Method Article

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

DOI:

10.3791/55942

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December 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelos murinos de enfermedad son indispensables para la investigación científica. Sin embargo, muchas herramientas de diagnostico como la endoscopia o la proyección de imagen tomográfica no se emplean rutinariamente en modelos animales. Lecturas experimentales convencionales a menudo se basan en análisis post mortem y ex vivo , que evitar las citas de seguimiento intra individuales y aumentan el número de animales de estudio necesitada. Tomografía mediado fluorescencia permite la evaluación no invasiva, repetitiva, cuantitativa, tridimensional de sondas fluorescentes. Es muy sensible y permite el uso de los fabricantes de moleculares, que permite la detección específica y la caracterización de distintas dianas moleculares. En particular, las puntas de prueba específicas representan una herramienta innovadora para el análisis de genes de activación y de la proteína en inflamación, enfermedades autoinmunes, infección, enfermedad vascular, migración celular, tumorigénesis, etcetera. En este artículo, ofrecemos instrucciones paso a paso en esta sofisticada tecnología de proyección de imagen para el en vivo detección y caracterización de la inflamación (es decir, la infiltración de macrófagos F4/80-positivo) en un modelo murino utilizado de inflamación intestinal. Esta técnica podría utilizarse también en otras áreas de investigación, como seguimiento de la célula o células madre inmune.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los modelos animales son ampliamente utilizados en la investigación científica, y existen muchos procedimientos no invasivos para monitor actividad de la enfermedad y la vitalidad, como la cuantificación de los cambios de peso o el análisis de sangre, orina y heces. Sin embargo, estas son sólo parámetros de sustituto indirecto que también están sujetos a variabilidad interindividual. Con frecuencia deben complementarse análisis post mortem de muestras de tejido, que impide la observación serial en momentos repetitivos y dirigir los procesos de observación del fisiológico o patológico en vivo. Sofisticadas técnicas de imagen pequeños animales han surgido, incluyendo la proyección de imagen seccional, imágenes ópticas y endoscopia, que permite la visualización directa de estos procesos y también permite análisis repetitivos de los mismos animales1 , 2 , 3. Además, la posibilidad de repetitivas controlar diferentes Estados de la enfermedad en el mismo animal podría disminuir el número de animales necesarios, que podría ser deseable desde un punto de vista de la ética animal.

Existen varias técnicas de proyección de imagen ópticas en vivo imágenes de fluorescencia. Originalmente, la proyección de imagen confocal fue empleada para estudiar la superficie y subsuperficie eventos fluorescente4,5. Recientemente, sin embargo, sistemas tomográficos que permiten la evaluación cuantitativa del tejido tridimensional han sido desarrollados6. Esto se ha logrado mediante el desarrollo de sondas fluorescentes que emiten luz en el espectro de infrarrojo cercano (NIR), con baja absorción, detectores sensibles y fuentes de luz monocromáticas7. Mientras que las técnicas de imagen cross-sectioning tradicional, tales como la tomografía computada (CT), imágenes por resonancia magnética (MRI) o ultrasonido (US), en su mayoría dependen de parámetros físicos y visualizar la morfología, la proyección de imagen óptica puede proporcionar información adicional sobre los procesos moleculares subyacentes utilizando fluorescentes endógenos o exógenos sondas de8.

Avances en biología molecular han contribuido a facilitar la generación de sondas moleculares fluorescentes inteligentes y específicas para un número creciente de objetivos. Por ejemplo, captación mediada por receptor y la distribución en un área dada se pueden visualizar utilizando carbocyanine anticuerpos etiquetados derivado9. La abundancia de anticuerpos disponibles, que pueden ser etiquetadas como marcadores específicos en áreas de otra manera inaccesibles del cuerpo, proporciona penetraciones sin precedentes en los procesos moleculares y celulares en modelos de tumorigenesis y neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, inmunológicas e inflamatorias7.

