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Artículo de método

Inducción y diagnóstico de tumores en

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⸱

DOI:

10.3791/55901

⸱

25 de julio de 2017

 , 
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

En este artículo

Resumen

El análisis de clones mosaicos en el epitelio discal imaginario de Drosophila es un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. Aquí se describe un protocolo para inducir tumores en Drosophila ala imaginal discos utilizando el sistema GAL4-UAS, e introducir un método de diagnóstico para clasificar los tumores fenotipos.

Resumen

En las primeras etapas del cáncer, las células mutantes transformadas muestran anormalidades citológicas, comienzan un crecimiento excesivo no controlado y alteran progresivamente la organización tisular. Drosophila melanogaster ha surgido como un modelo experimental popular en el sistema de biología del cáncer para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. En particular, las herramientas genéticas para los discos imaginarios de Drosophila (desarrollo de epitelios en larvas) permiten la creación de células pro tumorales transformadas dentro de un tejido epitelial normal, situación similar a las etapas iniciales del cáncer humano. Sin embargo, un estudio reciente de tumorigénesis en discos imaginarios de alas de Drosophila demostró que la iniciación tumoral depende de la citoarquitectura intrínseca del tejido y del microambiente local, lo que sugiere que es importante considerar la susceptibilidad específica de la región a los estímulos tumorigénicos en la evaluación de fenotipos tumorales en imaginal Discos Para facilitar el análisis fenotípico del progreso tumoralEn discos imaginal, aquí se describe un protocolo para experimentos genéticos utilizando el sistema GAL4-UAS para inducir tumores neoplásicos en discos imaginal de ala. Además, hemos introducido un método de diagnóstico para clasificar los fenotipos de las lesiones clonales inducidas en el epitelio imaginal, como un método de clasificación clara para discriminar las diversas etapas de la progresión tumoral (como la hiperplasia, displasia o neoplasia) no se había descrito anteriormente. Estos métodos podrían aplicarse ampliamente al análisis clonal de fenotipos tumorales en diversos órganos de Drosophila .

Introducción

Los tejidos epiteliales son sistemas altamente organizados que tienen la notable capacidad homeostática de mantener su organización a través del desarrollo y la renovación celular. Este robusto sistema de auto-organización, sin embargo, se interrumpe progresivamente durante el desarrollo del tumor. Al comienzo del desarrollo del tumor, las células mutantes individuales que surgen de la activación del oncogén o la inactivación del gen supresor del tumor emergen dentro de una capa epitelial. Cuando esta transformada "célula pro-tumor" evade un ambiente supresor, interrumpe la organización epitelial, y comienza la proliferación incontrolada, la tumorigénesis se produce 1 . Durante las últimas décadas, avances tecnológicos sobresalientes en genética y biología molecular han hecho progresos notables en la investigación del cáncer. En particular, los estudios recientes que utilizan los instrumentos de análisis genéticamente mosaico en Drosophila melanogaster , tales como la recombinación mitótica FLP-FRT (recombinante flippase / flase recombinase)ación 2 y flip-out-GAL4-UAS sistemas (secuencia de activación aguas arriba) 3, han contribuido enormemente a una mejor comprensión de los mecanismos genéticos implicados en la formación y metástasis de tumores 4, 5, 6.

