Artículo de método

Tomografía de coherencia óptica ultraalta resolución ratón para facilitar la inyección Intraocular en investigación de retina la terapia génica

DOI:

10.3791/55894

⸱

2 de noviembre de 2018

 , 
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

En este artículo

Resumen

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Aquí nos muestran un nuevo enfoque al uso de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral de alta resolución (HR-SD-OCT) para facilitar la presentación de los agentes de terapia génica en el espacio subretinal, evaluar su cobertura areal y caracterizan la vitalidad del fotorreceptor.

Resumen

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HR-SD-OCT se utiliza para monitorizar la progresión de la degeneración de fotorreceptores en modelos de ratón vivo, evaluar la prestación de agentes terapéuticos en el espacio subretinal y para evaluar la toxicidad y la eficacia en vivo. HR-SD-OCT utiliza cerca de luz infrarroja (800-880 nm) y tiene óptica específicamente diseñado para la única óptica del ojo de ratón con una resolución axial de sub-2 micrones. Fueron imágenes de modelos de ratón transgénico de degeneración retiniana externa (fotorreceptor) y controles para evaluar la progresión de la enfermedad. Vidrio tirado microneedles fueron utilizados para entregar inyecciones retiniana sub de virus adeno-asociado (AAV) o nanopartículas (NP) a través de un enfoque trans-escleral y trans-coroides. Cuidadosa colocación de la aguja en el espacio subretinal fue requerida antes de una inyección de presión calibrada, que entrega el líquido en el espacio retiniano sub. Se realizó cirugía subretinal en tiempo real en nuestra retina imágenes de sistema (RIS). HR-SD-OCT demostró degeneración progresiva de retina uniforme debido a la expresión de una tóxico rodopsina mutante humana mutante (P347S) (RHOP347S) transgénica en ratones. HR-SD-OCT permite cuantificación rigurosa de todas las capas retinianas. Capa nuclear externa (ONL) grueso y fotorreceptores segmento externo (OSL) las mediciones de longitud se correlacionan con la vitalidad del fotorreceptor, degeneración o rescate. El sistema RIS permite la visualización en tiempo real de inyección subretinal en neonatal (~ P10-14) o ratones adultos, HR-SD-OCT inmediatamente determina el éxito de la entrega y mapas de extensión areal. HR-SD-OCT es una herramienta poderosa que puede evaluar el éxito de la cirugía subretinal en ratones, además para medir la vitalidad de fotorreceptores en vivo. HR-SD-OCT puede utilizarse también para identificar cohortes animal uniforme para evaluar el grado de degeneración retiniana, toxicidad y rescate terapéutico en estudios de investigación de terapia génica preclínica.

Introducción

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Los investigadores están desarrollando terapias genéticas para una variedad de enfermedades degenerativas retinianas y retinales con la esperanza de traducir novela terapéutica en tratamientos para la enfermedad humana1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. dominio del tiempo o la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) se ha utilizado para investigar los aspectos de la degeneración retiniana externa en modelos de ratón específicos de enfermedad12,13,14 . HR-SD-OCT sin embargo, no ha sido ampliamente utilizado en el contexto de optimización de la evaluación de modelos de ratón para determinar la velocidad y uniformidad espacial de degeneración retiniana, o en el contexto de la evaluación preclínica de gene base terapéutica, por ejemplo, a evaluar el rescate, la toxicidad o la extensión espacial del vector entrega8,15,16. Una vez que un modelo de ratón es caracterizado completamente, los datos de HR-SD-OCT pueden servir como recurso informativo y confiable para medir el impacto de la terapéutica para ejercer el rescate o toxicidad en modelos de ratón de la degeneración retiniana17. Muchos grupos utilizan inyección subretinal como un método de entrega de vectores debido a su eficiencia en la transducción de fotorreceptores y células del epitelio (RPE) del pigmento retiniano. Sin embargo, esto sigue siendo un método difícil de dominar, dado que normalmente se hace por cirugía de la mano libre de la superficie corneal y a menudo está llena de cataratas, hemorragias y desprendimientos de retina no deseados que ocurren simplemente por la manipulación de la parte posterior vítrea. Muchos grupos todavía intentar subretinales inyecciones ciegas y entregan el virus usando inyecciones manuales con diámetro relativamente grande acero inoxidable agujas (34G)8,17,18,19 ,20,21,22y tomografía de coherencia óptica utiliza unos (OCT) la proyección de imagen para confirmar la correcta entrega de vector a la retina8,17, 20 , 22. algunas mejoras en el método se han descrito recientemente con agujas de microescala impulsadas por un micromanipulador22.

