Summary
Syrenettkondisjonering beskytter mot cerebral iskemi. Her presenterer vi to modeller for å utføre APC. De er oppnådd henholdsvis ved overføring corticostriatal skiver til sur buffer etter oksygen-glukosemangel in vitro, og ved inhalering 20% CO2 etter tilstopping av midtre cerebralarterie in vivo.
Abstract
Stroke er en av de viktigste årsakene til dødelighet og funksjonshemning over hele verden, med begrensede terapeutiske tilnærminger. Som en endogen strategi for nevrobeskyttelse har etterbehandlinger vist seg å være lovende behandlinger mot cerebral iskemi. Imidlertid begrenser kompliserte prosedyrer og potensielle sikkerhetsproblemer deres kliniske anvendelse. For å overvinne disse ulempene har vi utviklet sur postconditionering (APC) som en terapi for eksperimentell fokal cerebral iskemi. APC refererer til mild acidosebehandling ved inhalering av CO 2 under reperfusjon etter iskemi. Her presenterer vi to modeller for å utføre APC in vitro og in vivo , henholdsvis. Oksygen-glukoseavrivning (OGD) -behandlingen av mus og kortikostriatal okklusjon og midtre cerebral arterie okklusjon (MCAO) av mus ble anvendt for å etterligne cerebral iskemi. APC kan enkelt oppnås ved å overføre hjerneskiver til sur buffer boblet med 20% CO 2 , oR av mus som inhalerer 20% CO 2 . APC viste signifikante beskyttende effekter mot cerebral iskemi, som reflektert av vevslevbarhet og hjerneinfarktvolum.
Introduction
Stroke er en av de viktigste årsakene til dødelighet og funksjonshemming over hele verden. Stor innsats har blitt gjort for å finne effektive behandlinger for slag i de siste tiårene, men prestasjonen er ganske utilfredsstillende. Postkondisjonering er en prosess manipulert av subtoksiske påkjenninger etter en iskemisk episode. Postkondisjonering, inkludert iskemisk, hypoksisk, lav-glukose og fjern iskemisk postkondisjonering, utløser endogene adaptive mekanismer, og har vist seg å være lovende behandlinger mot cerebral iskemi 1 , 2 , 3 , 4 . Imidlertid kan iskemisk postkondisjonering innføre ytterligere skade. Lim fjernkontroll iskemisk postkonditionering trenger vanligvis flere sykluser med 5-20 min okklusjon og reperfusjon på de ipsilaterale eller bilaterale bakbenene 5 , 6 , 7 . thDerfor er disse etterbehandlingsmanipulasjonene farlige eller upraktiske i klinisk praksis. For å overvinne disse ulempene har vi utviklet APC som en terapi for fokal cerebral iskemi hos mus 8 . Inducert ganske enkelt ved å inhalere 20% CO 2 , reduserer APC signifikant iskemisk hjerneskade på en mer gjennomførbar og tryggere måte. Nylig har vi bevist at APC utvider reperfusjonsvinduet, og understreker betydningen av APC for slagbehandling 9 .
Her presenterer vi to eksperimentelle modeller for å studere nevrobeskyttelsen av APC mot cerebral iskemi. Den første er oksygen-glukose mangel (OGD) modell i mus kortikostriatale skiver. Hurtig forberedelse og overføring av hjerneskiver til et kunstig miljø, vanligvis kunstig cerebrospinalvæske (ASCF), kan opprettholde cellelevbarhet og neuronalkretser, noe som gjør det mulig å studere hjernens funksjon in vitro 10 <Sup>, 11 . OGD i ASCF etterligner cerebral iskemi og induserer iskemisk skade 12 , 13 , 14 . Etter OGD blir hjernesnittene oppdatert i vanlig ASCF (r-ASCF) for å gi reperfusjon og deretter behandlet med APC ved å bruke sur ASCF boblet med 20% CO 2 . Kortikostriatalskiven opprettholder den intakte histologiske karakteriseringen sammenlignet med primære dyrkede celler.
