Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo

Resumen

Presentamos una configuración de grabación de comportamiento y un protocolo que permite el análisis automatizado del nematodo, la preferencia de Caenorhabditis elegans por compuestos solubles en un ensayo basado en la población. Este artículo describe la construcción de una cámara de comportamiento, el protocolo de ensayo conductual y el uso de software de análisis de vídeo.

Resumen

El nematodo, el sistema nervioso compacto de Caenorhabditis elegans de sólo 302 neuronas subyace en un repertorio diverso de comportamientos. Para facilitar la disección de los circuitos neuronales subyacentes a estos comportamientos, es necesario el desarrollo de ensayos de comportamiento robustos y reproducibles. Anterior C. elegans estudios de comportamiento han utilizado variaciones de un "test de caída", un "ensayo de quimiotaxis", y un "ensayo de retención" para investigar la respuesta de C. elegans a compuestos solubles. El método descrito en este artículo busca combinar las fuerzas complementarias de los tres ensayos antes mencionados. Brevemente, un pequeño círculo en el centro de cada placa de ensayo se divide en cuatro cuadrantes con las soluciones de control y experimentales colocadas alternativamente. Después de la adición de los gusanos, las placas de ensayo se cargan en una cámara de comportamiento donde las cámaras de microscopio registran los encuentros de los gusanos con las regiones tratadas. El análisis automatizado de video seY se genera un valor de índice de preferencia (PI) para cada vídeo. La adquisición de vídeo y las características de análisis automatizado de este método minimizan la participación del experimentador y cualquier error asociado. Además, se utilizan cantidades minuciosas del compuesto experimental por ensayo y la configuración de múltiples cámaras de la cámara de comportamiento aumenta el rendimiento experimental. Este método es particularmente útil para conducir pantallas de comportamiento de mutantes genéticos y nuevos compuestos químicos. Sin embargo, este método no es apropiado para estudiar la navegación por gradiente de estímulo debido a la proximidad cercana de las regiones de control y solución experimental. Tampoco debe utilizarse cuando sólo se dispone de una pequeña población de gusanos. Aunque es adecuado para ensayar respuestas sólo a compuestos solubles en su forma actual, este método puede modificarse fácilmente para adaptarse a interacciones sensoriales multimodales y estudios optogenéticos. Este método también puede adaptarse para ensayar las respuestas quimiosensibles de otras especies de nemátodos.

Introducción

Los animales forrajeros deben integrar insumos de múltiples modalidades sensoriales y seleccionar estrategias de comportamiento apropiadas para poder navegar con éxito en su ambiente. La comprensión de cómo los insumos sensoriales externos se reciben y transduced en la información neural para guiar la selección de la acción es una meta central en el campo de la neurobiología. El nematodo genéticamente tratable, C. elegans , es un organismo modelo atractivo en el que estudiar los mecanismos neuronales subyacentes biología sensorial y la integración multimodal. Aunque C. elegans tiene sólo 302 neuronas, puede detectar y discriminar entre una amplia variedad de estímulos ambientales, incluyendo compuestos solubles, olores volátiles y temperatura ambiente ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . losNematodo C. elegans depende en gran medida de su aparato quimiosensorial para localizar las fuentes de alimentos y para alertar a las amenazas potenciales. Así, los ensayos conductuales diseñados para examinar las respuestas de C. elegans de tipo salvaje y mutante a estímulos químicos desempeñan un papel crucial en la disección de los mecanismos genéticos, celulares y neuronales que subyacen a las notables capacidades sensoriales de C. elegans .

Para ensayar la respuesta a compuestos solubles, se han descrito tres tipos de ensayos: el ensayo de caída, el ensayo de quimiotaxis y el ensayo de retención. En la prueba de caída, se coloca una pequeña gota del compuesto en la cola de un gusano móvil y la decisión del gusano de retroceder o avanzar una vez que el líquido alcanza el aparato sensorial anterior se anota ⁴ . La prueba de caída requiere poca preparación experimental y es útil cuando el tamaño de la muestra de los gusanos es pequeño, como en el caso de los gusanos operados por láser. Sin embargo, como sólo un gusanoPuede ensayarse a la vez y el experimentador debe estar presente a lo largo de la duración del ensayo, la prueba de caída puede llevar mucho tiempo. La prueba de caída es también vulnerable a variaciones en el suministro de gotas entre cada gusano dentro de una muestra, lo que puede influir en los resultados globales del ensayo. Otra limitación de la prueba de caída es que sólo puede usarse para analizar la respuesta del gusano a compuestos aversivos ya que no es posible discriminar entre un efecto atractivo o neutro del compuesto del movimiento hacia delante del gusano.