Presentamos un enfoque integrado que ayuda en la colocación de la aguja, y las inyecciones son facilitadas por un oftalmoscopio estéreo dirigido personalizado diseñado en el laboratorio para visualizar dentro del pequeño ojo de ratón17, 23. el uso de agujas micro vidrio tirado junto con el micromanipulador estereotáxicas proporcionan mejor control de la colocación de la aguja con ningún corte quirúrgico requerido (es decir, a través de conjuntiva y tejido conectivo) antes inyección. Inyector micro ayuda a entregar volúmenes de inyección constante de regular el uso de la presión y la inyección se puede hacer con mayor estabilidad, precisión y mucho más lenta que las inyecciones manual realizadas por una jeringa de mano, lo que disminuye la ocurrencia de inyección de burbuja en el ojo. La aguja más pequeña ayuda a prevenir fugas después del retiro de la aguja porque la ruta es autosellante. Para evaluar el grado de inyección/entrega, muchos grupos de investigación dependen de encontrar y evaluar la extensión areal de expresión de la proteína (EGFP) de mayor fluorescencia verde en la retina (construcción de la expresión por el vector) en el extremo experimental punto (eutanasia) para confirmar éxito inyecciones11,19,20,24. Este enfoque (no utilizando OCT) para verificar el éxito quirúrgico desperdicia una enorme cantidad de recursos en tiempo de procedimiento quirúrgico y los animales, ya que todos los animales con fracasos quirúrgicos (desconocidos) necesitan mantenimiento, con medidas repetitivas hasta eutanasia y el ojo de la cosecha (cuando se mide la EGFP). Confirmación de la localización de la inyección en la retina puede mejorarse usando HR-SD-OCT para demostrar que la inyección se encuentra entre las capas correcto de la retina (es decir, el espacio subretinal). HR-SD-OCT puede utilizarse también para delinear inmediatamente intentos (fracasos quirúrgicos) para identificar las variables relevantes en tiempo real quirúrgico para mejorar el enfoque. Encontramos que HR-SD-OCT proporciona numerosas ventajas en preclínica gene estudios de terapia permitiendo rápida evaluación cuantitativa de la degeneración retiniana externa, que permite la identificación/sacrificio de los animales de estudio que no cumplen criterios experimentales ( por ejemplo, inyección subretinal incorrecta) y a dirigir la proyección de imagen de seguimiento a la región del ojo donde vector fue entregado (donde es más probable el efecto preclínico) como controlar regiones donde vector no fue entregado. Desde su desarrollo, el uso de la SD-OCT ha continuado ser aceptada y utilizada por los investigadores de Oftalmología y ahora se considera el estándar de la proyección de imagen retiniana en retinales estudios científicos en ratón o roedor modelos13,25. HR-SD-OCT y sus capacidades de software fueron utilizados en formas únicas integradas a la meta éxito cuantitativo de terapia del gene en modelos de ratón en cada paso en el proceso, incluyendo la selección del modelo animal, caracterización de la degeneración en elegido modelos de la enfermedad, terapéutica entrega, asignación de vectores de entrega y evaluación de toxicidad/eficacia. El uso de recursos humanos-SD-OCT permite el descubrimiento de fármacos más eficiente en todos los niveles del proceso. Aquí describimos los enfoques que se utilizan en nuestro programa de descubrimiento de fármacos ARN.

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Protocolo

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Protocolos animales fueron revisados y aprobados por institucional Animal Care y comités de uso de la HCS de por qué VA y de la Universidad SUNY Buffalo. Los animales fueron utilizados según las estipulaciones de la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología (ARVO) y la declaración de Helsinki.