Los estudios de un grupo de genes supresores de tumores conservados de Drosophila , larvas gigantes letales ( lgl ), discos grandes ( dlg ) y garabatos ( scrib ), resaltaron la relación crítica entre la pérdida de organización epitelial y el desarrollo tumoral, ya que estos genes desempeñan papeles clave En la regulación de la polaridad celular apical-basal y la proliferación celular en los tejidos epiteliales [ 7] . Mientras que los discos imaginarios de Drosophila son normalmente epitelios monocapa, las mutaciones homocigóticas en cualquiera de estos tres genes hacen que las células pierdan estructura y polaridad, no difierenRentizar, sobreproliferar y, finalmente, formar masas amorfas multicapa que se funden con tejidos adyacentes 7 . Del mismo modo, la interrupción de estos genes en los mamíferos está involucrado en el desarrollo de tumores malignos [ 8 , 9] . Los fenotipos neoplásicos exhibidos por los tejidos mutantes han llevado a la clasificación de estos tres genes conservados, genes neoplásicos supresores de tumores (nTSGs) [ 7 , 8] . Sin embargo, cuando homozygous nTSG células mutantes son esporádicos generados en el desarrollo de tipo salvaje discursos imaginales utilizando FLP-FRT mediada por la recombinación mitótica, las células mutantes son eliminados del tejido a través de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) -dependiente apoptosis 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusión 15 , 16 , o el engolfamiento y la fagocitosis por los vecinos [ 17] . En este epitelio genéticamente mosaico, la apoptosis se detecta principalmente en las células mutantes nTSG localizadas en el límite del clon, lo que sugiere que las células normales adyacentes desencadenar la apoptosis de nTSG células mutantes [ 10 , 11 , 12 , 18] . Estudios recientes en células de mamíferos han confirmado que esta eliminación celular dependiente de la competencia de las células pro-tumor es un mecanismo evolutivo conservado epiteliales de autodefensa contra el cáncer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Un reciente estudio en Drosophila imaginal discos, sin embargo, mostró que mosaico nTSG-knockdown clones induce tumores neoplásicos en especificaIc de los discos imaginal de ala 16 . La formación inicial de tumores se encontró siempre en la región periférica de la "bisagra" y nunca se observó en la región central de la "bolsa" del epitelio del disco de ala, lo que sugiere que el potencial tumorigénico de las células knockdown nTSG depende del entorno local. La región de la bolsa central funciona como una "mancha fría del tumor" donde las células pro-tumor no muestran sobrecrecimiento displásico, mientras que la región bisagra periférica se comporta como un "hotspot tumoral" 16 . En las regiones de bolsa "coldspot", las células de desmontaje de nTSG se deslaminan desde el lado basal y sufren apoptosis. Por el contrario, como "hotspot" bisagra células poseen una red de estructuras robusto citoesqueleto en sus lados basales, nTSG-knockdown células delaminate desde el lado apical del epitelio e iniciar tumorigenic sobrecrecimiento [ 16] . Por lo tanto, el análisis de los fenotipos tumorales en discos imaginal requiereLa susceptibilidad específica de la región a estímulos tumorigénicos.

En este sentido, se describe un protocolo para inducir la formación de tumores neoplásicos en el disco Drosophila imaginal discos utilizando el GAL4-UAS- RNAi sistema por el cual nTSG-knockdown células se generan en el epitelio del disco de ala normal. Aunque estos sistemas experimentales son útiles para estudiar las primeras etapas del cáncer, no se ha descrito claramente un método claro de clasificación para evaluar las etapas de progresión tumoral en epitelios discales imaginarios. Por lo tanto, también proponemos un método de diagnóstico para clasificar los fenotipos clonales pro-tumorales inducidos en el epitelio del disco ala en tres categorías: hiperplasia (acumulación de un número excesivo de células de aparición normal con aumento de la proliferación), displasia (tejido premaligno compuesto de anormalmente aparente Células), y neoplasia (tumor benigno o maligno compuesto de células que tienen un aspecto anormal y un patrón de proliferación anormal).

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Protocolo

1. Cruces de la mosca y inducción del clon

  1. Eliminar todas las moscas en el vial 12 h antes de recoger virgen moscas.
  2. Anestesiar las moscas en el vial inyectando gas CO 2 y colocar moscas en una almohadilla de mosca de CO 2 .
  3. Transferir de 10 a 20 hembras virgenes y 10 machos de la almohadilla de mosca de CO 2 a un vial nuevo e incubar durante 1 día a 25 ° C.
  4. Transferir estas moscas en un vial nuevo e incubar durante 12 h a 25 ° C.
    NOTA: Deseche el primer vial ya que las hembras virgen no ponen suficientes huevos en el primer día.
  5. Para líneas enhancer-GAL4, retire las moscas adultas e incube el vial a 25 ° C hasta disección.
  6. Para la inducción de los clones del mosaico mediante el flip-out-GAL4, retire las moscas adultas e incube el vial durante 2-4 días a 25 ° C. El tiempo de incubación antes del choque térmico depende del propósito experimental. Un choque térmico 2 días después de la deposición del huevo (AED) genera clones de mosaico en segundos inmadurosInstar epitelios imaginal. Un shock térmico después de 3 ó 4 días de DEA genera clones de mosaico en epitelios imaginarios diferenciados de instar temprano a mediados del tercer instar.
    NOTA: Es importante examinar el efecto del tiempo de choque térmico alterado en los fenotipos tumorigénicos.
  7. Para la inducción de los clones de mosaico mediante flip-out-GAL4, calentar el vial por inmersión en un baño de agua a 37 ° C durante 10 - 45 min seguido de incubación durante 2 - 3 días a 25 ° C.
    NOTA: La información del tiempo de choque térmico, el tiempo y el tiempo de incubación en cada experimento se muestran en las leyendas de la figura.

