Aislamiento de Pericitos Tipo I y Tipo II de Músculos Esqueléticos de Ratón

Resumen

Este trabajo describe un protocolo basado en FACS que permite el aislamiento fácil y simultáneo de pericitos tipo I y tipo II de los músculos esqueléticos.

Resumen

Los pericitos son células multipotentes perivasculares que muestran heterogeneidad en diferentes órganos o incluso dentro del mismo tejido. En los músculos esqueléticos, existen al menos dos subpoblaciones pericíticas (llamadas tipo I y tipo II), que expresan diferentes marcadores moleculares y tienen distintas capacidades de diferenciación. Utilizando ratones doblemente transgénicos NG2-DsRed y Nestin-GFP, se han aislado con éxito los pericitos de tipo I (NG2-DsRed ⁺ Nestin-GFP-) y de tipo II (NG2-DsRed ⁺ Nestin-GFP ⁺ ). Sin embargo, la disponibilidad de estos ratones doblemente transgénicos impide el uso generalizado de este método de purificación. Este trabajo describe un protocolo alternativo que permite el aislamiento fácil y simultáneo de los pericitos tipo I y tipo II de los músculos esqueléticos. Este protocolo utiliza la técnica de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y objetivos PDGFR β, en lugar de NG2, junto con la señal de Nestin-GFP. Después del aislamiento, el tipo I y tyLos pericitos pe II muestran morfologías distintas. Además, los pericitos tipo I y II aislados con este nuevo método, como los aislados de los ratones doblemente transgénicos, son adipogénicos y miogénicos, respectivamente. Estos resultados sugieren que este protocolo puede usarse para aislar las subpoblaciones pericíticas de los músculos esqueléticos y posiblemente de otros tejidos.

Introducción

La distrofia muscular es un trastorno músculo-degenerativo que no tiene tratamientos efectivos hasta el momento. El desarrollo de terapias que promueven la regeneración tisular siempre ha sido de gran interés. La regeneración y reparación de los tejidos después del daño dependen de las células madre / células progenitoras residentes ¹ . Las células satélite son células precursoras miogénicas comprometidas que contribuyen a la regeneración muscular ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 ,}

Protocolo

Wildtype y Nestin-GFP ratones transgénicos se alojaron en la instalación de animales en la Universidad de Minnesota. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Minnesota y estaban de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Disección muscular y aislamiento monocelular

1. Euthanize ratones adultos (6-10 semanas, ambos hombres y mujeres) con tribromoetanol (250 mg / kg, ip) y esterilizar su piel abdomen con etanol al 70%.
   NOTA: Se utilizó tribrometanol en lugar de ketamina para anestesia / eutana....

Resultados

Los parámetros FACS, incluyendo la intensidad del láser y la compensación del canal, se corrigen en base a los resultados del control sin color y de los controles de un solo color. El control PDGFR beta - PE - FMO se usa para establecer el gating para la población PDGFR beta - PE ⁺ ( Figura 1A ). Entre las células PDGFR β-PE, dos poblaciones que representan Nestin-GFP ⁺ y Nestin-GFP ^- células están claramente separados (

Discusión

Los pericitos son células perivasculares multipotentes ^{22 , 23} localizadas en la superficie abluminal de los capilares ^{21 , 26} . En los músculos esqueléticos, los pericitos son capaces de diferenciarse a lo largo de las vías adipogénicas y / o miogénicas ^{19 , 20 , 24} . Estudios recientes revelaron dos subpoblaci.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clasificador de células	Sony	SH800
Cuentas de configuración automática	Sony	LE-B3001
DMEM	Gibco	11995
Avertin	Sigma	T48402
Medio de crecimiento pericito	ScienCell	1201
MSC Medio basal (ratón)	Stemcell Technologies	5501
Suplemento estimulante adipogénico (ratón)	Stemcell Technologies	5503
Suero fetal bovino	Gibco	16000
Suero de caballo	Sigma	H1270
Colagenasa Tipo 2	Worthington LS004176
0.25% Tripsina / EDTA	Gibco	25200
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140
PDL	Sigma	P6407
PDGFRβ-PE Anticuerpo	eBioscience	12-1402
Anticuerpo de perilipina	Sigma	P1998
Anticuerpo S-miosina	DSHB	MF-20
Alexa 555-anti-anti-conejo& nbsp;	ThermoFisher Scientific	A-31572
Alexa 555-anticuerpo anti-ratón	ThermoFisher Scientific	A-31570
Medio de montaje con DAPI	Vector Laboratories	H-1200
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306
HEPES	Gibco	15630
EDTA	Fisher	BP120
BSA	Sigma	A2058
NH4Cl	Fisher Scientific	A661
KHCO3	Fisher Scientific	P184
PBS	Gibco	14190
Agujas de 18 g	BD	305196
10 mL Pipeta serológica	BD	357551
OneComp	eBeads eBioscience	01-1111