1. modelos de ratón

  1. Identificar modelos de ratón para ser evaluada incluyendo los controles.
    Nota: Proyección de imagen fue realizada para un C57BL/6(J), hC1 y hC1/mWT mWT, un modelo de degeneración retiniana parcialmente humanizado de ratón homocigótico para humano RHOP347S hC1 alelos del mutante en el tipo salvaje (WT) ratón RHO+ + genotipo26 , 27, hC1 x BL/6(J), un modelo parcialmente humanizado con una sola copia del alelo del mutante humano RHOP347S hC1 en el ratón WT RHO+ + genotipo (hC1 /-/ / mWT/mWT) (obtenido mediante el cruce de hC1 y hC1/mWT/mWT con (C57BL/6 Ratones de J)). El por encima de un autosoma dominante retinosis pigmentaria (adRP) modelos son en el fondo C57BL/6(J). Un modelo de ratón que es homocigótico para dos copias del gene humano de WT RHO en el ratón fondo de nocaut de RHO fue también usado28,29. Esta línea está en el fondo 129Sv. Cuando esta línea fue cruzada con un nocaut de RHO del ratón en el fondo 129Sv, una sola dosis de humana RHO se produce en el ratón fondo de RHO .
  2. Mantener los animales siguiendo las condiciones pertinentes para el diseño experimental.
    Nota: Los animales fueron mantenidos en la unidad médica veterinaria (VMU) en el HCS de por qué VA. Ratones fueron alimentados con estándar lab chow y crecido h:12 menores de 12 h luz: ciclos oscuros con suave cabeza fluorescente blanco luces con aproximadamente 300 lux al nivel de la jaula en aproximadamente 72 ° f.

2. ratón Eye Gel

  1. Preparar el gel óptico utilizado para la proyección de imagen retiniana30 y procedimientos quirúrgicos.
  2. Combinar 2 mg/mL w/v alto peso molecular (4 x 106 g/mol carbomer en estéril 1 x de tampón de fosfato salino (PBS).
  3. Mezcla a temperatura ambiente hasta que el gel forma un gel viscoso ópticamente transparente.
  4. Transferir el gel a pequeñas botellas estériles y centrifugar en una centrífuga de mesa cubo oscilante x 350 g para eliminar burbujas de aire atrapado.
  5. Aplique el gel directamente sobre la córnea para crear una interfaz entre la córnea de ratón y un vidrio de cobertura premium (18 mm x 18 mm).

3. recursos humanos-SD-OCT la proyección de imagen

  1. Vea el dispositivo HR-SD-OCT (figura 1).
  2. Pesar al animal para determinar la dosis adecuada de anestesia. Después de anestesiar el ratón utilizando 25 μl/g de peso de la solución de 2.5% de tampón 2,2,2-tribromoethyl alcohol (Avertin) solución vía inyección intraperitoneal (IP) y añadir que colirio para dilatar a las pupilas después de que el animal es inmovilizado.
  3. Confirmar que el animal está completamente anestesiado por un pinchazo del dedo del pie y asegúrese de que el animal no reacciona.
  4. Recortar los bigotes y coloque el ratón sobre el trineo de HR-SD-OCT.
  5. Posición de ojo de ratón directamente delante de la lente de casco y manipular los controles de etapa hasta que la córnea y el iris se encuentran. Mantener la córnea hidratada mediante la aplicación de lágrimas artificiales.
    Nota: Los micromanipuladores ajuste fino en el trineo de HR-SD-OCT se utilizan para posicionar el ratón que la abertura de la pupila está centrada y orientada. El cabezal óptico luego se avanza hasta que la retina se hace visible y el animal se ajusta más para obtener la mejor imagen posible.
  6. En primer lugar, abrir el programa de software "Ratón" y haga clic en "examen de paciente". En segundo lugar, haga clic en "agregar paciente" e introduzca la información pertinente para identificar el animal en la nueva ventana y "guardar y salir". En tercer lugar, haga clic en "agregar examen" seguido de "iniciar examen". En cuarto lugar, "añade el escaneo personalizado" y seleccionar "volumen rectangular", elija OD o OS para el ojo se va a examinar, haga clic en "agregar examen". Por último, empezar a apuntar el instrumento y el posicionamiento del animal para obtener la región de interés. Después de encontrar la región correcta, retire cualquier exceso de líquido de la superficie del ojo con un algodón estéril con punta de aplicador justo antes de la adquisición de imágenes con el fin de mejorar la calidad de imagen, a continuación, haga clic en "iniciar la instantánea", y si se obtiene una buena imagen, haga clic en "guardar SCAN".
    Nota: Parámetros típicos para imágenes HR-SD-OCT rectangulares son 900 a-exploraciones/b-scan y 90 b-exploraciones de imagen. Imágenes adquiridas son 1,4 x 1,4 mm. La región de la retina imágenes depende de la experiencia específica, pero la mayoría de las imágenes está centrada en la cabeza del nervio óptico (HNO).