For å studere hjernefunksjon in vivo , er musens midtre cerebral arterie okklusjon (MCAO) modell benyttet. Den midtre cerebrale arterien er blokkert ved å sette inn en flammeformet monofilament via den felles halspulsåren. Som en av de mest brukte stroke-modellene, viser MCAO-modellen klinisk relevans, og anvendelsen av en monofilament gjør det lettere å oppnå reperfusjon. Simpelthen ved å inhalere normoksisk blandet gass inneholdende 20% CO2 etter utbruddet av reperfusioN, viste APC signifikante beskyttende effekter mot cerebral iskemi, indisert ved redusert hjerneinfarktvolum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble godkjent av og utført i samsvar med de etiske retningslinjene fra Zhejiang University Animal Experimentation Committee og var i full overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for pleie og bruk av laboratoriedyr. Det ble gjort anstrengelser for å minimere smerte eller ubehag, og det minste antall dyr ble brukt.
1. OGD av kortikostriatale skiver
- Løsning forberedelse:
- Forbered 1000 ml r-ACSF (124 mmol / l, NaCl, 5 mmol / l KCl, 1,25 mmol / l KH 2PO 4, 2 mmol / l MgSO4, 26 mmol / l NaHCO3, 2 mmol / l CaCl2, 10 mmol / l glukose, slutt pH 7,4). Boble med 5% CO 2 og 95% O 2 gjennom hele forsøket.
- Forbered 200 ml glukosefri ACSF (gf-ACSF) som ovenfor, men unntatt glukose, boblet med 5% CO 2 og 95% N 2 . Boble gassene i 30 minutter før du setter på brAi skiver for å redusere oksygeninnholdet i løsningen. Fortsett å boble til OGD-prosedyren er ferdig.
- Forbered sur ACSF (a-ACSF) ved å ekvilibrere 200 mL r-ACSF med 20% CO 2 og 80% O 2 . Boble gassene i 30 minutter før du bruker på hjerneskiver for å redusere pH i oppløsningen til pH 6,8, og fortsett å boble til APC-prosedyren er ferdig.
- Plasser tre vevholdere i henholdsvis r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF.
- Hjerneskive forberedelse:
Merk: 8 uker gamle, mannlige C57Bl / 6J mus ble brukt i denne studien. Dyrene ble plassert under kontrollert temperatur (22 ± 2 ° C), med en 12 timers mørk syklusperiode og tilgang til pelleterte mat og vann.- Offer en mus med en isofluran overdose i et induksjonskammer. Dekapitere musen. Dissect ut hjernen ved hjelp av små saks og pincet. Fjern hjernen med en tynn spatel og slipp den forsiktig inn i en glassbukkerkonfigurasjonÅ holde iskall r-ACSF likeverdig med 5% CO 2 og 95% O 2 .
MERK: Disse trinnene skal gjøres så raskt, men omhyggelig som mulig. - Hold hjernen i iskall r-ACSF i 5 minutter. Juster gasstrykket for å unngå hjernens bevegelser.
- Legg cryoprecipitate lim på vibratomeplaten i to striper. Sett et stykke 3% agarose på limstrimmelen vekk fra bladet for å støtte hjernen.
- Inverter en 10 cm petriskål på is og legg deretter et filterpapir på fatet. Fukt filterpapiret med dråper iskaldt r-ACSF.
- Overfør hjernen til filterpapiret med tang. Klipp av frontpolen og hjernebenet med blad og tang.
MERK: Tverrsnittene skal være så glatte som mulig og vertikalt til sagittalplan. - Plasser gjenværende hjernevev vertikalt på den andre limstrimmelen og hold hjernen lent mot agarosen. Tilsett iskaldt r-ACSF til kuttebeholderen tilSenke hjernen og legge is til isholderen. Hold r-ACSF i reservoaret boblet med 5% CO 2 og 95% O 2 .
- Løft opp reservoaret og juster barbermaskinens posisjon for å plassere barbermaskinen så nær hjernen som mulig og like over hjernen.
- Velg "CONT" -modus for å kutte hjerneseksjonene kontinuerlig. Still kuttetykkelsen til 400 μm, vibreringsfrekvensen til 6-8, og hastigheten til 3 - 4. Trykk på start / stopp-knappen for å starte automatisk kutting.