El ensayo de quimiotaxis para compuestos solubles generalmente implica dividir una placa de agar en cuatro cuadrantes, con la solución experimental mezclada en el agar de dos cuadrantes opuestos y la solución de control mezclada en los otros dos cuadrantes ^{8 , 9} . Al comienzo del ensayo, se coloca una gota de gusano conteniendo tampón en el centro de la placa y el número de gusanos en Cada cuadrante se anota en diferentes puntos temporales. El ensayo de quimiotaxis proporciona mayor poder estadístico en comparación con la prueba de caída, ya que se ensaya un gran número de gusanos en cada ensayo. Sin embargo, una limitación de este método es que la preparación de las placas de ensayo de quimiotaxis requiere grandes cantidades del compuesto experimental. Esto dificultará la realización de pantallas de comportamiento a gran escala si se requiere un complicado proceso de purificación con rendimientos limitados para obtener el compuesto de interés, como en el caso de las moléculas de señalización de ascarósido ¹⁰ . Además, el conteo manual de gusanos durante todo el ensayo es susceptible a errores y la perturbación de las placas durante el proceso de conteo puede afectar los resultados.

A diferencia de los dos métodos antes mencionados, el ensayo de retención utiliza visión mecánica, que minimiza el error durante el proceso de puntuación y reduce la interferencia del experimentador durante el ensayo > 11. El análisis computarizado de las grabaciones de vídeo del comportamiento del gusano también puede revelar potencialmente una dinámica de comportamiento más sutil que se perderá cuando la puntuación se realiza sólo en unos pocos puntos de tiempo discretos. En el ensayo de retención, se añaden dos puntos de solución en lados opuestos de un pequeño parche alimentario circular bacteriano seguido por la colocación de un pequeño número de gusanos en el medio del parche de alimentos. El comportamiento de los gusanos es grabado y analizado, y se calcula un valor de índice de preferencia basado en el número total de píxeles de gusano en cada región de solución. Aunque la presencia de un parche de alimentos atractivos permite que se utilicen poblaciones de gusanos más pequeñas en cada ensayo, previamente se ha demostrado que los alimentos sensibilizan los comportamientos de evitación a los repelentes solubles ¹² . Además, los gusanos muestran una respuesta fotofóbica a la luz de longitud de onda corta y el uso de fuentes de luz de microscopio que emiten luz blanca en la configuración de grabación de comportamiento podría afectar el comportamientoS = "xref"> 13.

El propósito del método discutido en este artículo es registrar y analizar la preferencia de C. elegans por los compuestos solubles usando un ensayo basado en la población. Con este fin, el método actual se integra y mejora aspectos de los tres métodos anteriormente discutidos. Permite que se ensayen grandes poblaciones de gusanos y sólo se requieren pequeñas cantidades de la solución experimental en cada ensayo. Además, el ensayo se lleva a cabo dentro de una cámara de comportamiento cerrada personalizada con retroiluminación LED infrarrojo para minimizar los efectos de la luz de longitud de onda corta en el comportamiento. Cada cámara también puede equiparse con múltiples cámaras de microscopio, lo que aumenta el rendimiento experimental sin comprometer el espacio del banco. Por último, el software de análisis de vídeo genera el valor del índice de preferencia para cada vídeo, así como un gráfico de ocupación del gusano que lo acompaña para visualizar la dinámica del comportamiento de la población con el tiempo. El montaje de la cámara yEl protocolo ssay puede modificarse adicionalmente para estudiar las respuestas de comportamiento multimodal, tales como el efecto de los odorantes o la temperatura en los comportamientos quimiosensores.

Este artículo describe la construcción de la cámara de comportamiento y el protocolo de ensayo. También demuestra la utilidad de este método en el ensayo de la respuesta de gusanos de tipo salvaje y mutantes defectuosos quimiosensoriales a los cono conocidos repelente, iones de cobre [ ^4] . Por último, se detalla el proceso de análisis de vídeo que utiliza el software proporcionado.

