.
   11. Sostenga la espátula debajo del hipocampo y presiónela ligeramente sobre las fibras de conexión, a lo largo de la capa interior donde el hipocampo se une con la corteza superpuesta. Aplicar la microspátula en el lado externo de esta capa y deslizar contra la espátula recubierta para cortar a través de la conexión fiBers
   12. Para completar la extracción, gire el plato de disección e inserte la espátula recubierta debajo del hipocampo ventral. Sujete ligeramente el interior del pliegue cortical con la espátula y corte a través de las conexiones entorinales utilizando un movimiento de corte en contra de la microspátula.
       NOTA: El complejo septohippocampal completo puede ser removido colocando la espátula recubierta debajo del hipocampo entero, y sacando el tejido cerebral restante de debajo.
   13. Una vez que el aislamiento esté completo, mantenga el hipocampo descansando sobre el plato y agregue una gota de solución de sacarosa helada para mantenerla fresca. Cuidadosamente recortar cualquier cortical y fibras restantes y separar el hipocampo del septo mediante la aplicación suave de una hoja de afeitar a través del fórnix.
       NOTA: Si se van a realizar grabaciones de parches de células piramidales (ver Sección 4.6 Control optogenético), el hipocampo aislado puede cortarse transversalmente a un ángulo de 45 ° para exponer la capa piramidal de CA1 ("anglE-cut "), sin comprometer el circuito de red local en la porción restante del hipocampo.
   14. Se transfiere la preparación a solución de sacarosa a temperatura ambiente y se deja reposar durante 15 - 30 min antes de transferir a la cámara de registro.

3. Configurar la perfusión rápida para la grabación del hipocampo aislado

1. Instale el sistema de perfusión alimentado por gravedad para permitir el flujo continuo de alta velocidad de aCSF oxigenada a 20 - 25 mL / min.
   1. Preparar los frascos aCSF (1X) por adelantado y sumergirlos en un baño de calentamiento (~ 30 ° C) al menos 15 minutos antes del inicio del experimento. Encienda el sistema de calentador de solución en línea (30 ° C).
   2. Utilice burbujeadores de acuario y líneas de tubo conectado a un tanque de carbogen para oxigenar LCRa durante todo el experimento, y añadir CaCl ₂ [2 mM] antes del inicio de la perfusión.
   3. Detenga el flujo de aCSF y transfiera el hipocampo a la cámara de grabación usando el anchoFinal de una pipeta de vidrio. Deje que la preparación saturada de sacarosa se hunda y se asiente en la parte inferior.
   4. Coloque la preparación en el centro de la cámara de registro (en línea con el eje de entrada-salida) con la superficie lisa de CA1 y SUB en la parte superior. Estabilizar el hipocampo con pesos pequeños en las extremidades septal y temporal y reiniciar el flujo aCSF.