- Klipp av spissen av en 3 ml Pasteur pipette for å lage en åpning som passer til størrelsen på hjerneskiver.
MERK: Åpningen skal være stor nok til å unngå ekstra skade på hjerneskiver. - Trekk ut fem hjerneskiver en etter en med tip-cutPasteur pipetten og legg dem inn i vevholderen i iskall r-ACSF boblet med 5% CO 2 og 95% O 2 . Ikke samle den første delen produsert. Juster gasstrykket til avoiD bevegelser av hjerneskiver.
MERK: Hjerneskiver bør ikke dekke hverandre. - Plasser hjerneskiver med r-ACSF ved romtemperatur i 30 minutter og deretter ved 37 ° C i et vannbad i ytterligere 10 minutter for å gjenvinne synaptiske funksjoner.
- Offer en mus med en isofluran overdose i et induksjonskammer. Dekapitere musen. Dissect ut hjernen ved hjelp av små saks og pincet. Fjern hjernen med en tynn spatel og slipp den forsiktig inn i en glassbukkerkonfigurasjonÅ holde iskall r-ACSF likeverdig med 5% CO 2 og 95% O 2 .
- OGD og APC:
- Plasser gf-ACSF og a-ACSF i et 37 ° C vannbad og boble buffrene med de tilsvarende gassene som nevnt ovenfor i 1.1.2 og 1.1.3 i 30 minutter.
- Legg en skive i r-ACSF som en kontroll. Overfør de fire andre hjerneskiver i vevholderen med forvarmet gf-ACSF forsiktig og inkuber i 15 minutter. Overfør skivene tilbake i vevholderen i r-ACSF for å oppnå reperfusjon.
- For å studere tidsvinduet til APC, overfør ett stykke direkte fra gf-ACSF til a-ACSF. Overfør de andre tre skivene til r-ACSF i begynnelsen, og overfør deretter to av dem til vevholderen i henholdsvis a-ACSF 5 og 15 min etter reperfusjon.
- IncubatE de to skiver i a-ACSF i 3 minutter og overfør dem deretter tilbake til r-ACSF. Inkubér de tre skivene i r-ACSF i ytterligere 1 time. Sett de resterende skivene i r-ACSF som OGD-gruppen.
- For en doseresponsstudie, overfør alle fire stykker til vevholderen i r-ACSF først etter OGD og inkuber i 5 minutter. Deretter legger du en skive i r-ACSF som OGD-gruppen og overfører de andre tre skivene til a-ACSF. Inkubér skivene i a-ACSF i henholdsvis 1, 3 og 5 minutter og overfør dem deretter tilbake til r-ACSF. Inkubér de tre skivene i r-ACSF i ytterligere 1 time.
- Slice viability bestemmelse:
- Forbered 0,25% 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydroklorid (TTC) normal saltoppløsning. Tilsett 1,25 g TTC pulver til 500 ml normal saltløsning.
MERK: Etter at pulveret er fullstendig oppløst, overfør oppløsningen til en brønn på 24 brønner (500 μL per brønn) dekket i folie og oppbevar den ved 4 ° C. TTC og vev farget med TTC er lett senmerksomme. - Overfør skiver i en 24-brønn plate (en skive per brønn) som inneholder TTC-løsning og strekk ut skiven i løsningen. Inkuber skiver i TTC-oppløsning ved 37 ° C i et grunt vannbad i 30 minutter.
- Overfør skivene til rene 1,5 ml sentrifugerør som er dekket av folie og måler tørkvekten på skivene.
- Tilsett etanol / dimetylsulfoksid (1: 1) i sentrifugerørene (v: w = 10: 1) for å ekstrahere formazan. Inkubér skiver i etanol / dimetylsulfoksid ved romtemperatur unna lys i 24 timer.
- Tilsett all etanol / dimetylsulfoksid i rørene inn i en 96-brønn plate og måler absorbansen ved 490 nm ved hjelp av en plateleser.