Protocolo

1. Cámara de Comportamiento

NOTA: La cámara de comportamiento consiste en un bastidor aproximadamente en forma de cubo hecho de barras de aluminio extruido, cubierto con cubiertas opacas de tela, con un fondo transparente de acrílico y soportes de cámara. Las juntas entre las barras de aluminio extruidas que forman la cámara de comportamiento son todas perpendiculares y se aseguran usando soportes de esquina en forma de "L" (1 pulgada de ancho con patas de 1 pulgada) que sujetan una patas de esquina a cada barra con tornillos y deslizamiento Tuercas en T. Cada junta se asegura con uno o dos soportes de esquina como se describe a continuación. Las cubiertas de tela sobre la cámara se unen a las barras de bastidor de aluminio con los mismos tornillos y tuercas en T deslizantes, pero a través de ojales en las esquinas de la tela. Los tornillos se insertan correctamente en el lado avellanado de las tuercas en T deslizantes, no en el lado con el labio sobresaliente. Cuando conecte un conjunto de tornillo / tuerca de tuerca a una barra de aluminio, deslice la tuerca T en el canalEn la cara apropiada de la barra con la cabeza del tornillo saliendo de la ranura.

1. Prepare cubiertas de tela.
   1. Use tijeras para cortar cinco piezas de la tela de poliéster opaco para cubrir la parte superior y cuatro lados de la cámara.
      1. Corte una hoja cuadrada de 14 x 14 pulgadas ² de tela para la parte superior de la cámara. Corte cuatro hojas rectangulares de 11 x 14 pulgadas ² de tela para los lados de la cámara.
   2. Instale grommets en las esquinas de las hojas de tela.
      1. Marque una línea de referencia de 0,5 pulgadas de cada borde de las cinco hojas de tela de poliéster usando un lápiz y una regla.
      2. Para las cuatro hojas rectangulares, utilice alicates de arandela para insertar ojales centrados donde las líneas de lápiz se cruzan en cada esquina (es decir, 4 ojales por hoja).
      3. Para la hoja cuadrada, inserte dos ojales a lo largo de cada borde con cada ojal centrado en la línea del lápiz y situado a 1,5 pulgadas del final de cada uno deLas cuatro líneas de lápiz (es decir, 8 grommets total, dos cerca de cada esquina).
   3. Inserte un tornillo en cada orificio de ojal y suelte un T-tuerca a cada uno.
2. Fabricar barras de montaje de la cámara.
   1. Utilice una sierra de cinta o equivalente para cortar una pieza de 2 pulgadas de largo de barra de extrusión de aluminio para cada cámara, asegurando que el extremo cortado de la barra es perpendicular a la longitud de barra para facilitar el montaje posterior.
   2. Utilice una prensa de perforación con una broca de 0,25 pulgadas de diámetro para perforar un agujero a través de las bandas centrales de cada barra de montaje de la cámara, 0,75 pulgadas de un extremo de tal manera que el agujero sea perpendicular a las caras superior e inferior y pasa a través de la línea central de la barra . Opcionalmente, taladre el agujero con un taladro eléctrico de mano con una broca de 0,25 pulgadas, pero asegúrese de que el agujero es perpendicular a las caras superior e inferior de la barra.
3. Prepare todos los soportes de esquina.
   1. Introduzca un tornillo en el orificioCada una de las patas del soporte de la esquina, insertando el tornillo desde el lado del ángulo interior. Enroscar de manera suelta una tuerca T en cada tornillo.
4. Prepare el conjunto de montaje de la cámara ( Figura 1B , capa 2).
   NOTA: El conjunto de montaje de la cámara es un conjunto en forma de "H" que admite las tres fundas de la cámara.
   1. Conecte las barras de montaje de la cámara a la barra central del montaje del montaje de la cámara.
      1. Coloque las tres barras de montaje de la cámara fabricadas en el paso 1.2 con los orificios orientados verticalmente. Deslice dos soportes de esquina en los lados de cada barra de montaje en el extremo más alejado del agujero taladrado.
      2. Coloque los soportes de esquina con las patas de los soportes alineados con el extremo de la barra y apriete los tornillos para fijarlos en su lugar. Esto forma una forma de "T" con el agujero taladrado en la parte inferior de la "T".
      3. Coloque una extrusión de aluminio de 1 pie en la superficie de trabajo. Deslice las tuercas en T de una cámara(Desde la etapa anterior) en un lado de la barra de 1 pie. Centre la barra de montaje a lo largo de la longitud de la barra de 1 pie y apriete los tornillos para fijarlos en su lugar. Deslice las otras dos barras de montaje en el lado opuesto de la barra de 1 pie.
      4. Coloque las dos barras equidistantes desde el centro de la barra de 1 pie, con sus soportes de esquina internos de aproximadamente 2,5 pulgadas de distancia. Coloque los soportes de esquina en los lados de la barra de 1 pie, dos en cada extremo de la barra. Coloque los soportes de esquina con las patas de los soportes alineados con los extremos de la barra y apriete los tornillos para asegurarlos en su lugar.
   2. Fije las barras finales a la barra central.
      1. Deslice dos extrusiones de aluminio de 1 pie en las tuercas en T en cada extremo del conjunto de la etapa anterior formando una forma en "H". Centre cada barra de extremo en la barra central y asegúrela apretando los cuatro tornillos.