4. evaluar la presencia, la frecuencia y la uniformidad de degeneraciones retinianas externo modelo

  1. Evaluación del modelo de degeneración retiniana externa por HR-SD-OCT
    1. Obtener animales con un amplio espectro de edades para el control y los sujetos experimentales para evaluar la presencia, la frecuencia y la uniformidad de la degeneración retiniana externa.
    2. Realizar proyección de imagen de HR-SD-OCT en varios animales de cada edad de ambas cohortes (enfermedad y normal). Utilice el método descrito en 3.1.6 para obtener las imágenes de OCT.
      Nota: Los datos se pueden recoger en una cohorte grande de los animales a la vez, que han distribuido cumpleaños que abarca un período amplio de tiempo (1 año), o una pequeña cohorte de animal puede utilizarse para recopilar varias imágenes durante un largo período de tiempo (1 año) para obtener resultados similares.
    3. Abrir una imagen grabada de volumen rectangular HR-SD-OCT e identificar el primer b-scan para medirla (idealmente incluirá el HNO u otro punto de referencia identificable) desde el conjunto de imágenes. Ampliar la imagen para llenar la pantalla con la función de zoom en el software.
    4. Clic derecho sobre la imagen de b-scan y luego haciendo clic en "Pinzas" y finalmente clic en tantas pinzas como se desee para abrir el número de pinzas (se numeran 1 a 10). Asegúrese que las pinzas se muestran en la esquina inferior derecha de la imagen. Con la función "Configurar pinza" asignarlos todos como "vertical" en la columna de bloque de ángulo y gire a la "pantalla calibrador ubicación" para facilitar la colocación uniforme en toda la retina y por último, haga clic en aplicar.
      Nota: La pinza dest 1 debe colocarse en el lado izquierdo de la imagen cuando se procesa el oculus dexter ojo derecho (OD) y la 1st pinza debe colocarse a la derecha de la imagen al procesar las imágenes de ojo izquierdo oculus siniestras (OS). Esto resulta en una nasal a la orientación temporal de todos los datos para los ojos izquierdos y derecho al trazado.
    5. Utilizando el ratón de la computadora, mover cada pinza a la ubicación deseada (2,0 mm.) a través de b-scan, asegurándose de colocar una pinza en el centro de la cabeza del nervio óptico, en imágenes b-scan que (posición este calibrador cero). Utilizar el ratón para hacer clic y arrastrar la pinza a la longitud para atravesar la región de interés. Establecer arbitrariamente pinzas que no superposición de regiones medibles del b-scan para la longitud máxima y que ignorar durante el análisis de datos.
    6. Medir el espesor de la ONL utilizando las herramientas de pinza, colocando la parte superior de la pinza en la membrana limitante externa (Olmo) y la parte inferior de la pinza en la parte inferior de la capa plexiforme externa (OPL). Repita esto para cada calibrador a través de la retina en incrementos de 0,2 mm. Guardar las mediciones.
    7. Todos los calibradores han sido colocados y ajustados al tamaño, haga clic derecho sobre la imagen y haga clic en "Guardar datos de pinza".
    8. Repita las mediciones en el posterior b-explora (cada 10th exploración funciona bien) desde el mismo volumen rectangular de la imagen de OCT que atraviesan la retina entera de inferior a superiores regiones. Pinzas deben permanecer abiertas y en el mismo lugar en el eje x. Ajuste la longitud de las pinzas sin moverse en la dirección X.
    9. Abrir Guardar ficheros pulsando el icono de archivo pequeño al lado de lo procesado b-scan la imagen y haga clic en "Ir a datos". Haga clic en "fecha modificado para organizar los archivos en orden basado en el ahorro de tiempo y abrir todos los archivos para cada medida de b-scan.
