Artículo de método

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

DOI:

10.3791/55869

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27 de julio de 2017

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos una bicapa lipídica soportada en el contexto de una plataforma microfluídica para estudiar las interacciones proteína-fosfoinositido utilizando un método libre de etiquetas basado en la modulación del pH.

Resumen

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Numerosas proteínas celulares interactúan con las superficies de la membrana para afectar los procesos celulares esenciales. Estas interacciones pueden dirigirse hacia un componente lipídico específico dentro de una membrana, como en el caso de fosfoinositidos (PIP), para asegurar una localización y / o activación subcelular específica. Los PIP y los dominios celulares de unión a PIP se han estudiado ampliamente para comprender mejor su papel en la fisiología celular. Se aplicó un ensayo de modulación del pH en bicapas lipídicas (SLB) como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-PIP. En estos estudios, se usó fosfatidiletanolamina conjugada con orto- sulforeamina B sensible al pH para detectar interacciones proteína-PIP. Tras la unión de una proteína a una superficie de membrana que contiene PIP, se modula el potencial interfacial ( es decir, cambio en el pH local), desplazando el estado de protonación de la sonda. Se presenta un estudio de caso del uso exitoso del ensayo de modulación del pH usando fosfolipasa C delta1 Pleckstren la homología (PH PLC-δ1) dominio y fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) la interacción como un ejemplo. La aparente constante de disociación ( K d, app ) para esta interacción fue 0,39 ± 0,05 μ M, similar a K d, app valores obtenidos por otros. Como se observó anteriormente, el dominio PH PLC-δ1 es PI (4,5) P 2 específico, muestra unión más débil hacia fosfatidilinositol 4-fosfato, y no se une a SLB de fosfatidilcolina pura. El ensayo de PIP sobre un chip es ventajoso con respecto a los ensayos de unión a PIP tradicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, bajo volumen de muestra y sin requisitos de marcado de ligando / receptor, la capacidad de probar interacciones de membrana de alta y baja afinidad con Grandes moléculas, y una relación señal / ruido mejorada. En consecuencia, el uso del enfoque PIP-on-a-chip facilitará la elucidación de mecanismos de una amplia gama de interacciones de membrana. Además, este método podría ser uEn la identificación de terapéuticos que modulan la capacidad de la proteína para interactuar con las membranas.

Introducción

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Las innumerables interacciones y procesos bioquímicos tienen lugar en superficies de membrana fluidas bidimensionales. Los organelos cerrados con membrana en células eucariotas son únicos no sólo en los procesos bioquímicos y su proteoma asociado, sino también en su composición lipídica. Una clase excepcional de fosfolípidos es phosphoinositides (PIPs). Aunque constituyen sólo el 1% del lipidoma celular, desempeñan un papel crucial en la transducción de señales, autofagia y tráfico de membranas, entre otros 1 , 2 , 3 , 4 . La fosforilación ....

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Protocolo

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1. Limpieza de los cubreobjetos de vidrio

  1. Solución diluida de limpieza 7x (ver Tabla de Materiales) 7 veces con agua desionizada en un recipiente de vidrio de borosilicato de profundidad 100 mm con un fondo plano y calentar hasta 95 ° C sobre una placa caliente nivel durante 20 min o hasta que la solución turbia se vuelve clara .
    NOTA: La solución estará caliente, tenga cuidado para evitar lesiones corporales. La Solución de Limpieza 7x es una mezcla patentada de hexafluorofosfato de hexasodio [oxido (fosfonatooxi) fosforil] oxifosforil], 2- (2-butoxietoxi) etanol, 1,4-bis (2-etilhexoxi) -1,4-dioxobutano -2-sulfonato y adiciones no pe....

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Resultados

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Se utilizó el ensayo de modulación del pH para estudiar la PLC-δ1 dominio PH-PI (4,5) P 2 interacción dentro de un PIP-on-a-chip microdevice ( Figura 1 ]. A través de un protocolo detallado, hemos demostrado cómo preparar y ensamblar los componentes del dispositivo microfluídico, hacer pequeñas vesículas unilamelares (SUVs) ( Figura 2 ), forma SLBs dentro de un dispositivo ( Figura 3 ], y.......

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Discusión

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Cada variante PIP, aunque a bajas concentraciones, está presente en la superficie citosólica de organelos específicos donde contribuyen al establecimiento de una composición física única y especificidad funcional de la membrana organelar 1 . Uno de los usos más importantes de los PIPs es como una plataforma de acoplamiento específica para la multitud de proteínas que requieren localización subcelular específica y / o la activación [ 6 , 7]