      2. Deslice cuatro soportes de esquina en la parte superior de las dos barras finales agregadas en el paso anterior, una en cada extremoDe cada barra. Coloque los soportes de esquina con las patas de los soportes alineados con los extremos de las barras y apriete los tornillos para asegurarlos en su lugar.
   3. Conecte los soportes y fundas de la cámara al conjunto de montaje de la cámara.
      1. Para cada uno de los tres soportes de la cámara del microscopio, retire la funda de la cámara aflojando el tornillo de mariposa y deslizando la barra del soporte.
      2. Para cada barra de montaje de la cámara (ahora asegurada a la barra central de la "H"), coloque una arandela en un tornillo de cabeza redonda, deslice el tornillo a través del orificio perforado en la barra de montaje de la cámara y coloque otra arandela sobre el tornillo . Enrosque el orificio roscado de la barra del soporte de la cámara sobre el tornillo, apretándolo firmemente contra la barra de montaje de la cámara.
      3. Repita los pasos 14.3.2 para las otras dos barras de montaje de la cámara.
      4. Deslice una funda de la cámara en cada barra del soporte de la cámara con la abertura más amplia orientada hacia la barra de montaje de la cámara y el tornillo. Fije temporalmente la funda en el soporte de la cámaraCon el destornillador de la pistolera.
         NOTA: La posición final de funcionamiento se ajustará en la sección 2.
5. Monte el marco de cámara de comportamiento ( Figura 1A ).
   NOTA: Para facilitar la construcción, monte el bastidor al revés, comenzando con la "parte superior" del bastidor de la cámara en la superficie de trabajo ( Figura 1B , capa 1) y trabajando hacia arriba hacia los "pies" del bastidor ( Figura 1B , capa 3).
   1. Para ensamblar la capa superior de la cámara de comportamiento, fije cuatro barras de aluminio extrudidas de 1 pie a la lámina de poliéster cuadrada ( Figura 1B , capa 1).
      1. Deslice una barra sobre las dos tuercas en T a lo largo de cada borde de la hoja de tela, centrando la barra a lo largo del ancho de la tela. Apriete los sujetadores para asegurar la lámina de tela a cada barra.
      2. Extienda la hoja cuadrada de poliéster sobre la superficie de trabajo wiLas cuatro barras de aluminio unidas en la parte superior. Deslice ocho soportes de esquina en las superficies superiores de las cuatro barras de aluminio, una en cada extremo de cada barra. Coloque los soportes de esquina en las barras con las patas verticales de los soportes alineadas con los extremos de las barras. Sujete los tornillos en las tuercas en T.
   2. A su vez, en cada esquina, coloque un adicional de 1 pie de extrusión de aluminio en posición vertical, deslizando la extrusión sobre las tuercas en T en las dos patas de soporte de esquina.
   3. Asegure la barra vertical a las barras horizontales apretando los sujetadores, uniendo así las dos barras horizontales adyacentes.
      NOTA: Una vez completadas, las ocho extrusiones (cuatro horizontales y cuatro verticales) formarán un anillo cuadrado sobre la mesa con cuatro postes que se peguen hacia arriba ( Figura 1B , capa 1).
   4. Deslice las tuercas T sueltas del conjunto de montaje de la cámara en forma de "H" desde la sección 1.4 hacia abajo en los montantes del bastidor desde el paso anterior. Deje que el "H & #34; Deslice hasta el final para descansar en la parte superior de los soportes de esquina en cada esquina del marco. Fije el montaje del montaje de la cámara en su lugar apretando los cuatro tornillos del soporte de esquina.
   5. Ensamble la capa inferior de la cámara utilizando las cuatro barras de aluminio extrudidas finales de 1 pie ( Figura 1B , capa 3).
      1. Coloque un soporte de esquina en cada extremo de cada barra de 1 pie, coloque los soportes de esquina con las patas de los soportes alineados con los extremos de la barra y apriete los tornillos para asegurarlos en su lugar.
      2. Deslice las barras hacia abajo entre los montantes del bastidor con las tuercas T sueltas en los canales de los montantes. Coloque las barras de manera que los bordes superiores de sus soportes de esquina estén a 1 pulgada por debajo del extremo abierto de los montantes y asegúrelos en su lugar apretando los tornillos del soporte de esquina.
6. Deslice las tuercas T de las cuatro hojas rectangulares de poliéster hacia abajo en los canales de las barras verticales de extrusión para cubrir los lados del chambeR y apriete los sujetadores para asegurarlos en su lugar.
7. Seleccione un lado para que sea una puerta para acceder al interior de la cámara y retire los dos tornillos y tuercas en T en la capa inferior de la cámara.
   NOTA: Cuando el bastidor esté en posición vertical, la parte inferior de esta cubierta quedará suelta en la parte inferior y podrá levantarse para acceder al interior de la cámara.
8. Coloque una tapa de plástico en el extremo superior de cada miembro de la esquina para servir como pies para el marco completo. Gire el marco hacia la derecha. Inserte dos soportes de panel por lado dentro de la capa base del marco y gírelo para fijarlos en su lugar ( Figura 1B , capa 3). Colocar una pulgada ² pieza de acrílico transparente en la parte superior de los soportes del panel de 12 x 12 para proporcionar un escenario para placas de ensayo (Figura 1B, la capa 3).