    10. Compilar los datos en bruto de cada b-scan en un archivo en orden del más bajo al más alto basado en el número. Seleccione las columnas de datos como "Nombre del rey", "Longitud" y "Center X".
    11. Asegúrese de que el centro de la X es el mismo para todos b-Scan medidos para cada volumen rectangular OCT imagen procesada. Eliminar cualquier datos de pinzas que no fueron utilizados para registrar las mediciones y fijar la pinza situada en el centro de la cabeza del nervio óptico a cero.
    12. Parcela los datos x vs múltiples conjuntos de datos Y para obtener una función de trama 3D para representar el espesor total de la ONL u otra medida capa retiniana.
    13. Comparar las mediciones de la ONL entre control y animales de experimentación con las edades correspondientes para determinar la velocidad y uniformidad de cualquier potencial degeneración retiniana.
    14. Repita el proceso para la medición de la OSL utilizando las mismas imágenes b-scan. Seguir la misma metodología utilizada para medir la ONL, excepto la colocación de las pinzas entre olmo y de Bruch membrana (BM).
      Nota: Se muestra un ejemplo de cómo colocar el calibrador en la sección de resultados de representante (figura 3B). Esto debe hacerse en una imagen ampliada en disminuir el error.
    15. Repita el análisis de datos para varios animales para cada cumpleaños para ambos experimental y control cohortes.
  2. Medición integral y cartografía 3D de la ONL o OSL grueso usando la herramienta de software de pinzas
    1. Revisar las imágenes de OCT post inyección y tome nota de cualquier puntos de referencia identificables, como el HNO o los vasos sanguíneos en la retina. Sitúe el ratón para obtener un seguimiento SD-OCT de la misma región y no olvide incluir los mismos hitos identificables.
      Nota: Asegúrese de que la región de la retina imágenes y en el desprendimiento de retina se identifica en las imágenes de la inyección SD-OCT de post. Grabar una imagen de volumen rectangular SD-OCT y guárdelo.
    2. Procesar las imágenes grabadas como se describe en pasos 4.1.3. a 4.1.14. Guardar los datos de la pinza y trama como se describió anteriormente.
      Nota: La matriz resultante de las mediciones sólo se utiliza para crear un terreno 3D que representa el grueso de la ONL. La posición de las pinzas en el eje x permiten replot la gráfica colocando el nervio óptico en el origen (0) a lo largo del eje x. El eje y se grafica utilizando el número de b-scan y el nervio óptico se utiliza para definir el punto de partida, que permite colocar correctamente el nervio óptico en el origen sobre el eje y. Identificar el nervio óptico de cada conjunto de datos permite seguimiento imágenes esté alineado con fiabilidad.
  3. Asignación de la extensión del sitio de inyección en la imagen de fondo
    1. Realizar post inyección volumen rectangular OCT para confirmar el éxito de la inyección. Siga el método descrito en 3.6.
    2. Utilice la función de pinza en el software para identificar el punto de inflexión en la frontera del desprendimiento de la retina de un número de b-Scan que abarca toda la imagen de OCT. Utilice el método abrir pinzas descritas en 4.1.4.
    3. Grabar las imágenes de fondo de ojo con la ubicación asignada de la OCT b-scan y la correspondiente posición del calibrador en la imagen de fondo, que corresponde a su ubicación.
    4. Compilar todas las imágenes de fondo en una imagen compuesta, incluyendo las posiciones de la pinza, que se traduce en un mapa preciso de la inyección en la imagen de fondo (ejemplo en la sección de resultados de representante, figura 5A).