- Normaliser absorbansen til tørrvekten på skiven og uttrykk levedyktighet som prosentandel av kontrollskive.
- Forbered 0,25% 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydroklorid (TTC) normal saltoppløsning. Tilsett 1,25 g TTC pulver til 500 ml normal saltløsning.
2. MCAO
- Forberedelse:
- Desinfiser arbeidsbenken, overflaten av Laser Doppler FlowmetrY (LDF) instrument og tilbehør med 70% etylalkohol.
- Forbered autoklaverte instrumenter: to saks, 10 cm; To tang, 10 cm; En oftalmisk pincet, 11 cm; En mikro oftalmisk saks, 9 cm; En microvessel klemme, 1,8 cm; Oneneedle drive, r 12,5 cm; Flere kirurgiske suturer (△ 1/2 4 × 10); bomullspinner.
- Klargjør en sprøyte (uten nål) med saltoppløsning for å opprettholde et hydratisert operasjonsområde.
- Forbered anestesi-gassen (100% O 2 + isofluran).
- Påvisning av hjerneblodstrømning:
- Sett opp LDF instrumentet.
- Injiser analgetika intraperitonealt i musen: metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg og buprenorfin 0,1 mg / kg.
- Plasser musen inn i et induksjonskammer med 4% isofluran i oksygen for å bedøve det til spontan bevegelse av kropp og vibrasjoner stopper.
- Plasser musen i en utsatt posisjon med nesen montert inn i denE nese kjegle og opprettholde isofluran ved 1,5% for den påfølgende prosedyre.
- Påfør dexpanthenol øyesalve på begge øynene.
- Desinfiser hodet med 70% etylalkohol.
- Lag en riktig paramedian hud snitt mellom øyne og ører ved hjelp av en skalpell å eksponere bregma.
- Gni skallen med steril bomull.
- Påfør en til to dråper kirurgisk lim til overflaten av skallen.
- Plasser spissen av fiberoptisk sonde 5 mm caudal til bregma og 6 mm lateral til midtlinjen.
- Begynn å registrere blodstrømmen på dataprogrammet. Vent til en stabil blodstrømningsgrunnlinje oppstår, og bruk deretter en 20 μl katalysator på limen for å fikse sonden.
MERK: En ideell baseline bør være mer enn 500 flux. - Hvis grunnlinjen er mindre enn 200 fluss, juster du stillingen fint for å få en passende grunnlinje. Hold sonden festet til skallen for eksperimentets varighet.
- Desinfiser hodet med iodophor afFor fiberoptisk sonde festet.
- MCAO:
- Plasser og fest den bedøvede musen (med LDF-sonde festet til skallen) i en bakre stilling og opprettholde kroppstemperaturen ved hjelp av en varmelampe gjennom hele operasjonen. Desinfiser nakken med 70% etylalkohol.
- Lag en paramedian hud snitt i nakken ved hjelp av en skalpell; Sløv dissekere det myke vevet med tau for å utsette fartøyene. Tilsett en dråpe saltvann til det eksponerte vevet for å holde dem dehydrert.
- Dissect den vanlige karoten arterien fra omkringliggende vev og vagus nerve ved hjelp av oftalmiske pincet. Pass på å ikke skade vagusnerven. Desinfiserer huden på nakken igjen med jodforen etter at den vanlige karoten arterien er eksponert.
- Plasser en microvessel klemme ved den distale enden av den vanlige halspulsåren og bind deretter en død knute med 6-0 silke suturer ved den proksimale enden. Legg klemmen så proksimal som mulig for etterfølgende operasjoner. Pass på at lengden påFartøyet mellom klemmen og den døde knuten er så lang som mulig for påfølgende operasjoner.
- Lag en midlertidig sutur proksimal til klemmen ved å knytte en løs knute. Sørg for at det er nok plass mellom to knuter for monofilamentinnføring.
- Lag et smalllongitudinal snitt mellom de to knottene med mikro øyelimssaks. Sørg for at snittet er så nær den døde knuten som mulig for etterfølgende operasjoner. Vær forsiktig så du ikke skar av båten.
