Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR

Summary

La capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en los tejidos de la Drosophila es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo. Aquí está la descripción de un sencillo procedimiento para disecar alas pupas. Estas alas pueden utilizarse como muestras en diversas técnicas (análisis de PCR, immunohistochemistry, etc.).

Abstract

Desarrollo del ala de Drosophila melanogaster es un modelo ideal para el estudio de morfogénesis a nivel de tejido. Estos Apéndices se convierten de un grupo de células llamado discos imaginal de ala formados durante el desarrollo embrionario. En las etapas larvales los discos imaginales crecen, aumentando su número de células y la formación de estructuras epiteliales monolayered. Dentro de la envoltura pupal, los discos imaginales bud hacia fuera y doblan en bicapas a lo largo de una línea que se convierte en el futuro margen de la ala. Durante este proceso, las venas longitudinales primodia originan células de vena sobre las posibles superficies dorsales y ventrales del ala. Durante la etapa de pupa las rayas de las células de la vena de cada superficie de comunican para generar tubos apretados; al mismo tiempo, las venas Cruz comienzan su formación.

Con la ayuda de marcadores moleculares adecuados, es posible identificar los elementos principales que componen el ala durante su desarrollo. Por esta razón, la capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en esta estructura es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo del ala.

El procedimiento descrito aquí se centra en manipular alas pupas, proporcionando instrucciones detalladas sobre cómo diseccionar el ala durante la etapa pupal. La disección de tejidos pupal es más difícil de realizar que sus contrapartes en larvas de tercer estadio. Por esta razón este enfoque fue desarrollado, para obtener muestras de alta calidad rápida y eficiente. Detalles de cómo immunostain y Monte estas muestras de ala, para permitir la visualización de proteínas o componentes de la célula, se encuentran en el protocolo. Con experiencia es posible recoger alas pupal de 8-10 alta calidad en un corto período de tiempo.

Introduction

Las alas de Drosophila se desarrollan desde los discos imaginal de ala. Primordial de estos discos de ala se ponen a un lado durante el desarrollo embrionario como pequeños grupos de 20-30 células imaginales que invaginate del epitelio embrionario. Mientras que la larva crece en la tercera etapa del estadio, mitosis se produce en las células imaginales en momentos característicos específicos elevando su número (aproximadamente 50000 células) y formando el ala disco^{1,2,3, 4}. Como las células proliferan, forme un epitelio tubular, re....

Protocol

Día 1

1. colección y cultivo pupas.

1. Saque 0 h después de la formación del pupario (APF) o prepupas con un pincel mojado de cultivados frascos y colocarlos en frascos nuevos para casi completar el período de desarrollo (ver 2.1 y 2.2).
   Nota: Debe mantenerse una sana población de moscas utilizando protocolos estándar de cultivo. Después de tres o cuatro días en los que se colocan los huevos, los adultos pueden extraerse viales para permitir un desarrollo óptimo de los individuos. Ellos se mantienen a una temperatura constante hasta que las larvas de tercer estadio inician la pupación. La transición de larvas/pu....

Results

El protocolo ofrece un método sencillo para la obtención de muestras ala pupa que conservan la morfología familiar del ala. De estas preparaciones es posible obtener montones de imágenes que podrían proyectarse como 2-D o 3-d, para investigar la distribución y el enriquecimiento de proteínas durante la diferenciación del ala. Un protocolo similar (véase la nota de 2,9) puede utilizarse para recolectar la muestra ala pupa grande (con 50-80 pupa alas) necesaria para sintetizar ácido desoxir.......

Discussion

El método de disección se describe en este vídeo puede utilizarse para preparar muestras de alta calidad de alas pupas de Drosophila de diversas etapas del desarrollo de muchos tipos de técnicas (por ejemplo, la inmunofluorescencia, la síntesis de cDNA para análisis PCR, in vitro desarrollo del ala). En este método el científico involucrados han utilizado 24-30 h APF. Sin embargo debe haber ningún obstáculo dentro de los pasos esenciales en la disección de pupa más joven o más viejo. Cambios p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio estereoscópico con iluminación de luz fría	Nikon
Plataforma mecedora	Biometra (WT 16)	042-500
Portaobjetos de microscopio	StarFrost	8037/1
Cubreobjetos (24 x 32 mm)	Pinzas de	D102432
	F.S.T	11252-00
Tijeras	Lawton	63-1400
Plato de plástico multipocillo	Thermo Scientific	144444
pipeta p100 o p200	Finnpipette (Labsystems)	9400130
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
4% paraformaldehído	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
TRIzol Reactivo	Ambion	15596026
DEPC agua tratada	MO. BIO	17011-200
Alexa Fluor 546 cabra anti-ratón IgG (H+L), 2 mg/mL (dilución de trabajo 1/800)	Invitrogen	A11030
Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μ g/mL (dilución de trabajo 1/100)	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB)		Por Isabel Gerrero del DSHB bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Ciencias Biológicas, Iowa City, IA 52242.
DAPI, 1 mg/mL (dilución de trabajo 1/5000)	Invitrogen	62248
Faloidina conjugada con Alexa 488, 300 U/1.5 mL de metanol (dilución de trabajo 1/600)	Invitrogen	A12379
Canton S (stock de moscas)	Bloomington Drosophila Stock Center