En este estudio, describimos el uso de la tomografía de fluorescencia-mediada en un modelo murino de la colitis. Dextrán sulfato de sodio (DSS)-colitis inducida es un modelo estándar del ratón inducida químicamente de la inflamación intestinal que se asemeja a inflamatoria intestinal (EII) de la enfermedad10. Es particularmente útil evaluar la contribución del sistema inmune innato para el desarrollo de la inflamación de intestino11. Puesto que el reclutamiento, activación y la infiltración de monocitos y macrófagos representan pasos cruciales en la patogenia de la EII, visualización de su contratación y la cinética de la infiltración son esenciales para monitorear, por ejemplo, el efecto de sustancias terapéuticas potenciales en un entorno preclínicos12. Describimos la inducción de colitis DSS y demostrar la caracterización de tomografía-mediada de la infiltración de macrófagos en la mucosa intestinal con fluorescencia molecular tomografía para la visualización específica del marcador de monocito/macrófago F4/80 13. Además, ilustramos procedimientos auxiliares y suplementarios, como anticuerpo etiquetado; la disposición experimental; y análisis e interpretación de las imágenes obtenidas, en correlación con lecturas convencionales tales como índices de actividad de la enfermedad, fluyen cytometry y análisis histológico e inmunohistoquímica. Se discuten las limitaciones de esta técnica y las comparaciones con otras modalidades de imágenes.

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Protocol

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Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Renania del Norte-Westfalia, según la ley de protección Animal (Tierschutzgesetz).

1. materiales y montaje Experimental

  1. Cuidado de los animales.
    1. Utilizar ratones pareados por edad y sexo de cualquier cepa DSS susceptibles (por ejemplo, C57BL/6) en el peso corporal de 20-25 g.
    2. Plan por lo menos cinco o más ratones por grupo experimental y la casa los ratones según las pautas de cuidado de los animales locales.
    3. Proporcionar un estándar roedor chow dieta y esterilizar el agua potable ad libitum.
    4. Retire el chow estándar y sustituirla por chow libre de alfalfa por lo menos tres días antes de la exploración para reducir endoluminal auto-fluorescencia.
  2. Inducción de la colitis inducida por DSS aguda.
    1. Disolver 2 g de DSS (peso molecular ~ 40.000 Da) en 100 mL de agua esterilizado para obtener un 2% (solución del peso/volumen).
    2. Llenar la fuente beber de los ratones exclusivamente con la solución DSS y estimar 5 mL de líquido por ratón por día. Proporcionar la misma agua potable sin DSS a los ratones de control10.
      Nota: Vigile los ratones diariamente hasta el final del experimento. Eutanasia a los ratones que perder más de 20% de su peso corporal inicial o que se convierten en moribunda (es decir, persistente encorvada postura, movimiento disminuido, respiración forzada, notablemente erectos capa) según Directivas locales en animal bienestar.
  3. Preparación de la tomografía de fluorescencia-mediada.
    1. El anticuerpo deseado (por ejemplo, rata anti-ratón F4/80) con el colorante de la fluorescencia de la etiqueta (por ejemplo, Cyanine7, λexcitación: 750 nm, λ deemisión: 776 nm) como se describe en el protocolo del fabricante. Dializan anticuerpo purificado en una membrana de diálisis adecuada (tamaño de poro < 50-100 kDa) contra 1 L de cloruro de sodio de 0.15 M para por lo menos 2 horas o durante la noche.
      1. Transferencia de los anticuerpos a 1 L de 0,1 M NaHCO3 y dializo durante al menos 2 h.
      2. Disolver la cantidad necesaria de colorante fluorescente en dimetil sulfóxido (DMSO) (10.8 μl/mg de anticuerpo) y añadir a la solución de anticuerpo. Utilizar el tinte fluorescente en exceso molar 20-fold para lograr una relación de colorante a la proteína de 1:3.
      3. Incubar en la oscuridad a 4 ° C por 1 h. retirar el anticuerpo diálisis contra 1 L de sodio de 0.15 M o mediante una columna de desalación PD-10 y resolver en tampón fosfato salino (PBS) para aplicación en vivo .
      4. Determinar la concentración de anticuerpo final y etiquetado cociente por espectrofotometría.
      5. Medir la concentración de proteína en una absorción de 250-330 nm y considerar absorción adicional por el tinte. Corregir el máximo de absorción a 280 nm (proteína) en un 11% de la máxima absorción a 750 nm (siguiente paso) para el etiquetado de Cyanine7.
      6. Medir la dilución de la sustancia (típicamente 1:10) 250-800 nm y extraer la concentración de Cyanine7 en 750 nm.
      7. Determinar la proporción de proteína de tinte como: tinte anticuerpos = máxima absorción a 750 nm / 200.000 / (máxima absorción a 280 nm - 0,11 x máxima absorción a 750 nm) / 170.000.
      8. Mantener la solución de anticuerpo a 4 ° C y proteger de la luz para evitar la decoloración antes de la inyección.
    2. Cargar el volumen de la solución de anticuerpo necesario en una jeringa estéril inmediatamente antes de la inyección y el escudo de la luz hasta que se utiliza.
    3. Determinar el momento óptimo de la inyección de la punta de prueba y el procedimiento, dependiendo de la farmacocinética de trazador.
    4. Anestesiar los ratones usando 1.5-2.5% inhalado isoflurano en oxígeno o colocarlas firmemente en un limitador dedicado para la inyección de la vena de la cola de los anticuerpos etiquetados.
    5. Para los anticuerpos del cuerpo entero, inyectar el anticuerpo marcado por lo menos 24 h antes de la exploración, como visualización anti-ratón F4/80 macrófago murina colitis. Inyectar a ratones por vía intravenosa (i.v.) a través de la cola de la vena con anticuerpo marcado en un importe equivalente a 2.0 nmol de tinte.
    6. Uso igualmente etiquetado anticuerpos inespecíficos (p. ej., rat IgG u otro isotipo correspondiente a la herencia del anticuerpo primario) como control de isotipo en dosis equivalentes a las de la sonda específica.
      Nota: Los resultados de en vivo exploraciones después de la inyección del compuesto de control puede servir como referencia para la interpretación de la sonda específica de datos.
    7. Use una afeitadora eléctrica para afeitar la piel animal en la región abdominal para reducir al mínimo la absorción y reflexión de la luz.