4. Electrofisiología en el hipocampo aislado

1. Registro extracelular de las oscilaciones in vitro de la teta del hipocampo
   1. Para el monitoreo extracelular del potencial de campo local (LFP) o actividad de una sola unidad del hipocampo aislado in vitro , utilice micropipetas de cristal (1 - 3 MΩ) llenas de aCSF. Registre señales de potencial de campo acoplado a AC de bajo ruido con un amplificador de abrazadera de patch de ganancia x1000, filtrado en banda en línea de 0,1 a 500 Hz y una frecuencia de muestreo de 5-20 kHz.
      NOTA: El microscopio personalizado que se utiliza en este protocoloEstá equipado con objetivos de baja (2.5X) y alta ampliación (40X) para la vista de baja amplificación del hipocampo, así como microscopía de video infrarrojo y epifluorescencia para el reconocimiento de una sola célula. Los componentes de este sistema incluyen el microscopio de fluorescencia vertical, cubos de filtro de fluorescencia, una cámara de video analógica y grabador digital de imágenes con software de imagen, una cámara de perfusión personalizada en el escenario ( Figura 2A , inserto i) y micromanipuladores de alta precisión para grabaciones neuronales y Colocación de fibra óptica.
   2. Utilice la cámara montada en el microscopio y conectada a la pantalla del ordenador para inspeccionar la preparación del hipocampo con una ampliación baja (2.5X) y compruebe rápidamente que no haya cortes o daños en la superficie externa. La disposición orientada diagonalmente de las fibras de alvéolos a lo largo de la superficie lisa de CA1 debería ser visible ( Figura 2A , inserto ii) al brillar la luz transmitida a través del hipocampus.
   3. Utilice el objetivo de amplio campo de ampliación baja para ver el hipocampo aislado y la colocación de los electrodos LFP en ubicaciones de grabación específicas.
      NOTA: En la Figura 2A se ilustra un diseño de la preparación aislada del hipocampo con múltiples electrodos colocados en diferentes lugares de grabación.
   4. Baje un electrodo LFP en el baño hasta que toque la superficie (alvéolo) del área CA1.
      NOTA: Esto generalmente produce un transitorio rápido en la grabación acoplada a CA, similar a lo que ocurre cuando el electrodo entra en contacto con el medio de grabación. Un monitor de audio puede ser útil para escuchar la señal del canal LFP después de este paso.
      NOTA: A menudo, los primeros signos de actividad sólo aparecen después de 10 - 15 min, por lo tanto, es importante no avanzar rápidamente en la preparación. Si después de este período el electrodo LFP superficial todavía no está recogiendo actividad, avanza un poco más abajo a través del estrato oriensY hacer una pausa periódicamente para ver si surge alguna forma de actividad mientras se aproxima a la capa celular principal. Si no se detecta nada después de otros 5 - 10 min, retraiga cuidadosamente el electrodo y colóquelo en otra parte a lo largo de la misma región.
   5. Avance el electrodo LFP a través de la capa piramidal. Obsérvese que la actividad de la agregación extracelular aumenta inicialmente a medida que se detecta la descarga de una sola unidad de las neuronas individuales (en su mayoría células piramidales e inhibidoras). Baje el electrodo más y observe que el pico empieza a desvanecerse de nuevo cuando la punta cruza en el radio. Observe que una oscilación claramente visible de la red en el rango de frecuencias theta (4 - 12 Hz) se hace evidente y alcanza la amplitud máxima (~ 100 - 300 μV) a medida que el lugar de grabación se baja a través del radio.
2. Teta oscilaciones a través de una sola región
   1. Para probar las propiedades espaciales de las oscilaciones de la teta espontánea a través de la región CA1, coloque la punta oFa hace referencia al electrodo LFP en un sitio CA1 medial (situado medialmente a lo largo del eje longitudinal septo-temporal) y lo baja en el radioatum como se ha descrito anteriormente.
   2. Coloque un segundo electrodo LFP en un sitio CA1 (200 - 800 μm septal o temporal de la primera LFP) y observe que las oscilaciones de theta CA1 pueden sincronizarse en distancias relativamente grandes.
3. Teta oscilaciones a través de capas
   1. Para probar las propiedades de las oscilaciones de theta a través de las capas del hipocampo, deje un electrodo LFP de referencia en un sitio de radiata CA1. Comenzando justo por encima del estrato orien- te, baje un segundo electrodo en la capa de células piramidales ya través del radiato. Observar una inversión gradual de la señal LFP (inversión de fase relativa) a través de la capa piramidal.
      NOTA: Para ejemplos representativos de estos tipos de actividad, véase la Figura 2B . Ejemplos de perfiles laminares / de profundidad y análisis de densidad de fuente de corriente (CSD)Está ilustrando el sitio de inversión de fase en hipocampos aislados que se han publicado previamente ^{23 , 24 , 25} .
4. Oscilaciones gamma y acoplamiento teta-gamma en el hipocampo intacto
   1. Coloque un electrodo de campo en el borde CA1 / SUB y bájelo hasta que se sitúe en la interfase entre las capas piramidal y molecular. A este nivel, se puede registrar un potencial de campo que muestra oscilaciones gamma claras con cambios de amplitud que bloquean la fase al ritmo teta local ²⁴ . Ajustar la escala para observar la escala de tiempo lenta del acoplamiento theta-gamma. Tenga en cuenta que las ráfagas gamma se producen en dos bandas de frecuencia distintas, que pueden ser reveladas por la banda de paso de filtrar la señal de LFP en curso en la lenta (25 - 50 Hz) y gamma rápida (150 - 250 Hz) Rango (Véase la Figura 2C para representante filtró Trazas).