2. Posicionamiento de la cámara y de la plantilla de la etapa

1. Descargue e instale el software de adquisición de vídeo de la cámara del microscopio en la computadoraDesde el sitio web del fabricante.
2. Deslice una cámara de microscopio en cada una de las tres fundas de la cámara con las ópticas de la cámara apuntando hacia abajo hacia la etapa de acrílico y retroiluminación. Conecte las cámaras a los puertos USB de la computadora. Coloque el panel de luz de fondo infrarrojo debajo del marco, centrando debajo de la etapa. Conecte el panel de contraluz para encenderlo.
3. Imprima las plantillas de colocación de la solución y de alineación de planchas proporcionadas en las hojas de transparencia (consulte el archivo suplementario ).
   NOTA: En la plantilla de colocación de la solución, el círculo perimetral de la placa es de 3,8 cm de diámetro y el círculo de la región interna de interés es de 0,9 cm de diámetro.
4. Corte a lo largo de las líneas de la cuadrícula para obtener transparencias rectangulares que encierran las plantillas circulares.
5. Inicie el software de adquisición de vídeo y haga clic en las miniaturas numeradas en la parte superior de la ventana para ver los canales de las cámaras.
6. Ajuste la alineación y la ampliación de la cámara del microscopio.
7. Coloque una plantilla de alineación de placa debajo de una lente de cámara de microscopio ( Figura 2B ).
8. Cambie la distancia de trabajo deslizando verticalmente la funda de la cámara a lo largo de la varilla del soporte de la cámara y ajuste la ampliación de la cámara girando el dial de aumento de la cámara hasta que los marcadores de número de la plantilla estén claramente visibles en los bordes del campo de visión de la cámara.
9. Cinta la plantilla de alineación de placas a la etapa de acrílico.
10. Coloque una placa de muestras de gusanos en la placa de alineación de plantilla bajo la cámara de microscopio y seguir mejorando la ampliación y la distancia de trabajo hasta que una imagen nítida de los gusanos se logra, manteniendo los marcadores de número dentro del campo de visión.
11. Repita los pasos 2.6.1-2.6.4 para las otras dos cámaras de microscopio.