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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DS y CEC fueron apoyados, en parte, por la concesión AI053531 (NIAID, NIH); SS y PSC fueron apoyados por la subvención N00014-14-1-0792 (ONR).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
fuerte
vidrio resistente: RectángulosFisher Scientific12-544B22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, n.º 1 1/2; Vidrio de borosilicato
7X Solución de limpiezaMP Biomedicals976670Detergente
PYREX Plato cristalizanteCorning3140-190Plato de vidrio de borosilicato con fondo plano; Diámetro x Altura (190 x 100 mm); Distribuidor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2Horno
NombreCompanyNúmero de catálogoComments
PDMS
elastómeros de siliconaDow Corning4019862Polidimetilsiloxano (PDMS); Distribuidor: Ellsworth Adhesives
PYREX DeseccatorVWR89134-402
Punzón de biopsiaHarris15110-10Harris Uni-Core; 1,0 mm de diámetro; Punzón de biopsia Miltex con émbolo (Cat. Nº 15110-10) se puede utilizar como alternativa
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DispositivoSistema de limpieza de
PlasmaEtchPE25-JW, Servicio de O2 (Krytox Charged)
Placa calefactora digitalBenchmarkH3760-HComprado a través de Denville Scientific (Cat. Nº 1005640)
Microportaobjetos esmeriladosVWR48312-003esmerilados, seleccionados y prelimpios; Hecho de vidrio suizo; Grosor: 1 mm; Dimensiones: 75 x 25 mm; GR 144
NombreCompañíaNúmero de catálogoComentarios
Mold
AutoCADAutodeskv.2016Software de dibujo para el diseño de fotomáscaras
PhotomaskCAD/Art ServicesN/AEl diseño con fondo negro y características claras se imprimió con una resolución de 20k ppp en una máscara transparente (5 x 7 pulgadas) por CAD/Art
Services Obleas de siliconaUniversity Wafer1575Grade, pulido por un solo lado; 100 mm (4 pulgadas) de diámetro; 525 mmm de espesor
SU-8 50MicroChem Corp.N/Atono negativo fotorresistente; Instalación de nanofabricación de Penn State Propiedad
SU-8 Desarrollador: MicroChem Corp.N/APenn State Nanofabrication Facility Propiedad
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
SUV
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolinaAvanti Lípidos Polares850457CPOPC
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4-fosfatoAvanti Lípidos Polares840045XPI4P
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfatoAvanti Lípidos Polares840046XPI(4,5)P2
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminaAvanti Lípidos Polares850757CPOPE; Necesario para la síntesis de oSRB-POPE
Lissamina Cloruro de rodamina B sulfonilo (isómeros mixtos)ThermoFisher ScientificL-20Necesario para la síntesis de oSRB-POPE
Sonda lipídica fluorescente sensible al pH (oSRB-POPE)internade N/A(Huang D. et al. 2013)
Vial de centelleo de vidrioVWR66022-065 Capacidad devolumen de 20 ml
Aquasonic 250DVWRN/AMEMBRANAS ULTRASÓNICAS DE GRABADO
HUELLAS DE NUCLEPOROSmembrana110605; Diámetro: 25 mm; Tamaño de poro: 0,1 mmm; Distribuidor: Sigma-Aldrich
ChloroformVWRCX1054-6Extrusora LIPEX de grado HPLC
Transferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL Extrusora de termobarril
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN/ADispersión dinámica de la luz; Instalación de cristalografía de rayos X de Penn State Propiedad
NombreEmpresa>Número de catálogoComentarios
>Análisis de datos
GraphPad PrismaSoftware GraphPadv.6Software de ajuste de curvas para el análisis de datos
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
Microscopio
Axiovert 200MMicroscopio Carl Zeiss MicroscopíaN/A
Cámara AxioCam MRmCarl Zeiss Microscopía Carl ZeissN/ACámara
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/AFuente de luz
Alexa 568 Juego de filtrosCarl Zeiss MicroscopíaN/AEx/Em 576/603 nm
Software AxioVision LE64 v.4.9.1.0Carl Zeiss MicroscopíaN/ASoftware de procesamiento
de imágenesNameCompany Número de catálogoComentarios
Otros fuertes
200 uL; Punta fina y lisa para aplicar la solución de proteínas en el canal microfluídico
PuntasVWR53509-070Puntas de pipeta de 10 uL; Punta fina y lisa para aplicar la solución de vesícula en el canal microfluídico
Medidor de pH Orion Star A321Thermo ScientificSTARA3210Sonda
pH Orion Micro sonda de pH ThermoScientific8220BNWP
N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico)VWRVWRB30487 HEPES,
cloruro de sodioVWRBDH8014-2.5KGRde NaCl
Alambre Aliado & CableTFT-200-24 NDiámetro interno: 0,020-0,026 pulgadas (0,051-0,066 cm); Espesor de la pared: 0,010 pulgadas (0,025 cm); Tubo flexible de pared delgada de politetrafluoroetileno; Color Natural
Nitrógeno Gaso -Industrial PraxairN/AProveedor Local
Oxígeno Gaso - IndustrialPraxairN/AProveedor Local
Nitrógeno LíquidoPraxairN/AProveedor Local
Sylgard 184 Kit de con clasificación al vacío plasma Bomba de vacío de aceite de accionamiento directo de 2 etapas Prime Síntesis interna CON de policarbonato Whatman VWR 10034-132 Puntas de pipeta de Medidor de pH de ácido libre Tubería

Referencias

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  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., ....

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Etiquetas

Ensayo de PIP en chipbicapas lip dicas soportadasensayo de modulaci n de pHdominio PH de la fosfolipasa Cfosfatidilinositol 45 bisfosfatofabricaci n de dispositivos microflu dicosves culas unilamelares peque asmedici n de la intensidad de fluorescenciaconstante de disociaci n aparente

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