2. técnicos

  1. Utilice un dispositivo de tomografía de fluorescencia-mediada veterinaria (FMT) para animal pequeño fluorescencia ( figura 4).
  2. Crear un nuevo estudio para cada proyecto haciendo clic en el "nuevo estudio" botón e incluir en la descripción del estudio de los marcadores relevantes, incluyendo los parámetros de imagen y dosis para referencia futura.
  3. Dentro de este estudio, crear grupos de estudio según el diseño del estudio respectivo (por ejemplo, para el control de isotipo inespecíficas y trazador específico) haciendo clic en el "nuevo grupo de estudio" botón. Equipar a cada grupo de estudio con el respectivo número de animales.
  4. Calibrar el sistema para las construcciones de trazador.
    1. Realizar la calibración para cada lote de marcadores para normalizar la variación en el etiquetado y permitir la medición cuantitativa de los datos de la OI.
    2. Seguir la dirección del fabricante del instrumento para la calibración de cada sistema individual; sobre la selección de "añadir nuevo rastreador", el sistema proporcionará a una guía a través de los pasos. Proporcionar la dilución de la solución de anticuerpo aplicado y la concentración absoluta calculada del trazador en la sonda.
    3. Para FMT, utilice un fantasma imitando tejido de características definidas del espesor y la absorción (que se asemejan a tejidos vitales) y llenarlo con un volumen específico de la solución de anticuerpo utilizado. Esta medida en el dispositivo de la FMT.
      Nota: El sistema utiliza la medida de referencia de la sonda suministrada, junto con la concentración determinada para calcular las concentraciones de indicador absoluto de medidas futuras en vivo .
  5. Utilice un cassette de examen calentable con una temperatura de 42 ° C.
    Nota: Esto evita que los ratones se hipotérmica durante el examen.

3. animal anestesia

  1. Utilizar un flujo continuo de 1.5-2% vol % isoflurano (2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) y 1.5 L O2/min para anestesiar los ratones.
Utilizar sistemas de inhalación especialmente diseñado para la anestesia de roedor (isoflurano vaporizador) para controlar fácilmente la profundidad anestésica y para minimizar la exposición del personal.
  • Colocar el ratón en la cámara de prueba de fugas inducción y encienda el vaporizador para el suministro de isoflurano (100% (v/v), 5 vol % oxígeno, 3 L/min). Controlar el ratón hasta que quede inconsciente y reclinada.
  • Coloque en el cassette de examinación de la tomografía, con inhalación isoflurano continua mediante cono de nariz en una dosis de 100% v/v, 1,5 vol % oxígeno, 1, 5 L/min para minimizar los artefactos de movimiento durante el examen. Para procedimientos que duran más de 5 minutos, aplicar ungüento oftálmico en los ojos de ratón para prevenir daño de la córnea.
  • Evaluar la profundidad anestésica por comprobación de los reflejos. Coloque el ratón en su parte posterior; Si la anestesia es suficiente, el ratón no debe dar vuelta alrededor. Apriete el ratón suavemente entre sus dedos; Si la anestesia es suficiente, la pierna no será retirada (etapa de tolerancia quirúrgica).