3. Crecimiento y sincronización de los nematodos

1. Cuatro días antes de los experimentos, semilla veinticuatro de 60 mmNematode Growth Media (NGM) con 50 μL de OP50 Escherichia coli en caldo Luria-Bertani (LB) (ver sección 5 para receta).
   NOTA: Cada placa de 60 mm proporcionará suficientes gusanos para una placa de ensayo. Se recomienda la adquisición de seis repeticiones por tratamiento o genotipo.
2. Dejar secar las placas sembradas en posición vertical con tapas, durante la noche a temperatura ambiente.
3. Al día siguiente, transfiera quince hermafroditas grávidos bien alimentados en cada plato sembrado y permita que los gusanos pongan huevos durante seis horas. Esto producirá más de 360 ​​huevos por plato.
4. Después de 6 h, eliminar los gusanos de las placas sembradas y dejar crecer la progenie durante tres días en adultos a 20 ° C.

4. Ensayo de preferencia quimiosensorial

1. El día antes del experimento, se prepararon placas de ensayo de agar NGM de 35 mm.
   1. Preparar 250 ml de agar NGM (ver la sección 5 para la receta).
   2. Coloque veintiocho platos vacíos de 35 mm en pilas de cinco o menos en una superficie planaRface Llenar cada placa de ensayo con 5 ml de agar NGM. Deje las placas de ensayo secar en posición vertical con las tapas encendidas, durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: Como regla general, prepare una placa de ensayo adicional para cada tratamiento o genotipo que se va a analizar en caso de contingencias.
2. El día del experimento, active la retroiluminación, arranque la computadora y lance el software de captura de vídeo de la cámara del microscopio.
3. Conecte una cámara de microscopio al ordenador y ajuste los ajustes de grabación de vídeo.
   1. Haga clic en la miniatura numerada de la cámara en la parte superior de la ventana del software para ver el feed en vivo de la cámara.
   2. Tire hacia abajo del menú 'Formato de vídeo' en la esquina superior izquierda de la alimentación de la cámara y seleccione 'MJPG 1280 x 1024'. Tire hacia abajo del menú 'Folder' junto al menú 'Video Format' y seleccione una carpeta en la que guardar los archivos de vídeo.
   3. Haga clic en el icono "Exposición automática" en la esquina superior derecha deLa alimentación de la cámara y desactive la exposición automática. Haga clic en el ícono "LED" inmediatamente a la derecha del icono "Exposición automática" para apagar los LED de la cámara del microscopio incorporados. Haga clic en el icono "Configuración" adyacente: Seleccione "Monocromo", maximice "Contraste" y ajuste "Brillo" hasta que los gusanos aparezcan distintos del fondo.
4. Adquirir videos de calibración.
   1. Alinee una plantilla de colocación de solución sobre una plantilla de alineación de placa de escenario ( Figura 2A ). Haga clic en el ícono de grabación "Tiempo transcurrido" en el lado izquierdo de la alimentación de la cámara e ingrese '5' para la duración y '1' para el intervalo para grabar un video de 5 s a 1 frame / s. Haga clic en 'Iniciar' para comenzar la grabación de vídeo.
5. Repita los pasos en 4.3 y 4.4 para las otras dos cámaras de microscopio.
6. Retire la plantilla de colocación de la solución de la cámara.
8. Utilice una pipeta de vidrio de 5 ml para agregar 1,2 ml de tampón NGM a una placa de gusanos sincronizados y agite suavemente la placa para desplazar los gusanos al buffer. Pipetar el tampón de la placa y dispensar los gusanos en el tampón en un tubo de microcentrífuga limpia.
   NOTA: Los gusanos son sensibles a las desviaciones de su concentración de sal de agar en cultivo ¹⁴ . Para minimizar los cambios en la concentración de sal de agar después de la colocación del gusano, se recomienda usar el tampón NGM para el proceso de lavado (ver sección 5 para la receta). No utilice pipetas de plástico para quitar los gusanos de las placas, como gusanos se adhieren a los lados. Preparar un número equivalente de tubos como el número de placas de ensayo a ejecutar simultáneamente.
9. Deje que los tres tubos de pie durante 1-2 min para permitir que los gusanos para asentarse en el fondo. Utilice una punta de pipeta de plástico para quitar la mayor cantidad de tampón de lavado de los tubos como sea posible sin alterar el pellet de agregadoEd en la parte inferior de los tubos. Rellene los tubos con 1 mL de tampón NGM limpio cada uno.
10. Repita el paso 4.7.2 una vez.

Añadir soluciones de tampón de CuCl $ _₂ $ y M13 10 mM a las placas de ensayo (véase la sección 5 para las recetas).