5. Grabación de la abrazadera de parche de células enteras durante las oscilaciones in vitro de la teta del hipocampo
   NOTA: En esta parte del protocolo, el objetivo es obtener grabaciones de parche de parche de células enteras visualmente guiadas a partir de interneuronas identificadas en hipocampos aislados de ratones transgénicos PV-TOM que expresan la proteína fluorescente, tdTomato, bajo el control del promotor PV Más detalles ver materiales y Ref. ²⁶ ).
   1. Utilice microscopía de video de fluorescencia con una ampliación baja (2.5X) y alta potencia (40X) para visualizar las interneuronas positivas a tdTomato situadas cerca de la superficie de una preparación de hipocampo de un ratón PV-TOM ( Figura 3 ). Obsérvese que aunque las neuronas PV-TOM pueden ser visualizadas con éxito y dirigidas a parches a través del alvéolo (hasta 100 μm), las células piramidales no fluorescentes también se pueden alcanzar con relativa facilidad cuando el hipocampo se prepara con la técnica de corte angular Sección 2.2.14 nota).
   2. Bajo una vista de baja amplificación del hipocampo, coloque un electrodo LFP en CA1 / SUB para monitorear las oscilaciones de theta mientras se prepara para experimentos de pinza de parche.
   3. Cambie a una ampliación de 40X y sumerja el objetivo sobre la región de destino; Bájelo hasta que las capas superiores se vuelvan visibles. Manipular la posición del microscopio para asegurar un acceso abierto suficiente para la aproximación de la pipeta de remiendo desde el lado opuesto.
   4. Bajo microscopía de fluorescencia, seleccione una célula fluorescente PV-TOM y enfoque con una pipeta de parche (2 - 3 MΩ) llena de solución intracelular estándar.
   5. Use una boquilla para aplicar presión positiva de luz a la pipeta y monitoree la resistencia mientras el electrodo se baja a la celda. Cuando la punta encuentra la célula objetivo, la resistencia de la pipeta aumenta y aparece un hoyuelo transparente cuando la presión positiva empuja la membrana. Suelte la presión y compruebe que el pulso de corriente se aplaste a medida que empieza a formarse un sello. Inmediatamente clAmp a un potencial hiperpolarizado (-70 mV), y una vez que se consigue un sellado GΩ, rompa la membrana celular con una pequeña cantidad de presión negativa aplicada a través del soporte de la pipeta.
   6. Una vez en la configuración de células enteras, examinar las propiedades fisiológicas de células PV identificadas durante espontánea hipocampo oscilaciones ( Figura 3B ].
   7. Obsérvese que el registro de potencial de membrana intracelular a partir de células FV se caracteriza por un comportamiento de pico rápido y ráfagas de potenciales de acción sincronizados con el ritmo teta CA1 / SUB en curso.
   8. Cambiar a la tensión de sujeción y sostener la célula a diferentes potenciales de membrana para caracterizar la relación entre las corrientes sinápticas excitador versus inhibitorio generado por la actividad rítmica intrínseca. Un ejemplo de grabación de pinza de parche de una célula piramidal se muestra en la Figura 3A para comparación.
6. Control optogenético en el hipocampo aislado NOTA: Para el control optogenético de la actividad de la red del hipocampo, se utiliza una estrategia específica de tipo celular que implica la activación rítmica de células GABAérgicas que contienen PV, ya que estas células desempeñan un papel importante en la sincronización de las poblaciones de células principales en el hipocampo aislado ²⁵ . La expresión selectiva de la canal excitadora de rhodopsina-2 (ChR2) en células PV se consigue cruzando la línea de ratón PV-Cre con ratones que expresan constitutivamente a ChR2 Cre dependiente (Ai32), generando de este modo ratones PV-ChY. Alternativamente, se pueden inyectar construcciones de vectores virales ( por ejemplo , AAVdj-ChETA-eYFP) en el hipocampo de ratones PV-Cre o PV-TOM (P15-16) para dirigir la expresión de la opsina excitadora en interneuronas CA1 / SUB ( Figura 4A ).
   NOTA: Esta estrategia se ha descrito previamente ²⁵ .
   1. Colocar un electrodo LFP en el área CA1 / SUB y remendar una célula piramidal cercana en el hipocampo aisladoAmpus de un ratón que expresa la sensibilidad sensible a la luz azul opsina ChR2 en PV interneuronas.
   2. Coloque una guía óptica de fibra óptica (0.2 - 1 mm de diámetro) por encima de la preparación del hipocampo y centrarla en la región grabada. Utilice luz azul (473 nm) de una fuente de LED para la estimulación optogenética, consistente en impulsos de luz (10-20 ms, activados por una señal lógica de transistor-transistor) o comandos de tensión de onda sinusoidal entregados a frecuencias theta (4 - 12 Hz).
      NOTA: El conjunto de estimulación de luz basado en LED personalizado se ha descrito en otro lugar ²⁵ .
   3. Cambiar a la abrazadera de corriente y caracterizar la actividad de la piramidal durante las oscilaciones de la teta espontánea.
   4. Iniciar el protocolo de estimulación y registrar las respuestas de la luz. Observe que las oscilaciones de campo y la actividad sináptica en la neurona grabada se sincronizan cada vez más durante la estimulación optogenética y que la estimulación rítmica de las células FV da como resultado un control robusto de ambas frecuenciasY la potencia de las oscilaciones theta ( Figura 4 ).