5. intraoculares inyecciones

Nota: Detalles sobre el uso del RIS son más elaborados en un reciente estudio23.

  1. Preparación de agujas de inyección de vidrio
    1. Autoclave el capilar tubos con filamentos en pequeñas cantidades utilizando el ciclo de secado.
    2. Utilice un extractor de pipeta y puesta en marcha un programa que va a producir una punta de vidrio con el ángulo más agudo y en el rango de 2-5 μm de diámetro.
      Nota: Un programa de paso muestra 5 agujas eficaces en nuestro tirador de la pipeta que se muestra en la tabla 1.
    3. Almacenar las agujas de vidrio tirado en un tarro de aguja pipeta estéril a temperatura ambiente.
  2. Llenar la aguja de inyección con la solución deseada para la inyección
    1. Monte la aguja en el portaagujas, dejando aproximadamente 5/8" que sobresale más allá del final del titular.
      Nota: A la distancia menos de 5/8" hará que sea difícil alcanzar la solución de la inyección para llenar la aguja, porque el sostenedor de la aguja no encaja fácilmente en la apertura de tubos de 0,2 mL. También, que la aguja sobresalga más de 5/8" resultados significativamente mayor oscilación o precesión de la punta, dificulta la proyección de imagen en tiempo real desde la punta deja el plano focal o campo de visión (FOV), al intentar perforar el ojo.
    2. Preparar la solución de la inyección en un tubo estéril de 0,2 mL. Agregar un 1:10 dilución de fluoresceína estéril de sulfato de (10 mg/mL en PBS 1 x) a la solución de inyección para obtener una concentración final de fluoresceína a 1 mg/mL.
      Nota: El exacto tinte utilizado es específico al usuario y puede ser cualquier cosa que es no tóxico y visible a simple vista bajo iluminación de luz blanca para facilitar la colocación precisa de la punta de la aguja a nivel del EPR y espacio subretinal.
    3. Visualizar la aguja a través del microscopio estéreo mientras que usa los mandos de las amalgamas dentales de 3 ejes a la posición de la aguja para que quede alineado con el centro del tubo que contiene la solución de la inyección que se utilizará para el llenado de la aguja.
    4. Conducir cuidadosamente la punta de la aguja en el tubo 0.2 mL hasta que la punta de la aguja esté sumergida en el líquido. Establecer el volumen de fluido de inyección (por ejemplo 1 μl) dentro de la aguja necesaria para una sola inyección. Mantener la solución restante en el tubo que se coloca en hielo.
  3. Preparar el animal para la inyección
    Nota:     el microscopio RIS se mantiene limpio y es un sistema sin contacto. La placa de calefacción se cubre con un paño limpio absorbente y agujas son autoclave antes de ser tirado. Después se tiró por una tira de metal caliente uno mismo-esterilización, se mantienen en una cámara esterilizada cerrada diseñada para sostener agujas de vidrio tiradas. Las agujas solo se manejan con las manos enguantadas, y cuidado se utiliza para evitar tocar la punta de la aguja mientras se monta en el soporte. Las soluciones inyectables se preparan utilizando una técnica estéril y se prueban para la contaminación por rayar una muestra de las preparaciones de virus en placas de LB agar e incubar durante la noche a 37 ° c.
    1. Peso del animal (g) para determinar la dosis apropiada de analgésicos anestésicos.
    2. Administrar anestésico (2.5% solución tamponada 2,2,2-tribromoethyl alcohol (Avertin)) mediante inyección intraperitoneal (IP).
    3. Aplicar inmediatamente los fármacos anticolinérgicos (por ejemplo, cyclopentylate) en ambos ojos para dilatar a las pupilas.
    4. Recortar los bigotes del animal y el número del animal utilizando punzón de oreja u otro método.
    5. Lave el ojo y el área circundante con betadine diluido.
      Nota: Evite que cualquier solución alrededor de la nariz, ya que puede producir ahogamiento accidental.
    6. Coloque el ratón sobre la almohada, mantenida a 39 ° c, en el soporte de ratón arcilla de modeler premoldeados con el ojo que se inyecta hacia la aguja.
    7. Asegúrese de que el ratón no responde usando una prueba de presión de las patas traseras.
  4. Realizar la inyección subretinal
    1. Utilice un par de pinzas de iris embotado estéril suavemente inducir proptosis del globo colocando las puntas de las pinzas en el 7 y 10:00 posiciones en las tapas del ojo mientras empuja hacia abajo y abiertas al mismo tiempo.
