Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.
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Artículo de método
Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección
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Resumen
Resumen
Virus de la influenza causan más de 500.000 muertes en todo el mundo1 y se asocian con un costo anual de US $ 12 billones en los Estados Unidos solo considerando médica directa y gastos de hospitalización y ausentismo de trabajo2. Modelos animales son cruciales en los estudios de Influenza A virus (IAV) evaluar patogenesia viral, interacciones huésped-patógeno, respuesta inmune, y la eficacia de la vacuna actual o nuevos enfoques así como antivirales. Los ratones son un modelo animal pequeño ventajoso porque su sistema inmunológico es evolutivamente similar a ése encontrado en los seres humanos, están disponibles de proveedores comerciales como sujetos genéticamente idénticos, existen múltiples cepas que pueden ser aprovechadas para evaluar la base genética de las infecciones, y son relativamente baratas y fáciles de manipular. Para recapitular la infección IAV en los seres humanos a través de las vías respiratorias, ratones primero son anestesiados antes de la inoculación intranasal con gripe infecciosa bajo contención de bioseguridad adecuado. Después de la infección, la patogenesia de la gripe se determina mediante el control diario de la morbilidad (pérdida de peso corporal) y la tasa de mortalidad (supervivencia). Además, patogenesia viral también puede evaluarse mediante la evaluación de replicación del virus en la parte superior (mucosa nasal) o tracto respiratorio (pulmones) inferior de ratones infectados. Las respuestas humorales sobre infección de IAV pueden rápidamente evaluar sangrado no invasiva y la detección del anticuerpo secundario ensayos destinados a detectar la presencia de total o anticuerpos neutralizantes. Aquí, describimos los métodos comunes utilizados para infectar ratones intranasal (i.n) con IAV y evaluar patogénesis, respuesta inmune humoral y eficacia de protección.
Introducción
Gripe es virus envueltos, clasificados en la familia de Orthomyxoviridae 3. Contienen ocho moléculas de ARN monocatenario con polaridad negativa3. En los seres humanos, gripe causa epidemias estacionales y pandemias ocasionales de consecuencia importante cuando se introducen nuevos virus en la población humana4. Por otra parte, gripe estacional es altamente y rápidamente transmitida entre los seres humanos produciendo una elevada pérdida económica en todo el mundo cada año2,5. IAV los síntomas incluyen tos, congestión nasal, fiebr....
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Protocolo
todos los protocolos animal descritos aquí fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) y el Comité institucional de bioseguridad (IBC) en la Universidad de Rochester escuela de medicina y odontología y cumplir con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la 22 de Consejo de investigación nacional. Las instalaciones y programas del vivero y la división de medicina del laboratorio Animal de la Facultad de medicina y odontología están acreditados por AAALAC International y cumplan con la política de institutos nacionales de salud (NIH), ley federal y ley estatal. Requisitos similares se apliqu....
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Resultados
Caracterización de la patogenesia viral en ratones
La patogenesia de IAV se relaciona con la morbilidad y la mortalidad causada por la infección. Estos dos parámetros pueden evaluarse fácilmente en ratones: morbilidad IAV se asocia con pérdida de peso corporal en ratones infectados y el porcentaje de supervivencia indicará la tasa de mortalidad (figura 1). El peso corporal y la supervivencia en ratones.......
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Discusión
El modelo de ratón de IAV es ampliamente utilizado en vivo estudios de eficacia IAV patogenesia, inmunogenicidad y protección. El pequeño tamaño de los ratones los hace fáciles de manipular y almacenar en comparación con otros modelos animales tales como hurones o cobayas. Además, la facilidad en términos de costo de animal, alojamiento y reproducción permiten su uso en pruebas de vacunación pre clínicos en los que se necesitan grandes cantidades de animales. En particular, ya que los ratones se han utilizado en.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Investigación sobre el virus de la gripe en laboratorio LM-S es financiada parcialmente por la Nueva York Influenza centro de excelencia (NYICE), miembro de la NIAID centros de excelencia para la investigación de la Influenza y vigilancia (CEIRS). Agradecemos a Wendy Bates por su apoyo en las correcciones del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (MDCK) | ATCC | CCL-34 | |
| Ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad | Instituto Nacional del Cáncer (NCI) | 01XBE | |
| Células rojas de Turckey | Biolink Inc | Tienda en 4 ° C | |
| Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Tienda a 4 ° C |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Tienda en -20 ° C |
| Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Tienda en -20 ° C |
| Penicilina/Estreptomicina (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Tienda a -20 ° C |
| Bovin Solución de albúmina (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Tienda a 4 & deg; C |
| Bovin Albúmina sérica (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Tienda en 4 ° C |
| Tosilsulfonil fenilalanil clorometilcetona tratada (TPCK) con tripsina | Sigma-Aldrich | T8802 | Almacene en -20 & grados; C |
| Formalina tamponada neutra 10% | EMD | 65346-85 | Tienda en RT |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Tienda en RT |
| Anticuerpo monoclonal anti-NP Virus de la influenza A HB-65 | ATTC | H16-L10-4R5 | Tienda en -20 ° C |
| Inmunoglobulinas policlonales anti-ratón de conejo/FITC | Dako | F0261 | Almacenar en 4 ° C |
| ECL Anti-ratón IgG, anticuerpo entero ligado a la peroxidasa de rábano picante | GE Healthcare LNA931V | /AG | Tienda en 4 & deg; C |
| Juego de sustratos TMB | BioLegend | 421101 | Almacenar a 4 & grados; C |
| Vmax Lector de placas cinéticas | Molecular Devices | ||
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Enzima destructora de receptores, RDE (II) | Denka Seiken Co. | 370013 | Tienda a -20 ° C |
| Violeta | Cristal Fisher Scienctific | C581-100 | Tienda en RT |
| Placa de cultivo celular de 96 pocillos | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Placas de cultivo celular 100 mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| Nunc MicroWell Microplacas de 96 pocillos | Thermo Fisher Scienctific | 269620 | |
| Nunc Poliestireno de 96 pocillos Placas MicroWell de | fondo cónicoThermo Fisher Scienctific | 249570 | |
| Puralub Vet Opomada | Dechra | 9N-76855 | |
| Microscopio fluorescente | Olympus | Olympus IX81 |
Referencias
- Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
- Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6
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Reimpresiones y permisos