Esta sección ilustra ejemplos de resultados que pueden obtenerse estudiando las oscilaciones de theta en la preparación hipocampal aislada de ratón in vitro . El procedimiento de disección para extraer el hipocampo aislado se ilustra en la Figura 1 . Usando esta preparación, se pueden examinar las oscilaciones intrínsecas de la teta durante la colocación de múltiples electrodos de campo, registrando la actividad total y las entradas sinápticas sincronizadas a las poblaciones neuronales en diferentes regiones y capas del hipocampo aislado ( Figura 2 ). Se presentan resultados representativos de la fijación simultánea de parches y registros extracelulares de células enteras para caracterizar las propiedades de disparo y sinápticas de tipos celulares específicos durante las oscilaciones espontáneas de la teta del hipocampo ( Figura 3 ), así como durante la manipulación optogenética de la actividad rítmicaG "> Figura 4).

Figura 1: Procedimiento de disección para la preparación de hipocampo intacto aislado.
(A) Vista general de la configuración de la disección. Arriba a la derecha: frasco de solución de sacarosa enfriada con hielo carbogenado (1); Abajo a la izquierda: bandeja de plástico rellena de hielo (2) que sujeta el plato de disección cubierto con papel de lentes (3); La cámara de contención fría que contiene solución de sacarosa (4); Y un conjunto de herramientas quirúrgicas (5). ( B ) Vista del cerebro del ratón antes de la hemisección en el plato de disección. ( C ) Recuperación del cerebro hemisectado en la cámara de contención fría y vista ampliada (inserción) del hemisferio izquierdo del cerebro antes de insertar el extremo pequeño de la espátula recubierta debajo del tabique. ( D ) Espátula revestida colocada bajo el hipocampo aislado, a lo largo de la región CA1 / SUB, con el resto del cerebroEl tejido se extrae por debajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Configuración de la configuración para la grabación de las oscilaciones teta in vitro de la preparación del hipocampo intacto en la cámara de grabación sumergida.
(A) El hipocampo aislado se muestra con un diseño de las regiones del hipocampo y múltiples electrodos colocados en cuatro sitios diferentes de grabación distribuidos septotemporally (indicado por asteriscos blancas). En la vista de la plataforma de la cámara de registro mostrada anteriormente (inserto i), la entrada y la salida para el flujo de perfusión rápida están indicadas por los números (1, 2). En la imagen ampliada del hipocampo que se muestra a continuación (inserto ii), se coloca un electrodo en la mitadEl CA1 sepetotemporal y las fibras del alveo son fácilmente visibles, corriendo diagonalmente hacia el subículo. S: septal, T: temporal, f / fx: fimbria-fornix. B ) Representación esquemática de la organización de capas CA1 con trazas LFP representativas registradas simultáneamente a partir de stratum oriens (gris) y stratum radiatum (negro). Observe la fase invertida de las señales entre las dos capas. Alv: estrato alveo, PR: estrato pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Ejemplo de trazado de LFP que muestra oscilación teta espontánea registrada desde el área CA1 / SUB (segmento de 20 seg) y segmentos expandidos de 2 seg (abajo) de la señal no filtrada; Paso de banda filtrado para frecuencias teta (0,5 - 12 Hz); Gamma lenta (25 - 55 Hz); Y gamma rápido (125 - 250 Hz). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Actividad específica del tipo de células de células piramidales y de interneuron de PV durante las oscilaciones tetaticas espontáneas en la preparación de hipocampo intacto de un ratón PV-TOM.
(A) La actividad sináptica grabado desde una célula piramidal durante oscilaciones theta. Las trazas de pinzas de corriente (panel izquierdo) muestran un disparo espontáneo pero no rítmico en reposo, y los potenciales postsinápticos inhibidores (iPSPs) que no estaban claramente sincronizados con la oscilación lentamente emergente de LFP. Las grabaciones de tensiones (panel derecho) muestran que las correspondientes corrientes postsinápticas inhibitorias (iPSCs) tienen su potencial de inversión alrededor de -70 mV. ( B ) Actividad sináptica registrada a partir de una interneurona fluorescente de PV de rápido crecimiento durante las oscilaciones teta. En la abrazadera de corriente (izquierda), esta célula se disparaba espontáneamente en reposo y fue impulsada fuertemente por po rítmico excitadorStsynaptic potenciales (ePSPs) que fueron fase de bloqueo con la oscilación estable LFP. En las grabaciones de tensión de sujeción (derecha), el potencial de inversión de corriente postsináptica excitatoria fue de aproximadamente 0 mV. Los dibujos esquemáticos en la parte superior muestran la configuración experimental junto con la colocación de electrodos de parche y campo en las imágenes de ampliación CA1 / SUB y alta (40X) de la pila piramidal registrada y de la interneurona PV fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Potencial de campo local y grabaciones simultáneas de abrazaderas de parche de neuronas piramidales y fotovoltaicas CA1 / SUB individuales durante oscilaciones tetaticas espontáneas y optogenéticas en el hipocampo aislado.
Un B ) Caracterización de una neurona piramidal que muestra la imagen de la célula registrada (parte inferior) de las propiedades típicas de Spike Regular (RS) (arriba) y alta (40X). C ) Grabación de corriente de la misma célula en el potencial de membrana despolarizado (negro) junto con la señal de LFP (gris) y mostrando IPSPs rítmicos sincronizados durante la oscilación espontánea (izquierda) y durante la estimulación de luz theta-frecuencia (6 Hz) derecho). El patrón de estimulación de la luz (sombreado azul) se representa en la parte superior de los trazos de voltaje. D ) Spectrograma y espectro de potencia de la forma de onda LFP antes, durante y después de una simulación de luz de 6 Hz (línea de base, estimulación, post). ( E ) Imágenes de fluorescencia y de campo luminoso de baja ampliación del aislamientoEd hipocampo preparación mostrando eYFP fluorescencia (en verde) localizada en la región CA1 / SUB. ( F ) Caracterización de los pasos actuales que muestran el comportamiento de Fast-Spiking (FS) de una interneurona registrada de PV-TOM (imagen de fluorescencia 40X a continuación). ( G ) Registro de potencial de membrana que muestra EPSPs grandes y disparo rítmico de la célula fotovoltaica registrada sincronizada con la señal LFP durante la oscilación espontánea del campo (izquierda) y durante la estimulación luminosa (derecha) a 3 Hz. ( H ) Promedio disparado por el campo (FTA) de los picos de las células fotovoltaicas sobre la señal CAF / CA LFP. La descarga de la célula fotovoltaica en múltiples ensayos (centrada en los picos LFP) se convirtió en un FTA de picos registrados durante la oscilación espontánea (línea de base) y durante la estimulación de la luz (stim). Los gráficos de la parte media y inferior muestran las tramas raster de los picos y los histogramas de probabilidad de la punta (la probabilidad media se muestra en rojo). Los gráficos más altos muestran gráficas de la señal LFP promedio que aumentaron en potencia duranteHt en paralelo con el disparo altamente sincronizado de la célula fotovoltaica bloqueada en fase hasta el pico de la oscilación LFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

