Method Article

Tomografía de coherencia óptica ultraalta resolución ratón para facilitar la inyección Intraocular en investigación de retina la terapia génica

DOI:

10.3791/55894

⸱

November 2nd, 2018

 , 
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí nos muestran un nuevo enfoque al uso de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral de alta resolución (HR-SD-OCT) para facilitar la presentación de los agentes de terapia génica en el espacio subretinal, evaluar su cobertura areal y caracterizan la vitalidad del fotorreceptor.

Abstract

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HR-SD-OCT se utiliza para monitorizar la progresión de la degeneración de fotorreceptores en modelos de ratón vivo, evaluar la prestación de agentes terapéuticos en el espacio subretinal y para evaluar la toxicidad y la eficacia en vivo. HR-SD-OCT utiliza cerca de luz infrarroja (800-880 nm) y tiene óptica específicamente diseñado para la única óptica del ojo de ratón con una resolución axial de sub-2 micrones. Fueron imágenes de modelos de ratón transgénico de degeneración retiniana externa (fotorreceptor) y controles para evaluar la progresión de la enfermedad. Vidrio tirado microneedles fueron utilizados para entregar inyecciones retiniana sub de virus adeno-asociado (AAV) o nanopartículas (NP) a través de un enfoque trans-escleral y trans-coroides. Cuidadosa colocación de la aguja en el espacio subretinal fue requerida antes de una inyección de presión calibrada, que entrega el líquido en el espacio retiniano sub. Se realizó cirugía subretinal en tiempo real en nuestra retina imágenes de sistema (RIS). HR-SD-OCT demostró degeneración progresiva de retina uniforme debido a la expresión de una tóxico rodopsina mutante humana mutante (P347S) (RHOP347S) transgénica en ratones. HR-SD-OCT permite cuantificación rigurosa de todas las capas retinianas. Capa nuclear externa (ONL) grueso y fotorreceptores segmento externo (OSL) las mediciones de longitud se correlacionan con la vitalidad del fotorreceptor, degeneración o rescate. El sistema RIS permite la visualización en tiempo real de inyección subretinal en neonatal (~ P10-14) o ratones adultos, HR-SD-OCT inmediatamente determina el éxito de la entrega y mapas de extensión areal. HR-SD-OCT es una herramienta poderosa que puede evaluar el éxito de la cirugía subretinal en ratones, además para medir la vitalidad de fotorreceptores en vivo. HR-SD-OCT puede utilizarse también para identificar cohortes animal uniforme para evaluar el grado de degeneración retiniana, toxicidad y rescate terapéutico en estudios de investigación de terapia génica preclínica.

Introduction

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Los investigadores están desarrollando terapias genéticas para una variedad de enfermedades degenerativas retinianas y retinales con la esperanza de traducir novela terapéutica en tratamientos para la enfermedad humana1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. dominio del tiempo o la tomografía de coheren....

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Protocol

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Protocolos animales fueron revisados y aprobados por institucional Animal Care y comités de uso de la HCS de por qué VA y de la Universidad SUNY Buffalo. Los animales fueron utilizados según las estipulaciones de la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología (ARVO) y la declaración de Helsinki.

1. modelos de ratón

  1. Identificar modelos de ratón para ser evaluada incluyendo los controles.
    Nota: Proyección de imagen fue realizada para un C57BL/6(J), hC1 y hC1/mWT mWT, un modelo de degeneración retiniana parcialmente humanizado de ratón homocigótico para humano RHOP347S hC1 alelos ....

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Results

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Evaluar la presencia, velocidad y uniformidad de la degeneración retiniana externa modelo
Se registraron las mediciones de la ONL de la OPL al olmo, definir los límites de la ONL con la herramienta de pinza en el software del instrumento. El objetivo era asignar la progresión de la degeneración retiniana externa en un modelo de ratón de adRP parcialmente humanizado. Imágenes comparables de un ratón C57BL/6(J) de control y una mWT hC1 y hC1/mWT modelo con ratones, expre.......