- Sett inn en 12 mm stikkontakt med monofilament gjennom snittet for å gå inn i arterien lumen og forover det noen få mm. Trekk løs knuten rundt monofilamentets spiss, og fjern deretter klemmen.
- Før filamentet inn i den indre halspulsåren (10 mm for å trekke den midtre cerebrale arterien) med oftalmiske pincett inntil LDF-programvaren viser en kraftig tilbakegang (> 80% reduksjon fra blodstrømmen i blodet) i blodstrømmen. Ta opp starttidspunktet for okklusjon.
MERK: LDF instrumentoppsett erBeskrevet i avsnitt 2.2. - Unngå den midtre cerebrale arterien i 1 time. Klipp av LDF-sonden og sett musene i en 30 ° C inkubator i løpet av okklusjonen.
- Reperfusjon og APC:
- Nybedøve dyrene med isofluran som beskrevet over 55 minutter etter begynnelsen av okklusjonen. Plasser og fest mus i en bakre stilling. Åpne halsinnsnittet og gjenta den vanlige halspulsåren.
- Trekk forsiktig ut filamentet med oftalmiske tang etter okklusjonsperioden for å oppnå reperfusjon og slå den midlertidige suturen til en permanent ved å stramme knuten.
- For acidose behandling, endre gass pustes inn av nesekonusen følgende blande gasser som inneholder 20% CO2, 20% O2 og 60% N2 i 5 min ved 5, 50, eller 100 minutter etter reperfusjon. Lukk snittet med en avbrutt kirurgisk sutur.
- Plasser mus i en 30 ° C varmekur til musene gjenoppretter bevissthetenOg så returner musene til å rengjøre, individuelle bur. Gi mus med en petriskål med vann og fuktig mat. Overvåk musene tett etter operasjonen for overdreven smerte og død.
- Hjerneinfarktvolummåling:
- Mål hjerneinfarktvolum ved å bruke TTC-farging 24 timer etter reperfusjon.
- Klargjør 0,25% TTC-løsning som nevnt i trinn 1.4.1 før den angitte tidspunktet for ofringen. Overfør oppløsningen til en brønn med 24 brønner (1 ml per brønn) dekket i folie og oppbevar den ved 4 ° C.
MERK: TTC og vev farget med TTC er lysfølsomme. - På 24 timer etter reperfusjon, ofre dyret med en isofluran overdose i et induksjonskammer. Dekapitere musene. Dissect hjernene ved hjelp av små saks og tang. Undersøk bloding poeng på hjernen for å ekskludere musene som gjennomgikk subarachnoid blødning på Circle of Willis.
- Plasser hjernen på en ren glidelås på -20 ° ; C ispakke Plasser hjernen og glassglasset i en -20 ° C kjøleskap i 5 minutter for å gjøre hjernen lettere å skjære.
- Ta ut hjernen og glassglasset fra -20 ° C og legg dem tilbake på -20 ° C ispakken. Disseksér frontpolen og hjernebenet med blad og pinn.
- Skjær hjerneseksjonene horisontalt til en 1 mm tykkelse med et blad for å produsere 5 skiver. Overfør stykkene i 24-brønnsplaten med TTC-oppløsning (1 stykke per brønn) med tang og strekk ut skiver i løsningen. Inkuber skiver i TTC-oppløsning ved 37 ° C i et grunt vannbad i 30 minutter.
- Aspirer TTC-løsningen. Tilsett 10% formaldehyd (1 ml per brønn) og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Plasser skivene i rekkefølgen der de ble kuttet på et cellofanark og skann segmentene inn i fotografisk plateimager.
