Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino

George Zhang; Yudan Chi; Yi-Chieh Nancy Du

doi:10.3791/55890

Artículo de método

Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino

DOI:

10.3791/55890

⸱

16 de octubre de 2017

George Zhang¹ , Yudan Chi¹ , Yi-Chieh Nancy Du¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medicine

En este artículo

Resumen

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Presentamos un protocolo para demostrar un sistema de transferencia génica somática novela utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo de ratón para estudiar la función de genes en la metástasis. El retrovirus aviares se entregan intracardiacally para asegurar la transferencia de genes en las lesiones premalignas, no invasivas de las células β pancreáticas en ratones adultos.

Resumen

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Cáncer metastásico representa el 90% de las muertes en pacientes con tumores sólidos. Hay una necesidad urgente de entender mejor las causas de la metástasis del cáncer e identificar nuevas dianas terapéuticas. Para investigar los eventos moleculares que conducen a la progresión de cáncer primario a metástasis, hemos desarrollado un modelo de ratón de Alfredo, RIP-Tag; RIP-tva. En este modelo de ratón, el promotor de la insulina de rata (RIP) conduce la expresión del antígeno T de SV40 (Tag) y el receptor para el subgrupo un virus de la leucosis aviar (tva) en las células β pancreáticas. Los ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos con penetrancia de 100% a través de etapas bien definidas que son similares a la tumorigénesis humana, con etapas incluyendo hiperplasia, angiogénesis, adenoma y carcinoma invasor. Porque RIP-Tag; RIP-tva ratones no desarrollan enfermedad metastásica, alteraciones genéticas que promueven la metástasis pueden ser identificados fácilmente. Transferencia génica somática en tva-expresar, proliferando β pancreática las lesiones premalignas se logra a través de la inyección intracardiaca de retrovirus aviares que la alteración genética deseada. Un título de > 1 x 10⁸ unidades infecciosas por ml se considera apropiado para la infección en vivo . Además, retrovirus aviares pueden infectar líneas celulares derivadas de tumores en RIP-Tag; RIP-tva ratones con alta eficiencia. Las líneas celulares también pueden utilizarse para caracterizar los factores metastáticos. Aquí se demuestra cómo utilizar este modelo de ratón y líneas para evaluar las funciones de genes candidatos en metástasis de tumor de la célula.

Introducción

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Mayoría de los cánceres se deben a mutaciones somáticas ¹. Modelos de ratón modificados genéticamente convencional (GEMM) han proporcionado penetraciones importantes en la contribución de las alteraciones genéticas específicas en tumorigenesis ². Sin embargo, tienen varias limitaciones. El mayor inconveniente de estos modelos es que no replican la naturaleza esporádica de la formación de tumores en seres humanos, en el que sólo algunas células en un tejido adquirirán alteraciones genéticas. Las mutaciones en ratones transgénicos y knockout son germinales con potencial de afectar el desarrollo. Por otra parte, generar est....

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Protocolo

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declaración de ética: experimentos en animales se realizaron conforme a los lineamientos y regulaciones establecidas por el Instituto de cuidado Animal y el Comité uso de Weill Cornell medicina.

1. elección de vectores retrovirales aviar (basada en RCASBP A o RCANBP(A)-based)

vectores fue derivado de Rous sarcoma virus ¹¹. Vectores retrovirales aviares pueden entregar cADN (≤ 2,5 kb), short hairpin RNAs (shRNAs), microRNAs (miRNAs) y otros RNAs noncoding. Los vectores comercialmente disponibles se enumeran en materiales y otros que deba solicitarse direct....

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Resultados

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La tasa de infección en vivo y en vitro de RIP-Tag; RIP-tva las células del tumor por los virus de RCASBP ~ 20% y el ~ 80% respectivamente son ²⁰. En la etiqueta de RIP ; RIP-tva modelo del ratón, aproximadamente 4% de los islotes pancreáticos 400 en cada ratón naturalmente se convertirán en tumores ²⁰; por lo tanto hay una cantidad suficiente de células del tumor en cada ratón para análisis histológico y .......

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Discusión

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En este estudio, hemos descrito un modelo de ratón poderoso, RIP-Tag; RIP-tva, lograr el parto génica somática mediante retrovirus aviares para la identificación y caracterización de factores metastáticos. Aunque RIP-Tag; RIP-tva ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos, metástasis factores identificados en este modelo de ratón también pueden promover la metástasis de otros tipos de cáncer.

Nuestro enfoque tiene la ventaja de introducir cambios genéticos somát.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong y Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. es apoyado por subvenciones de DOD W81XWH-16-1-0619 y NIH grant 1R01CA204916.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo
Plásmido RCASBP-Y DV	Addgene	11478
Plásmido RCAS-RNAi	Addgene	15182
DMEM	Corning	10-013-CV
suero fetal bovino	Atlanta Biologicals	25-005-CI
L-glutamina, 100x	Corning	25-005-CI
Solución de penicilina-estreptomicina, 100x	Corning	30-002-CI
PBS^-/-, 1x	Corning	21-040-CV
Superfect	Qiagen	301305
Tubo de centrífuga de polialómero	Beckman Coulter	326823
0,45 mm Nalgene Filtros con membrana PES Jeringas	Thermo Scientific	194-2545
	BD
sinaptofisina	Vector Laboratories	VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidasa, IgG de conejo)	Vector Laboratories	PK-6101
ADN polimerasa AmpliTaq con tampón II	Life Technologies	N8080153
MyTaq ADN polimerasa	Bioline	BIO-21106

de insulina 329461

Referencias

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Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
Khanna, C., Hunter, K.

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