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Discussion

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HR-SD-OCT proporciona un método simple para la caracterización de potenciales modelos animales de enfermedad en humanos para determinar su utilidad en la prueba terapéutica potencial. La capacidad de rapidez y fiabilidad caracterizar un modelo animal potencial de la enfermedad humana es fundamental para el proceso de descubrimiento de drogas terapéuticas (p. ej., terapia de recambio genética, terapia del gene precipitación ribozyme o shRNA, terapia génica combinada). HR-SD-OCT proporciona un método simple, rápid.......

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Disclosures

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Relaciones comerciales: MCB: ninguno; JMS: ninguno. La retina imágenes de sistema (RIS)23 utilizado en este estudio es un nuevo dispositivo de uso substancial a cualquier grupo que busca llevar a cabo estudios de entrega de terapia génica en ratones, roedores o animales pequeños. Mientras que los autores no tienen ninguna conflictos a declarar con respecto a este dispositivo en este momento, la Universidad de búfalo - SUNY y la administración de los veteranos tiene derechos de propiedad intelectual y puede tratar de comercializar este instrumento en el futuro.

Acknowledgements

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Este material está basado en trabajo apoyado, en parte, por el Departamento de Asuntos Veteranos (VA), Veterans Health Administration, oficina de investigación y desarrollo (Biomédica de laboratorio de investigación y desarrollo) (beca de mérito VA 1I01BX000669). JMS es empleado, en parte, como personal médico-científico, oftalmología, de por qué VA; MCB es empleado, en parte, de por qué VA. El estudio fue llevado a cabo en y apoyado en parte por el sistema sanitario veteranos administración occidental Nueva York (Buffalo, NY). Contenidos no representan las opiniones del Departamento de asuntos de veteranos o el gobierno de Estados Unidos. También apoyó, en gran parte....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Instrumento de Tomografía de Coherencia Ocular (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.   
Sistema de imágenes de la retina (RIS)InternoN/A
Microscopio Stemi 2000CZeiss000000-1106-133
P-97 Tirador de micropipetas Flaming/BrownSutter Instrument Cop-97
MMN-33 micro manipulador Narishige USAMMN-33
PLI-100  micro inyectorHarvard Apparatus64-1736
Soporte de micropipeta (giratorio)InternoN/A
Receptáculo de almacenamiento de micropipetasWorld Precision Instruments Inc.E210
  Tubos capilares de vidrio de borosilicato 1,5-1,8 X 100 mm, Aparato de Harvard30-0053
2,2,2-tribromoetanolSIGMAAldrich T48402-25G
Alcohol terc-amílicoSIGMAAldrich 240486-100ML
Solución oftálmica de sulfato de atropina, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Solución oftálmica de clorhidrato de ciclopentolato, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Ungüento de sulfato de gentamicina USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane Ultra AlconLaboratories, Inc.9006619-1013
Clorhidrato de tetracaínaBausch y LombNDC 24208-920-64
Solución oftálmica, USP 0.5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Preparaciones de virusViGene /UNCN/A
Nanovarillas de oroNANOPARTzD12M-850-1.75
Sulfato de fluoresceína AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
CubreobjetosFisher Scientific12-548-A
PinzasMilton18-825
Agujas de calibre 30Beckton Dickenson   W11604
JeringasBeckton Dickenson   
Paquete de software Bioptigen BioptigenN/A
, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
EscalaMettler
TijerasWorld Precision Instruments
Punzón de orejaNat' Banda
CL 100 Fuente de luzWelch AllynCL100
Gas nitrógenoJackson Suministro de soldaduraN/A
Baño de agua calentadoNeslabRTE-140
Placa calefactoraen casaN/A
Estera calefactoraCincinnatti Sub Zero273
Arcilla Soporte para ratónPlast.i.clay American Art Clay Co.N/A
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Aplicadores de punta de algodónAmerican Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Guantes NitriloVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Lentes de contactoInternoN/A
SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 softwareOriginLab Corp.N/A
Electrodos de referenciaOcuscienceElectrodo de rosca F (DTL) 24"
309659 Solución oftálmica de clorhidrato de proparacaínal Diagnosys

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W.

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Optical Coherence TomographySubretinal InjectionRetinal Gene TherapyMouse Eye ImagingOuter Nuclear LayerPhotoreceptor DegenerationAdeno Associated VirusReal Time VisualizationTransscleral ApproachRetinal Imaging System

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