2. Disección de las larvas

  1. Recoja las larvas de tercer estadio errantes con una pinza de madera o fórceps romos, genotipo por marcadores fluorescentes apropiados ( por ejemplo , EGFP) bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia y colóquelas en un plato de disección con PBS (solución salina tamponada con fosfato).
  2. Lavar las larvas en PBS pipeteando con pipetas de transferencia de plástico de 2 ml.
  3. Pellizque el centro de la larva con una pinza y rompa el cuerpo por la mitad con la otra pinza.
  4. Pellizque el gancho de la boca de la mitad anterior con una pinza y empuje la boca hacia el cuerpo con la otra pinza para girar el cuerpo de adentro hacia afuera.
  5. Eliminar los materiales innecesarios, como las glándulas salivales o los cuerpos de grasa con fórceps.

3. Fijación y tinción de anticuerpos

  1. Transferir la mitad anterior disecada del cuerpo larval (incluyendo los discos imaginarios del ala) a un tubo plástico de 1,5 ml y fijar en 1 mL de solución Fix (formaldehído 4% en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con rotación suave.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y tiene un potencial carcinógeno. Use guantes y ropa protectora para evitar el contacto con la piel.
    NOTA: En esta parte, todas las etapas tienen lugar en un nutator a temperatura ambiente en la oscuridad a menos que se indique lo contrario.
  2. Quite la solución Fix y deséchela. Lave los tejidos con 1 mL de PBT (0.3% TritEn X-100 en PBS) tres veces durante 15 min cada uno.
  3. Eliminar el PBT y añadir 1 ml de PBTG (0,2% de suero de bóvidos bovinos y 5% de suero normal de cabra en PBT) para bloquear y nutate 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC.
  4. Quitar PBTG y añadir la solución de anticuerpo primario diluido apropiadamente con PBTG (véase Tabla de Materiales ) y nutate durante la noche a 4 ° C.
  5. Eliminar la solución de anticuerpo primario y lavar los tejidos con 1 mL de PBT tres veces durante 15 minutos cada uno.
  6. Eliminar PBT y añadir una solución de anticuerpo secundaria debidamente diluida con PBTG (1: 400). Nutate durante 2 h a temperatura ambiente o durante una noche a 4 ° C.
  7. Eliminar la solución de anticuerpos secundarios y lavar los tejidos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 minutos cada uno.
  8. Para teñir F-actina, eliminar PBT y añadir Phalloidin solución diluida adecuadamente en PBS (1:40). A continuación, nutate durante 20 min. Retire la solución de Phalloidin y lave los tejidos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 min cada uno.
  9. Para contra-tinción de ADN nuclear, eliminar PBT y añadir DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole) solución (0,5 μ g / mL de DAPI en PBS). A continuación, nutate 10 min.
    PRECAUCIÓN: DAPI tiene potencial carcinógeno. Use guantes y ropa protectora para evitar el contacto con la piel.
  10. Eliminar la solución DAPI y lavar los tejidos con 1 mL de PBT dos veces durante 15 minutos cada uno.
  11. Enjuagar una vez en 1 mL de PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
  12. Eliminar PBS y añadir 500 μ l de 100% de glicerol como el medio de pre-montaje.

4. Montaje en portaobjetos de microscopio

  1. Coloque los tejidos teñidos en una diapositiva de microscopio con una pipeta de transferencia de plástico de 2 ml.
  2. Transferir los tejidos a gotas de medio de montaje en otra diapositiva de microscopio con fórceps.
  3. Mantenga presionado el extremo del tejido diseccionado con una pinza y retire los discos antenales del cerebro y los ojos con las otras pinzas.
    NOTA: Mantenga los cerebros disecados para colocarlos cerca de los discos imaginales del ala. Los cerebros actúan como una plataforma que impide que el cubreobjeto aplaste los discos imaginal del ala.
  4. Para aislar el ala los discos imaginales mantienen el extremo del tejido disecado con una pinza y rascan suavemente la pared del cuerpo y arrancan los discos con las otras pinzas.
    NOTA: Si es difícil encontrar discos imaginal del ala, pelar la tráquea desde el lado posterior al lado anterior. Los discos imaginarios del ala se adhieren a la tráquea.
  5. Cubra suavemente los discos imaginales con un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas; Almacenar a 4 ° C.

5. Microscopía confocal

  1. Para adquirir imágenes confocales usando un microscopio confocal, fije los parámetros de adquisición de imágenes, incluyendo el rango de longitud de onda de emisión, intensidad láser, ganancia, offset, velocidad de exploración y tamaño de imagen 24 .
    NOTA: Para el procedimiento detallado de los ajustes de adquisición de imágenes, consulte el manual de instrucciones suministrado por cada fabricante de microscopio.
  2. Para capturar solo coSecciones nfocal de un disco imaginal del ala entera, utilice un objetivo 20X.
  3. Adquiera imágenes tridimensionales mediante escaneo de pilas en z con tamaño de paso de 0,5 a 1,0 μm usando lentes de 40X o 60X.
    NOTA: Para analizar los fenotipos celulares en alta resolución, un tamaño de imagen debe ser mayor de 512 x 512 píxeles.