    2. Utilice las pinzas para convencer a los párpados con el globo del ojo para mantenerlo fuera de la toma de corriente durante el proceso de inyección.
      Nota: 10 a 14 días de edad los animales a menudo tendrá el ojo de la toma más fácilmente que animales más viejos.
    3. Dirigir la punta de la aguja aproximadamente 1-1.5 mm por debajo del borde del limbo corneal y conducir con cuidado en el ojo a través de la conjuntiva hasta que crea una depresión escleral como la aguja penetra en el tejido de la esclerótica y permite la manipulación del ojo.
    4. Girar el ojo hacia abajo con el instrumental quirúrgico para visualizar la depresión escleral a través de la pupila dilatada con el microscopio estéreo de RIS.
    5. Aplique una gota de gel de ojo estéril o de 1 x PBS solución y cubrir con un cubreobjetos estéril.
    6. Se centran en la depresión escleral creada por la punta de la aguja (2-5 μm) y unidad de la aguja hacia adelante hasta un pico agudo de las formas de la retina en el sitio de inyección.
    7. Gire la aguja usando el soporte hasta que la punta se agujerea a través de la esclera y la fluoresceína en la aguja es visible debajo de la retina en las inmediaciones de la monocapa de células RPE.
    8. Conducir la punta de la aguja, por lo que es tangencial al globo y luego se activa la bomba de inyección con el conmutador de pedal de pie.
    9. Después de que el volumen ha sido entregado (0.5-1 μl) en el espacio subretinal, retire la aguja y comprobar si la ampolla es estable y ese líquido no escape fuera del sitio de la inyección, que es el primer criterio de una inyección exitosa.
      Nota: Manteniendo un diámetro de la punta adecuada (2-5 μm de diámetro) es fundamental para evitar fugas del sitio de la inyección.
    10. Coloque el animal en la plataforma de proyección de imagen del instrumento OCT. Seguir las indicaciones hacia HR SD OCT de imagen para grabar una imagen de volumen rectangular.
    11. Confirman que el líquido inyectado se encuentra en el espacio subretinal, guardar las imágenes para determinar el alcance de la ampolla.
    12. Retire el animal del soporte y aplicar una amplia cantidad de pomada antibiótica en los ojos inyectados.
    13. Coloque el animal en una almohadilla de calefacción hasta que completamente se recupera, luego coloque en la caja original donde vino.
      Nota: Nuestros animales generalmente se inyección antes del destete, por lo tanto los animales deben ser devueltas a la jaula con la madre.
  5. Asignación de la magnitud de la ampolla subretinal utilizando herramientas de software de instrumento OCT.
    1. Obtener una imagen de OCT volumen rectangular, usando los métodos descritos anteriormente, de la ampolla y la posición para incluir un hito reconocible dentro del ojo como el Hno.
      Nota: 90 b-explora la grabación funciona bien para el mapeo de la ampolla, pero podría utilizarse dependiendo de la resolución deseada.
    2. Añadir una sola pinza a la figura y colocarla en el punto de inflexión donde la retina se desprende de la EPR y coroides.
      Nota: El software automáticamente asigna un punto correspondiente a una línea en la imagen de fondo que representa la pinza y el b-scan está evaluando.
    3. Captura la pantalla después de la colocación de las pinzas y compilar las imágenes para asignar con eficacia la frontera de la ampolla de inyección sobre la imagen de fondo, que precisamente el sitio de inyección. Guarda la imagen compilada para referencia ayudar en la localización de las regiones de interés durante la proyección de imagen de seguimiento.
      Nota: Alternativamente, los datos de pinza pueden guardarse, cumplieron y trazan utilizando un método similar para trazar los conjuntos de datos 3D de espesor ONL.
  6. Inyección intravítrea
    1. Coloque la punta de la aguja utilizando un enfoque quirúrgico similar como inyección retiniana sub, excepto que la aguja se mueve enteramente a través de la esclera a la pars plana aprox. 0,25 mm detrás del limbo corneal y en el vítreo.
    2. Después de la colocación de la aguja, se aplica el pulso de inyección con el pedal.
      Nota: Se observa una rápida difusión del colorante fluoresceína en el vítreo de la ojera, llenando la abertura de la pupila dilatada con fluorescencia.