    • 4. fluorescencia-mediada de la tomografía

    Nota: Adaptar los datos siguientes, que son específicos para el sistema FMT utilizado en este estudio (véase la Tabla de materiales) para dispositivos de imágenes de reflectividad de fluorescencia alternativos o sistemas de FMT, según sea necesario.

    1. Coloque el ratón anestesiado en su parte posteriora en el cassette de la examinación.
    2. Realizar el procedimiento.
      1. Inserte el cartucho en el sistema de proyección de imagen y cierre inmediatamente para asegurar la anestesia continua. Seleccionar la muestra apropiada en el grupo de estudio creado previamente. Seleccionar el trazador administrado desde el menú desplegable para asegurar que los valores para la concentración del trazalíneas se calculan correctamente.
      2. Adquirir imagen de reflectancia de fluorescencia a la longitud de onda adecuada (720 nm de Cyanine7) para la planificación de la exploración y resumen el campo de exploración haciendo clic en el botón "adquirir imagen".
      3. Ver que el campo de análisis aparece como una superposición de la imagen de reflectancia de fluorescencia. Ajustar a la región de interés (por ejemplo, colon o abdomen), evitando el aire o las áreas de la piel restante. Dependiendo el destino de la imagen, establecer al número de imagen de puntos de datos dentro del campo de exploración, eligiendo entre la gruesa mediana y fina resolución de campo de exploración en el menú de la derecha.
        Nota: Tenga en cuenta que un campo de exploración bien podría ofrecer mejor resolución espacial a costa de un tiempo significativamente largo análisis.
      4. Iniciar la adquisición de datos/imagen a la longitud de onda seleccionada haciendo clic en "scan".
        Nota: El tiempo de exploración para una exploración semifino del abdomen entero será alrededor de 5 min; en este tiempo, cada punto de datos por separado es iluminado por el laser de la excitación y la fluorescencia resultante se registra.
      5. Retirar el animal del cassette de imágenes al final de la exploración y dejar el animal a recuperarse completamente antes de colocarlo en la jaula.
      6. Repita la FMT si se considera necesario en varios puntos del tiempo durante el experimento (por ejemplo, los días 0, 5 y 9-10 (final del experimento)), pero la acumulación de anticuerpos en el cuerpo, por lo tanto aumento de la señal de fluorescencia de fondo.

    5. post-análisis

    1. Coloque el ratón en una jaula separada en una toalla de papel bajo una lámpara de calentamiento luz roja y controlar el ratón signos de malestar o angustia hasta recuperación completa. Coloque el ratón en su respectiva jaula cuando está totalmente despierto.
    2. Eutanasia a los ratones al final del experimento por la entrega de CO2 para el aislador a una dosis de 100% (v/v), 100% vol y 3 L/min. No la llene la cámara con CO2, como una súbita exposición a altas concentraciones de CO2 puede causar señal de socorro. Verificar la muerte después de que el ratón ha dejado de respirar de un modo secundario subsecuente de la eutanasia como rápida dislocación cervical.
    3. Explante el colon por laparotomía abdominal y realizar un análisis ex vivo de colon explanted, como se explica en pasos 4.2.1 - 4.2.4. Abra cada colon longitudinalmente con tijeras quirúrgicas Metzenbaum y enjuagar con solución salina antes de preparar para su análisis posterior.
    4. Utilice un bisturí para cortar un fragmento de 0.5 cm del colon distal y colocar inmediatamente en un tubo criogénico de 1,5 mL. Congelación en nitrógeno líquido y almacenar a-70 ° C hasta su uso posterior (por ejemplo,mieloperoxidasa (MPO) medidas).
    5. Utilizar un palo de madera y enrollar el colon longitudinalmente abierto restante de distal al extremo proximal, con la hacia fuera de la mucosa ("técnica de brazo de gitano"), para análisis histológicos. Colocar la preparación en un fijador (véase la Tabla de materiales) y congelar a-80 ° C14.

