Aquí, describimos la aplicación de la recuperación de fluorescencia tridimensional después de fotoblanqueo (3D-FRAP) para el análisis de la separación gap dependiente de la transferencia de miARN. En contraste con los métodos comúnmente aplicados, 3D-FRAP permite la cuantificación de la transferencia intercelular de ARN pequeños en tiempo real, con alta resolución espacio-temporal.
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Artículo de método
Análisis de la transferencia dependiente de la unión Gap de miARN con 3D-FRAP Microscopía
En este artículo
Resumen
Resumen
Pequeños ARNs antisentido, como el miARN y el siRNA, juegan un papel importante en la fisiología y patología celular y, además, pueden ser utilizados como agentes terapéuticos en el tratamiento de varias enfermedades. El desarrollo de nuevas e innovadoras estrategias para miARN / siRNA terapia se basa en un amplio conocimiento de los mecanismos subyacentes. Los datos recientes sugieren que los ARN pequeños se intercambian entre las células en una forma dependiente de la unión de vacíos, induciendo así los efectos reguladores de los genes en la célula receptora. Las técnicas biológicas moleculares y el análisis de citometría de flujo se usan comúnmente para estudiar el intercambio intercelular de miARN. Sin embargo, estos métodos no proporcionan una alta resolución temporal, que es necesaria cuando se estudia el flujo de juntura de las moléculas. Por lo tanto, para investigar el impacto de miARN / siRNA como moléculas de señalización intercelular, se necesitan nuevas herramientas que permitan el análisis de estos ARN pequeños a nivel celular. El presente protocolo describe el apPlication de la recuperación tridimensional de la fluorescencia después de la microscopía del photobleaching (3D-FRAP) para aclarar el intercambio dependiente de la conexión de la separación de moléculas del miRNA entre las células cardíacas. Es importante destacar que este enfoque directo y no invasivo de imágenes de células vivas permite la visualización y cuantificación de la separación gapcaling de pequeños RNA marcados fluorescentemente en tiempo real, con alta resolución espacio-temporal. Los datos obtenidos por 3D-FRAP confirman una nueva vía de regulación de genes intercelulares, donde los ARN pequeños actúan como moléculas de señalización dentro de la red intercelular.
Introducción
Los pequeños ARN no codificantes son actores importantes en la regulación de genes celulares. Estas moléculas están compuestas de 20-25 nucleótidos que se unen a un ARNm diana específico, lo que conduce al bloqueo de la traducción oa la degradación del mRNA 1 , 2 . El proceso de regulación de genes llevado a cabo por pequeños ARNs, como miARN y siRNA, es un mecanismo altamente conservado que se ha encontrado en muchas especies diferentes [ 3] . En particular, las moléculas de miARN son de crucial importancia para una variedad de procesos fisiológicos, incluyendo la proliferación, difer....
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Protocolo
Todos los pasos en este protocolo que implican ratones neonatal fueron realizados por las pautas éticas para el cuidado animal del centro médico de la universidad de Rostock.
1. Preparación de platos de cultivo celular y el medio para cultivo de cardiomiocitos
- Recubrir una placa de cultivo celular con 0,1% de gelatina en PBS e incubar a 37 ° C durante 4 h oa 4 ° C durante la noche. Retire la gelatina y deje que se seque bajo flujo de aire laminar estéril.
- Preparar el medio de cultivo celular compuesto de 50 ml de DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Precale....
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Resultados
Aquí, presentamos la microscopía 3D-FRAP como una técnica no invasiva para estudiar la separación gapcaling de miRNA fluorescente dentro de los cardiomiocitos neonatales. Los cardiomiocitos aislados revelaron el típico patrón estriado de α-actinina y contenían grandes placas de Cx43 a lo largo de los bordes celulares ( Figura 1A , puntas de flecha blancas), lo que permitía el alto flujo intercelular de moléculas. La pureza de los cardiomiocitos aislados se e.......
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Discusión
MiRNAs son actores clave en la fisiología celular y se demostró que actúan como moléculas de señalización utilizando-entre otros-GJs como una vía para el intercambio intercelular [ 11 , 12 , 22] . El protocolo actual presenta una técnica de imágenes de células vivas in vitro para caracterizar este desplazamiento dependiente de GJ utilizando miRNAs fluorescentes dentro de grupos de células.
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Divulgaciones
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo del Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania (FKZ 0312138A y FKZ 316159), del Estado de Mecklemburgo-Pomerania Occidental con los Fondos Estructurales de la UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 y FSE / IVBM-B35-0010 / 12), el DFG (DA1296-1) y la Fundación Alemana del Corazón (F / 01/12). Además, RD cuenta con el apoyo del Programa FORUN del Centro Médico de la Universidad de Rostock (889001), la Fundación DAMP y el BMBF (VIP + 00240).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ratones neonatos NMRI | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | solución al 0,1% en PBS, |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´ s medio modificado | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific 15140122 | 100 U/mL, 100µ g/mL | |
| Suero fetal bovino | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Plástico para cultivo celular | TPP | ||
| Kit de aislamiento de cardiomiocitos primarios | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | incluido en el kit de aislamiento de cardiomiocitos primarios |
| Azul de tripano | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 microRNA etiquetado Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | se disuelve en agua libre de ARNasa, solución madre 20 y micro; M |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma S3139 | ||
| Fosfato de sodio dibásico | Carl Roth | T877.2 | |
| Cloruro de potasio | Sigma | P9333 | |
| Cloruro de magnesio | Serva | 28305.01 | |
| Succinato de sodio | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Solución de tripsina/EDTA | Merck | L2153 | |
| 4 pocillos- Portaobjetos de cámara con fondo de vidrio | IBIDI | 80827 | recubierto con solución de gelatina al 0,1% |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | programa G-009 para Electroporación | |
| LSM 780 Sistema ELYRA PS.1 | Zeiss | ||
| Excel Microsoft | |||
| α-anticuerpo de actinina | Abcam | ab9465 | dilución 1:200 |
| Connexin43 anticuerpo | Santa Cruz | sc-9059 | dilución 1:200 |
| anti-ratón de cabra Alexa 594 anticuerpo | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilución 1:300 |
| anti-conejo para cabras Alexa 488 anticuerpo | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilución 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | concentración final 250 nM |
| Kit de tinción de células vivas/muertas en infrarrojo cercano | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Rojo-Naranja | Thermo Scientific | C34851 | |
| Tinción nuclear DAPI | Termo Científico | D1306 |
Referencias
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature
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Reimpresiones y permisos