SOLUCIÓN DE SUCROSE (1X) PARA HIPOCAMPO AISLADO
(Solución de reserva)
Compuesto	MW	Conc. Final. (MM)	Cantidad para 1 L (g)
Sacarosa	342,3	252	86,26 g
NaHCO $ ₃ $	84,01	24	2,020 g
glucosa	180,2	10
KCl	74,55	3	0,223 g
MgSO _ { 4}	120,4	2	0,241 g
NaH _ { 2} PO _ { 4}	120	1,25	0,150 g
CaCl $ ₂ $ .2H2O [1 M]	147	1.2	120 mu l / 0,1 l *
* Añadir 360 μL de CaCl 2 [1 M] para 0,3 L de solución de sacarosa oxigenada
		PH = 7,4 cuando se oxigenó, Osm 310 - 320

Tabla 1.

SOLUCIÓN ESTÁNDAR ACSF (5X) PARA LA PERFUSIÓN
(Solución de reserva)
Compuesto	MW	Conc. Final. (MM)	Cantidad para 2 L 5X
NaCl	58,44	126	73,6
NaHCO $ ₃ $	84,01	24	20,2
glucosa	180,2	10	18
KCl	74,55	4	3.355
MgSO _ { 4}	120,4	2	2,41
NaH _ { 2} PO _ { 4}	120	1,25	1,5
Ascorbato	176.1	0,4	0,705
CaCl $ ₂ $ .2H2O [1 M]	147	2	2 ml / L *
* Añadir 2 ml de CaCl 2 [1 M] para 1 L aCSF (1x) solución oxigenada
		PH = 7,4 cuando se oxigenó, Osm 310 - 320
♦ Para esta solución de aCSF se usa un K [ + ] o [K + ] o KC ligeramente elevado para aumentar la excitabilidad de las redes del hipocampo y facilitar la aparición de oscilaciones de theta.

Tabla 2.

Los autores no declaran ningún interés comercial o financiero competitivo.