    6. interpretación y reconstrucción de datos

    1. Utilice la herramienta reconstrucción del respectivo software imagen para crear mapas en 3D de la distribución de la fluorescencia a partir de los datos de imágenes raws; las exploraciones se agregan automáticamente a la herramienta de reconstrucción, cuando a la exploración, la función "Agregar a cola de reconstrucción" está seleccionada.
      1. De lo contrario, seleccione las imágenes en el menú desplegable bajo el respectivo estudio grupo de estudio, haga clic derecho en la exploración y seleccione "añadir a la reconstrucción".
    2. Para su posterior análisis, cargar un conjunto de datos en el software de análisis. En el menú desplegable en la barra superior, seleccionar el estudio correspondiente y luego seleccione el grupo de estudio y el animal individual en el menú de la derecha; se mostrarán todos los escaneos de este animal. Seleccione la correcta exploración y haga clic en "cargar".
      Nota: La reconstrucción 3D de la distribución del indicador aparecerá en la izquierda como una superposición de la imagen de reflectancia de fluorescencia inicialmente adquirido. El modelo puede girar y magnifica para el análisis más fácil.
    3. Identificar focos de acumulación de etiqueta inespecíficos (p. ej., hígado o la orina de la vejiga) en mapas 3D reconstruidos y distinguir de los tejidos diana (por ejemplo, del intestino o del intestino).
    4. De la barra superior, seleccione la forma de retorno de la inversión más adecuada para el destino. Tejido de la blanco de la etiqueta como regiones de interés (ROI) mediante la colocación de los respectivos instrumentos de medición en el software de análisis; el software proporcionará una intensidad de fluorescencia para el retorno de la inversión, así como (pico-) cantidades molares del trazador que la exploración ha sido calibrada para.
    5. Seleccione la cantidad total de trazador en el ROI adecuado, normalizado por el tamaño ROI, como el equivalente más adecuado para la evaluación de la actividad de la enfermedad en correlación con el infiltrado inflamatorio (histología).
      Nota: Otras características del ROI pueden ser elegidos si es apropiado como representante del modelo en particular.

    7.Ex Vivo Análisis

    1. Hematoxilina y eosina y tinción de inmunofluorescencia.
      1. Desparafinizar secciones colocándolas en 70% de etanol (EtOH) por 2 min; enjuague luego con agua destilada. Tinción con hematoxilina en solución por 5 minutos y posteriormente enjuagar con agua caliente del grifo durante 10 minutos.
      2. Enjuague con agua destilada, contratinción con solución de eosina durante 2 min. y enjuagar nuevamente con agua destilada.
      3. Lugar en el 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH y xileno (2 veces) de 2 minutos cada uno para deshidratar y para eliminar las secciones. Montar con medio de montaje resinosas.
    2. Tinción de inmunofluorescencia.
      1. Utilizar las secciones de tejido previamente obtenidos ("brazo de gitano") para la tinción de inmunofluorescencia y preparar cryo-corte secciones de 7 μm.
      2. Bloquear secciones colon acetona-fijos y congelados en suero de rata de 5.0% por 10 min e incubar durante una noche con diluido (1/500 v/v) biotinilado primaria rata anti-F4/80 anticuerpo del ratón. Las secciones de lavado tres veces en solución salina tamponada con Tris (TBS) e incubar con estreptavidina-FITC (1: 100 v/v) en PBS y la BSA (0.1% w/v) durante la noche a 4 ° C.
      3. Lávese las secciones en TBS y mancha con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v) para lograr contraste. Analizar las imágenes de fluorescencia debajo de un microscopio confocal (ver la Tabla de materiales, 40 aumentos; cubo N2.1 de filtro con filtro de excitación 515-560) y contar las células F4/80-positivas por campo de alta potencia.
        Nota: Considerar el uso de anticuerpos del mismo clon y formato al combinar en vivo FMT y post mortem histología análisis como inmunohistoquímica o inmunofluorescencia, tinción, dependiendo el objetivo. Para la detección de macrófagos F4/80-positive en vivo y ex vivo, se utilizaron diferentes formatos.
    3. Mediciones en muestras de colon de MPO.
      1. Uso recién obtenidos, PBS-aclarado dos puntos muestras o muestras descongeladas para mediciones de MPO. Todas las muestras de pesar y homogeneizar el tejido en tampón de lisis en el ELISA kit (véase la Tabla de materiales) en un volumen de 20 μl de tampón de lisis por mg de tejido.
      2. Someter a ultrasonidos por 15 s (frecuencia de sonicación: 20 kHz, potencia: 70 W) y centrifugar las muestras durante 10 minutos a 200 x g a 4 ° C.
      3. Uso un ELISA disponible comercialmente kit (véase la Tabla de materiales) según la descripción de la fabrica. Llevar a cabo la prueba por duplicado.