6. Análisis de imágenes con ImageJ

  1. Utilice Fiji, un software de código abierto ImageJ enfocado en el análisis de imágenes biológicas (https://fiji.sc/) 25 , para adquirir y analizar las imágenes confocal de la z-pila.
  2. Para obtener secciones verticales, abra las imágenes de pila z en ImageJ y seleccione el elemento de menú "Imagen / pilas / Reslice".
    NOTA: Tanto el eje XZ como el eje YZ se pueden seleccionar en el menú Reslice. La sección vertical puede obtenerse también en una dirección arbitraria dibujando una línea recta o rectángulo sobre la imagen de la pila z.

7. Diagnóstico de los fenotipos neoplásicos

  1. Abrir la vertical(Eje XZ o YZ) obtenidos a partir de un conjunto de imágenes de pila z y analizar fenotipos morfológicos y tinción de anticuerpos.
  2. Para el diagnóstico de los fenotipos tumorales, se centran principalmente en los siguientes tres puntos: (1) si una masa celular, incluyendo clones knockdown, se desvía de la capa epitelial principal, (2) si la localización subcelular de las proteínas de unión se altera en esta masa celular , Y (3) si el diámetro de esta masa celular es mayor que 4 células.
  3. Clasificar los fenotipos tumorales de acuerdo con el diagrama de flujo descrito en la Figura 1 .

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Resultados

Para demostrar la formación de tumores neoplásicos inducidos experimentalmente por RNAi mediada nTSG-knockdown en Drosophila ala imaginal discos, tres diferentes GAL4 conductores se utilizaron para expresar UAS-RNAi para lgl o scrib : (1) sd-GAL4, que impulsa fuerte UAS expresión en el Bolsa de ala y expresión suave en las regiones de bisagra ( Figura 2 y Figura 3A ); (2)

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Discusión

El sistema GAL4-UAS es una de las herramientas genéticas más potentes para la expresión génica dirigida en Drosophila 26 y facilita en gran medida la inducción y el análisis de células tumorales in vivo 4 . Este sistema permite la generación de clones que tienen knockdown de genes supresores de tumores o sobreexpresión de oncogenes dentro de tejido epitelial de tipo salvaje, una situación muy similar a las etapas iniciales de cáncer humano en donde las cé...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Damos las gracias a J. Vaughen por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de JSPS KAKENHI Grant Números 26891025, 15H01500 y la Fundación de Ciencias de Takeda Subvención de investigación a YT

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
salina tamponada >con
fosfato (PBS)Wako162-19321
TritonX-100Wako168-11805
FormaldehídoWako064-00406
albúmina sérica bovinaSigmaA7906
suero de cabra normalSigmaG6767
medio de montaje, VectashieldVector LaboratoriesH-1000
DAPISigmaD9542
mouse-anti-DLG 4F3Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas4F3 anti-discos grandes, RRID:AB_528203diluido en PBTG, 1:40
ratón-anti-MMP1 Banco deHibridomas3A6B4, RRID:AB_5797803 mezclado 1:1:1 y diluido en PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank3B8D12, RRID:AB_5797813 mezclado 1:1:1 y diluido en PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank5H7B11, RRID:AB_5797793 mezclado 1:1:1 y diluido en PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulinDevelopmental Estudios Banco de hibridomasAA4.3, RRID:AB_579793diluido en PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 FaloidinaSondas molecularesA22283diluido en PBS, 1:40
anticuerpo IgG anti-ratón en cabra, Alexa Fluor 546Sondas molecularesA11030diluidas en PBTG, 1:400
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Fly strains
sd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#8609recombinado con UAS-EGFP
upd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#26796recombinado con UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAiVienna Drosophila RNAi center#51247
UAS-scrib-RNAiVienna Drosophila RNAi center#105412
UAS-RasV12Bloomington Drosophila Stock Center#64196
UAS-Yki3SABloomington Drosophila Stock Center#28817
hsFLPBloomington Drosophila Stock Center#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)Bloomington Drosophila Stock Center#4780recombinado con UAS-EGFP
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#5428X cromosoma
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#6658tercer cromosoma
UAS-Dicer2Bloomington Drosophila Stock Center#24650segundo cromosoma
UAS-Dicer2Bloomington Drosophila Stock Center#24651tercer cromosoma
vkg-GFPMorin et al. 2001Trampa de proteínas GFP

Referencias

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