- Analyser infarktstørrelsen som en prosentandel av hele hjerneskiven ved hjelp av ImageJ analysesoftwareLass = "xref"> 8 basert på visuell identifikasjon; Se figur 2 (til venstre).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den kortikostriatale skivemodellen som er beskrevet ovenfor, ble korticostriatal skivelevbarhet kvantifisert ved TTC-analyse ved 1 time etter reperfusjon. TTC-konvertering ble beregnet ved å normalisere absorpsjonen ved 490 nm til kontrollskiven. I henhold til TTC-konvertering, beskyttes APC mot OGD-indusert reperfusjonsskade i en starttid og varighetsavhengig måte. I detalj ble både 1 og 3 min acidosisbehandling signifikant forbedret levedyktighet ved 5 min etter 15 min OGD, mens 5 min ikke (OGD: 0,609 ± 0,029, 5/1: 0,758 ± 0,034, 5/3: 0,821 ± 0,041, 5/5: 0,672 ± 0,053, data rapportert som gjennomsnittlig ± SEM) ( Figur 1 A ). Nevrobeskyttelsen ved acidosebehandling forblir beskyttende innen 5 minutter etter reperfusjon, mens 15 minutter ikke (OGD: 0,584 ± 0,044, 0/3: 0,762 ± 0,036, 5/3: 0,833 ± 0,062, 15/3: 0,627 ± 0,038) ( Figur 1 B ).
I MCAO-modellen ble 5 minutter med acidosebehandling initiert etter 5 minutter etter utbruddet av reperfusjon reddet celledød forårsaket av iskemisk fornærmelse, reflektert av mindre infarktvolumer (MCAO: 33,4 ± 4,4%, 5/5: 16,6 ± 2,7%, 50 / 5: 19,5 ± 2,1%, 100/5: 37 ± 2,1%). Nevrobeskyttelsen var fortsatt robust, selv når startetiden ble forsinket til 50 minutter etter reperfusjon. Imidlertid blokkerte acidosisbehandling på 100 minutter ikke de iskemiske skaderne ( Figur 2 ).
Alle data ble samlet og analysert på blindet måte. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. I kortikostriatalisk modell har hver gruppe 6-8 prøver. I MCAO-modellen har hver gruppe 9-10 prøver. Enveisanalyse av varians med minst signifikant forskjell ble anvendt for flere sammenligninger.
Figur 1 . APC beskytter mot OGD-indusert Reperfusjonsskade i kortikostriatale skiver. Kortikostriatale skiver ble behandlet med acidose (pH 6,8) for indikert varighet (A) og indikerte gjenvinningsperioder (B) etter OGD. Cellelevbarheten ble vurdert ved hjelp av 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid-analysen ved 24 timer etter reperfusjon, og levetid for kortikostriatal skive ble kvantifisert ved TTC-analyse ved 1 time etter reperfusjon. Verdier viser gjennomsnittlig ± SEM. N = 6 - 8 for hver gruppe; * P <0,05 og ** p <0,01 ved enveisanalyse av varians; R, reperfusjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 . APC beskytter mot MCAO-indusert skade i mus. Dyr ble utsatt for 60 min MCAO og behandlet ved inhalering av 20% C02 i 5 minutter ved 5, 50 eller 100 minutter etter reperfusjon. Infarct volum ble kvantifisert ved 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydrokloridfarging ved 24 timer etter reperfusjon (indikert med svart prikket linje på venstre panel). Verdier viser gjennomsnittlig ± SEM. N = 8 - 10 for hver gruppe; * P <0,05 og ** p <0,01 ved enveisanalyse av varians; R, reperfusjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi to eksperimentelle modeller for å studere nevrobeskyttelsen av APC mot cerebral iskemi. I hjerneskiver, blir APC oppnås ved inkubering av mus corticostriatal skivene i sur buffer boblet med 20% CO2 etter reperfusjon utbruddet, mens i den MCAO-modellen, er APC oppnås ved å inhalere 20% CO 2 til mus etter reperfusjon. Begge modellene gjenspeiler nevrobeskyttelsen av APC mot cerebral iskemi. Beskyttelsen var sammenlignbar med det som ble oppnådd ved iskemisk etterkondisjonering, men med et bredere tidsvindu. I MCAO-modellen kan tidsvinduet være så lenge som 50 min etter reperfusjon sammenlignet med 10 min for iskemisk etterkondisjonering 15 . I tillegg er prosedyren for APC lettere og sikrere.