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    Results

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    Evaluación de Colitis:

    Colitis inducida por DSS es un químicamente inducido modelo murino de inflamación intestinal que se asemeja a la enfermedad inflamatoria intestinal humana y conduce a la pérdida de peso, sangrado rectal, ulceración superficial y daño de la mucosa en ratones susceptibles15. Es particularmente útil estudiar la contribución del sistema inmune innato para el desarrollo ...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Aunque las técnicas médicas de imagen han evolucionado rápidamente en los últimos años, todavía estamos limitados en nuestra capacidad para detectar procesos inflamatorios o tumores, así como otras enfermedades, en sus primeras etapas de desarrollo. Sin embargo, esto es crucial para el crecimiento del tumor comprensión, invasión, metástasis desarrollo y procesos celulares en el desarrollo de trastornos inflamatorios y enfermedades degenerativas, cardiovasculares e inmunológicas. Mientras que las técnicas de imagen tradic...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Agradecemos a la Sra. Sonja Dufentester, Sra. Elke Weber y Sra. Klaudia Niepagenkämper por la excelente asistencia técnica.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Reactivos alta
    dextrano sódico (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SueciaDB001
    E 4382
    Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)                                                 Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AlemaniaE 9884
    Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, AlemaniaB506
    Hematoxilina                                                                                                       Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AlemaniaHHS32-1L
    O.C.T. Compuesto Tissue Tek                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Países Bajos4583fijador para análisis histológicos
    Solución salina tamponada con fosfato, PBSLonza, Verviers, Bélgica4629
    Cloruro de sodio 0,9%Braun, Melsungen, Alemania5/12211095/0411
    Bicarbonato de sodio en polvoSigma Aldrich Deisenhofen, AlemaniaS5761
    Dieta estándarAltromin, Lage, Alemania1320
    Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Países Bajos4566
    Hemoccult (prueba de papel de guayaco)Beckmann Coulter, Alemania3060
    Biotina rata-anti-ratón anti-anti-F4/80anticuerpo Serotec, Oxford, Reino UnidoMCA497B
    Biotina-rata-anti-ratón anti-GR-1 BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania553125
    Sondas moleculares Streptavidin-Alexa546, Darmstadt, AlemaniaS-11225Excitación/emisión máxima:  556/573nm
    Anticuerpo anti-CD11b rata-anti-ratón TCCalteg, Burlingame, EE. UU.R2b06
    Anticuerpo anti-ratón F4/80 purificadoBioLegend, Londres, Reino Unido123102
    DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemaniaD9542
    Anticuerpo anti-rata-ratón-anti-ratón conjugado con FITCBD Pharmingen, Heidelberg, Alemania553104
    tampón FACSBD Pharmingen, Heidelberg, Alemania342003
    Cy7 NHS EsterGE Healthcare  Europa, Friburgo, AlemaniaPA17104
    MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, AlemaniaK 6631B
    Cy5.5 marcado anticuerpo anti-ratón F4/80BioLegend, Londres, Reino Unido123127listo para usar Anticuerpos marcados (alternativa)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5eBioscience, Waltham, EE. UU.45-4801-80Anticuerpos marcados listos para usar (alternativa)
    DMSO (sulfóxido de dimetilo)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania67-68-5
    IsofluranoSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania792632
    EtanolSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania64-17-5
    Albúminas séricas bovinas (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemaniaA4612
    Tris Solución salina tamponada (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemaniaSRE0032
    NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
    Equipo
    FACS Sistema de citometría de flujoCalibur BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Alemania
    FMT 2000 Sistema de imágenes in vivoPerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU. FMT2000
    software de análisis de imágenes True Quant 3.1PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU. incluido en FMT2000
    Microscopio fluorescente Leica DMLBLeica,  35578 Wetzlar, Alemania DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlín, AlemaniaHD 2070homogeneizador ultrasónico
    Bisturí desechable n.º 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemaniaZ692395-10EA
    Tijeras Metzenbaum 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Alemania22398330
    Jeringa Luer Lock 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemaniaZ248010
    jeringasSigma-Aldrich, Deisenhoffen, AlemaniaZ192368 
    Tubo de halcón 50mlBD Biosciences, Erembodegem, Bélgica352070
    sin alfalfa Harlan Laboritories, Madison, EE. UU. 2014 Bepanthen ungüento oftalmológico Bayer, Leverkusen, Alemania 80469764 Sulfato de Eosin Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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