1. Tape una plantilla de colocación de solución en la parte superior de la etapa del microscopio de disección.
2. Coloque una tira de cinta de doble cara a cada lado de una plantilla de alineación de placas. Asegúrese de que la cinta se solapa con el círculo perimetral de la placa pero no oculta la región de grabación de interés en el centro de la plantilla.
3. Alinee el perímetro de la placa de ensayo con el círculo en la plantilla de alineación de placa y presione hacia abajo hasta que la plantilla se adhiera a la parte inferior de la placa. Alinee los marcadores de número de plantilla de placa de ensayo con los marcadores de plantilla de colocación de disolución en el microscopio de disección.
4. Utilice una pipeta P2 y una punta de plástico para colocar 1 μl del tampón M13 en los cuadrantes 1 y 4 ( 2 solución 10 mM CuCl cada en los cuadrantes 2 y 3 (Figura 2A).
5. Repita los pasos 4.8.2-4.8.4 para las otras dos placas de ensayo.

Una vez que las gotas de solución han sido completamente absorbidas en el agar, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir gusanos lavados de cada tubo de microcentrífuga a la placa de ensayo correspondiente.

Coloque una gota de gusanos cada uno en el área por encima y por debajo de la región tratada circular. Doble un tejido cuatro veces y utilice el borde romo para absorber el exceso de tampón de lavado en todas las placas de ensayo.

Coloque inmediatamente las tres placas de ensayo bajo las cámaras de microscopio en la cámara de comportamiento alineando los números en las esquinas de la plantilla. Espere 2-3 minutos para permitir que los gusanos se aclimaten a las placas de ensayo.
NOTA: Asegúrese de que la tapa de la puerta de la cámara de comportamiento esté cerrada antes de iniciar la grabación de vídeo en el paso siguiente.

Repita los pasos 4.7-4.12 para la siguiente ronda de placas de ensayo. Adquirir al menos seis repeticiones o dos rondas de grabación para cada tratamiento o genotipo.

5. Preparación del reactivo

1. Preparar agar NGM y tampón.
   1. En una botella de vidrio de 1 l, añadir 1,5 g de cloruro de sodio, 8,5 g de agar y 1,25 g de peptona. Añadir 500 ml de agua destilada y una barra de agitación a la botella. Botella autoclave con contenido.
   2. Coloque la botella en una placa de agitación y active la función de agitación.
   3. Añadir en orden con la técnica estéril: 0,5 ml de colesterol 5 mg / ml, 0,5 ml de calcio 1 MCloruro, 0,5 ml de sulfato magnésico 1 M y 12,5 ml de fosfato potásico 1 M.
   4. Repita los pasos 5.1.1 a 5.1.2 para hacer tampón NGM, pero omita el agar y la peptona en el paso 5.1.1.
2. Preparar el caldo LB.
   1. En una botella de vidrio de 1 l, añadir 5 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g de cloruro de sodio, 500 ml de agua destilada y 0,5 ml de hidróxido sódico 1N. Botella autoclave con contenido.
3. Preparar el tampón M13.
   1. En una botella de vidrio de 1 l, añadir 1,817 g de Tris, 2,922 g de cloruro de sodio, 0,373 g de cloruro de potasio y 500 ml de agua destilada. Autoclave la botella con el contenido.
4. Preparar solución de cloruro de cobre (CuCl ₂ ).
   1. Pesar 0,134 g de CuCl $ _₂ $. Añadir soluto a 10 ml de tampón de M13 en un tubo de plástico de 15 ml para hacer mM CuCl ₂ solución madre 100. Invertir el tubo de plástico hasta que todo el soluto haya disueltoLved
   2. Use una jeringa y un filtro de membrana de 0,2 micras para filtrar purificar la solución 100 mM CuCl ₂ en un tubo de plástico limpia de 15 ml.
   3. Para hacer una solución 10 mM CuCl _2, añadir 900 l de M13 tampón y 100 l de 100 mM CuCl solución ₂ stock a un tubo de microcentrífuga. Invertir el tubo de microcentrífuga para mezclar bien.

