Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Resumen

Este manuscrito describe métodos para aplicar la tecnología de microarrays de péptidos a la especificidad de perfiles de anticuerpos que reconocen las histonas y sus modificaciones post-traduccionales.

Resumen

Las modificaciones postraduccionales (PTMs) en las proteínas histonas son ampliamente estudiadas por sus papeles en la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica. La producción en masa y la distribución de anticuerpos específicos de histonas PTMs ha facilitado enormemente la investigación sobre estas marcas. Como los anticuerpos histónicos PTM son reactivos clave para muchas aplicaciones de bioquímica de la cromatina, es necesario un análisis riguroso de la especificidad del anticuerpo para una interpretación precisa de los datos y un progreso continuo en el campo. Este protocolo describe una tubería integrada para el diseño, fabricación y uso de microarrays peptídicos para perfilar la especificidad de los anticuerpos histona. Los aspectos de diseño y análisis de este procedimiento son facilitados por ArrayNinja, un paquete de software interactivo y de código abierto que recientemente desarrollamos para simplificar la personalización de los formatos de impresión en microarrays. Este gasoducto se ha utilizado para examinar un gran número de anticonceptivos de histonas PTM comercialmente disponibles y ampliamente utilizadosS, y los datos generados a partir de estos experimentos están disponibles gratuitamente a través de una base de datos en línea y en expansión Histone Antibody Specificity. Más allá de las histonas, la metodología general aquí descrita puede aplicarse ampliamente al análisis de anticuerpos específicos de PTM.

Introducción

El ADN genómico se empaqueta elegantemente dentro del núcleo de la célula eucariota con proteínas histonas para formar cromatina. La subunidad de repetición de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pares de bases de ADN envueltas alrededor de un núcleo octameric de las proteínas histonas - H2A, H2B, H3 y H4 ¹ . La cromatina se organiza ampliamente en euchromatina libremente envasada y dominios de heterocromatina fuertemente envasados. El grado de compactación de la cromatina regula la medida en que las máquinas de proteínas pueden acceder al ADN subyacente para llevar a cabo procesos fundamentales basados ​​en el ADN, como la repl....

Protocolo

1. Instalación y ejecución de ArrayNinja

1. Descargue e instale Oracle Virtual Box desde www.virtualbox.org.
2. Descargue y descomprima la máquina virtual ArrayNinja (VM) de http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
3. Abra Virtual Box y agregue la VM ArrayNinja haciendo clic en 'Machine', 'Add' y seleccione arrayninja.vbox en la carpeta donde se guardó VM ArrayNinja.
4. Inicie ArrayNinja seleccionándolo dentro de Virtual Box y haciendo clic en la flecha verde de inicio.
5. Virtual Box abrirá una nueva ventana y mostrará un mensaje indicando que se puede acceder a la VM navegando el navegador web a localhost: 2080.6....

Resultados

Este protocolo se ha utilizado para diseñar y fabricar una plataforma de microarrays de péptidos para el análisis de la especificidad de anticuerpos histona PTM. El array consulta una biblioteca de más de 300 características únicas de péptidos (20 - 40 residuos de longitud) que representan muchas de las combinaciones conocidas de PTMs que se encuentran en el núcleo y la variante de las proteínas histonas [ ^38] . Este gasoducto ha sido un caballo de batalla para el.......

Discusión

La fiabilidad de los anticuerpos en aplicaciones de investigación biomédica es fundamental ^{46 , 47} . Esto es especialmente cierto en la bioquímica de la cromatina dada la posición de los anticuerpos como herramientas clave para la mayoría de las técnicas desarrolladas para caracterizar la abundancia y distribución de histonas PTMs. El protocolo presentado aquí detalla un oleoducto optimizado para el diseño, fabricación y uso de microarrays de péptidos para anali.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Búfer de impresión	ArrayIt	PPB
BSA	Omnipure	2390
Portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de estreptavidina	Greiner Bio-one	439003-25
polipropileno Placa de 384 pocillos	Greiner Bio-one	784201
Biotina-fluoresceína	Sigma	53608
impresora de microarrays de contacto	Aushon	2470	Aushon 2470 Impresora de microarrays Contacto
de microarrays	Gene Machines	OmniGrid 100	OmniGrid Impresora de microarrays
PBS	Invitrogen	14190
Blocking Buffer ArrayIt		SBB
Bolígrafo de cera hidrofóbico	Vector Labs	H-4000	ImmEdge Barrera hidrofóbica Bolígrafo PAP
de silicona Junta	Grace Bio-labs	622511
Recipiente de hibridación	Thermo Scientific	267061	o similar
Anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente	Life Technologies	A-21244	Alexa Fluor 647 (anti-conejo)
Anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente	Life Technologies	A-21235	Alexa Fluor 647 (anti-ratón)
Cera Imprinter	ArrayIt	MSI48
Tween-20	Omnipure	9490
Escáner de microarrays	Innopsys	InnoScan 1100AL	o equivalente Escáner
de microarrays EipTitan Histone Peptide Microarray	Epicypher	112001
AbSurance Pro Histone Microarray de péptidos	Millipore	16668
MODified Histone Matriz de péptidos	Active Motif	13001
Código de histonas Microarrays de péptidos	JPT	His_MA_01
cera	Oak	GulfWax	para impresora de cera
Microarray humidificado cámara de hibridación de portaobjetos	VWR	97000-284
Microscopio de alto rendimiento cámara de lavado de portaobjetos	ArrayIt	Microscopio HTW
centrífuga de corredera	VWR	93000-204
Anticuerpo 1	Abcam	8898
Anticuerpo 2	Millipore	07-473
Péptido de histonas biotiniladas	EpiCypher	12-0001	Ejemplo de péptido. Péptidos similares con diversas modificaciones están disponibles en varias fuentes comerciales.
ImageMagick			https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja			https://rothbartlab.vai.org/tools/

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