I kortikostriatalskivemodellen er milde og raske operasjoner avgjørende for å garantere levedyktigheten til hjerneskiver i størst mulig grad. For MCAO-ytelsen er den cerebrale blodstrømovervåkingenKreves, og den kraftige nedgangen i blodstrømmen må observeres for å sikre okklusjon av den midtre cerebrale arterien. Etter at hjernene ble spaltet ut for TTC-farging, er en nøye undersøkelse av hjernen nødvendig for utelukkelse av subaraknoidblødning.
Forlengelsen og varigheten av acidose er kritiske for å oppnå nevrobeskyttelse av APC. Langvarig varighet av acidosebehandling er ikke gunstig i kortikostriatalskiver modell ( Figur 1 A ). I tillegg viste vår tidligere studie at både 10% og 20% CO 2 -inhalasjon, i stedet for 30% CO 2 -inhalasjon, gir neuroproteksjon på mus 8 . Disse antyder mild acidose er avgjørende for nevrobeskyttelsen av APC, og derfor er konsentrasjonen av CO 2 og varigheten av APC uunnværlig for acidose nevrobeskyttelse.
I tillegg til TTC-farging, kan mange teknikker kombineres til sÅ forske på mangfoldige forskningsbehov. For eksempel kan ekstracellulær elektrisk opptak legges til det siste trinnet for å observere hvordan iskemi og acidose påvirker nevrale potensial 16 . Perfusjonsløsningen av hjerneskive kan også samles for å måle konsentrasjonsendringen av aminosyre-neurotransmittere etter APC ved HPLC 17 . Skiver av bestemte hjernegrupper kan være forberedt på å studere responsene fra et bestemt område til iskemi og APC. Samlet sett kan mange alternativer innføres for å belyse virkningen av iskemi og acidose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 og 81402907), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (LR15H310001) og programmet for Zhejiang ledende team av S & T innovasjonsteamet (2011R50014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C5080 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride | Sigma | T8877 | |
| Absolute Ethanol | Aladdin Industrial Corporation | E111993 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Laser Doppler Flowmetry | Moor Instruments Ltd | Model Moor VMS-LDF2 | |
| Diethyl ether anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 80059618 | |
| Trichloroacetaldehycle hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 30037517 | |
| 10% Formalin | Aladdin Industrial Corporation | F111936 | |
| 24-well plates | Jet Biofil | TCP-010-024 |
References
- Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).
- Leconte, C., et al. Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse. Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).
- Fan, Y. Y., et al. Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection. CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).
- Hess, D. C., Hoda, M. N., Bhatia, K. Remote limb perconditioning [corrected] and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke. Stroke. 44 (4), 1191-1197 (2013).
- Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats. Brain Res. 1288, 88-94 (2009).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (5), 851-859 (2012).
- Li, P., et al. Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice. Int J Neurosci. , 1-8 (2015).
- Fan, Y. Y., et al. A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).
- Shen, Z., et al. PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window. Autophagy. 0, (2017).
- Skolnik, J., Takacs, L., Szende, E. In vitro oxygen consumption of slices from kidney, brain, cortex and liver in hypoxia. Nature. 209 (5020), 305 (1966).
- Lynch, G., Schubert, P. The use of in vitro. brain slices for multidisciplinary studies of synaptic function. Annu Rev Neurosci. 3, 1-22 (1980).
- Zheng, S., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces purkinje cell death in an in vitro model of rat cerebellar ischemia. Neuroscience. 118 (1), 99-106 (2003).
- Yin, B., Barrionuevo, G., Weber, S. G. Optimized real-time monitoring of glutathione redox status in single pyramidal neurons in organotypic hippocampal slices during oxygen-glucose deprivation and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 6 (11), 1838-1848 (2015).
- Medvedeva, Y. V., Ji, S., Yin, H. Z., Weiss, J. H. Differential vulnerability of CA1 vs CA3 pyramidal neurons after ischemia: possible relationship to sources of Zn2+ accumulation and its entry into and prolonged effects on mitochondria. J Neurosci. , (2016).
- Pignataro, G., et al. In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 232-241 (2008).
- Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice. Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).
- Niu, Y., et al. Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia. J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).