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Resultados

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Evaluar la presencia, velocidad y uniformidad de la degeneración retiniana externa modelo
Se registraron las mediciones de la ONL de la OPL al olmo, definir los límites de la ONL con la herramienta de pinza en el software del instrumento. El objetivo era asignar la progresión de la degeneración retiniana externa en un modelo de ratón de adRP parcialmente humanizado. Imágenes comparables de un ratón C57BL/6(J) de control y una mWT hC1 y hC1/mWT modelo con ratones, expre...

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Discusión

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HR-SD-OCT proporciona un método simple para la caracterización de potenciales modelos animales de enfermedad en humanos para determinar su utilidad en la prueba terapéutica potencial. La capacidad de rapidez y fiabilidad caracterizar un modelo animal potencial de la enfermedad humana es fundamental para el proceso de descubrimiento de drogas terapéuticas (p. ej., terapia de recambio genética, terapia del gene precipitación ribozyme o shRNA, terapia génica combinada). HR-SD-OCT proporciona un método simple, rápid...

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Divulgaciones

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Relaciones comerciales: MCB: ninguno; JMS: ninguno. La retina imágenes de sistema (RIS)23 utilizado en este estudio es un nuevo dispositivo de uso substancial a cualquier grupo que busca llevar a cabo estudios de entrega de terapia génica en ratones, roedores o animales pequeños. Mientras que los autores no tienen ninguna conflictos a declarar con respecto a este dispositivo en este momento, la Universidad de búfalo - SUNY y la administración de los veteranos tiene derechos de propiedad intelectual y puede tratar de comercializar este instrumento en el futuro.

Agradecimientos

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Este material está basado en trabajo apoyado, en parte, por el Departamento de Asuntos Veteranos (VA), Veterans Health Administration, oficina de investigación y desarrollo (Biomédica de laboratorio de investigación y desarrollo) (beca de mérito VA 1I01BX000669). JMS es empleado, en parte, como personal médico-científico, oftalmología, de por qué VA; MCB es empleado, en parte, de por qué VA. El estudio fue llevado a cabo en y apoyado en parte por el sistema sanitario veteranos administración occidental Nueva York (Buffalo, NY). Contenidos no representan las opiniones del Departamento de asuntos de veteranos o el gobierno de Estados Unidos. También apoyó, en gran parte, por NEI/NIH R01 grant EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 conceder EY016662 (UB visión infraestructura centro, PI: M sacrificio, Director - biofotónica módulo: JMS), un subsidio sin restricciones a la Departamento de Oftalmología/Universidad Búfalo de la investigación para evitar la ceguera (Nueva York) y una beca de la Fundación de Oishei (Buffalo, NY). Reconocemos el don de la líneaP347S de hC1 transgénica RHOy el ratón del exón 1 nocaut RHO de Dr. Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) y el regalo del modelo transgénico NHR-E en el estado heterozigótico en la ratón exón 2 RHO nocaut en el segundo plano de los Drs. G. Jane Farrar y Peter Humphries (Trinity College, Dublín, Irlanda).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Instrumento de Tomografía de Coherencia Ocular (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.   
Sistema de imágenes de la retina (RIS)InternoN/A
Microscopio Stemi 2000CZeiss000000-1106-133
P-97 Tirador de micropipetas Flaming/BrownSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulador Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro inyectorHarvard Apparatus64-1736
Soporte de micropipeta (giratorio)InternoN/A
Receptáculo de almacenamiento de micropipetasWorld Precision Instruments Inc.E210
  Tubos capilares de vidrio de borosilicato 1,5-1,8 X 100 mm, Aparato de Harvard30-0053
2,2,2-tribromoetanolSIGMAAldrich T48402-25G
Alcohol terc-amílicoSIGMAAldrich 240486-100ML
Solución oftálmica de sulfato de atropina, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Solución oftálmica de clorhidrato de ciclopentolato, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Ungüento de sulfato de gentamicina USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane Ultra AlconLaboratories, Inc.9006619-1013
Clorhidrato de tetracaínaBausch y LombNDC 24208-920-64
Solución oftálmica, USP 0.5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Preparaciones de virusViGene /UNCN/A
Nanovarillas de oroNANOPARTzD12M-850-1.75
Sulfato de fluoresceína AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
CubreobjetosFisher Scientific12-548-A
PinzasMilton18-825
Agujas de calibre 30Beckton Dickenson   W11604
JeringasBeckton Dickenson   
Paquete de software Bioptigen BioptigenN/A
, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
EscalaMettler
TijerasWorld Precision Instruments
Punzón de orejaNat' Banda
CL 100 Fuente de luzWelch AllynCL100
Gas nitrógenoJackson Suministro de soldaduraN/A
Baño de agua calentadoNeslabRTE-140
Placa calefactoraen casaN/A
Estera calefactoraCincinnatti Sub Zero273
Arcilla Soporte para ratónPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Aplicadores de punta de algodónAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Guantes NitriloVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Lentes de contactoInternoN/A
SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Electrodos de referenciaOcuscienceElectrodo de rosca F (DTL) 24"
309659 Solución oftálmica de clorhidrato de proparacaínal Diagnosys

Referencias

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