6. Análisis de video

1. Descargue Python 3 (https://www.python.org/downloads/) y la biblioteca de software OpenCV (http://opencv.org/downloads.html).
2. Descargue los tres scripts de Python para su análisis (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   NOTA: Asegúrese de que todos los archivos de vídeo que desea utilizar estén en formato mp4 antes de continuar.
3. Para ver las descripciones de funciones y parámetros, escriba 'help (enter function name)' en la consola y pulse enter. Por ejemplo, escriba 'help (calibration)' y pulse enter.
4. Ejecutar la función de calibraciónCon parámetros de entrada para definir las regiones de interés de vídeo (ROI).
   1. Introduzca el nombre de archivo del vídeo de calibración tomado en la sección 4 para la variable 'mp4filename'. Incluya comillas al ingresar el nombre del archivo.
   2. Comience con los valores 600 y 360 para las variables 'Q * x' y 'Q * y'. * Introduzca los números de cuadrante 1 a 4. Empiece con el valor 310 para la variable 'rad'. Ajuste los valores de las variables hasta que las máscaras de ROI se alineen con los contornos de cuadrante de la plantilla.
   3. Anote el número total de píxeles en cada ROI que se imprimirá en la consola al ejecutar esta función. Introduzca este valor para el parámetro 'ROI_size' en la función preferencia_index.
5. Ejecute la función threshold_constant para determinar la constante de umbral adecuada. Ajuste el valor "constante" hasta que los gusanos (blanco) se vean claramente y hay un mínimo ruido de sal y pimienta en el fondo (negro).
6. Ejecute la función preference_index para generar una hoja de datos csv, el índice de preferencias del video y el gráfico de ocupación del gusano que lo acompaña.
   1. Utilice los parámetros 'Q * x', 'Q * y', 'rad', 'ROI_size' y 'constante' determinados a partir de los pasos 6.4 y 6.5 como parámetros de entrada para la función preferencia_index.
      NOTA: Para cada trama de video, la función preference_index cuenta el número de píxeles de gusano en cada ROI y calcula el porcentaje de píxeles de gusano fuera del número total de píxeles ROI. La función entonces genera un valor de índice de preferencia para cada trama de video usando la fórmula:
      
      NOTA: Una vez que el programa ha analizado todos los fotogramas del vídeo, se genera un valor de índice de preferencia promedio para el vídeo. Una parcela de ocupación de gusanos con el índice de preferencias del video impreso en la parte superior así como una hoja de datos csv que contienePíxeles de gusano, porcentaje de valores de ocupación de gusanos y el índice de preferencias para cada fotograma de vídeo se guardarán en la carpeta designada una vez que el programa haya terminado de ejecutarse.

Resultados

La Figura 3A muestra los valores del índice de preferencia obtenidos para diferentes genotipos y parejas de tratamiento. Un valor de índice de preferencia de 1 indica una atracción fuerte a la solución colocada en el ROI experimental, mientras que un valor de índice de preferencia de -1 indica fuerte repulsión. Se obtuvo un índice de preferencia de 0,02 cuando la solución tampón M13 se colocó tanto en el ROI control como en el ROI experimental, lo que demuestra que no existe un sesgo espacial hacia ROI. N2 worms fuertemente evitado los iones de cobre, resultando en un índice de preferencia de -0,67, lo que corrobora hallazgos anteriores de que los iones de cobre son un repelente fuerte ( Película Suplementaria 1 ) ⁴ . Osm-3 mutantes, que carece de formación adecuada de los segmentos distales de los cilios sensoriales, mostró una disminución significativamente disminución de los iones de cobre (PI = -0,19) [ ^15] . Ocr-2 mutantes, que son de Fective en muchas respuestas nociceptivas mediadas por ASH, incluyendo la evitación de cobre, también muestran una disminución significativa de la evitación e incluso alguna atracción leve a los iones de cobre (PI = 0,19) ( Película Suplementaria 2 ) ¹⁶ .

La Figura 3B muestra parcelas representativas de ocupación de gusanos, que indican la densidad de gusanos en el control frente a los ROI experimentales a lo largo del tiempo en cada video. Cuanto más oscuro sea el color del área de trazado, mayor será el número de píxeles de gusano en el ROI. El gráfico de ocupación para los gusanos N2 tratados con el control del tampón M13 muestra que el número de gusanos en ambos ROI sigue siendo similar a lo largo del ensayo. Sin embargo, la parcela de ocupación para los gusanos N2 tratados con iones de cobre indica que los gusanos fuerte y consistentemente evitar el retorno de la inversión experimental en todo el ensayo.

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Figura 1: Representación fotográfica y esquemática del diseño de cámara de comportamiento. ( A ) Vista frontal de la disposición de cámara de comportamiento (izquierda) y representación esquemática correspondiente del marco de cámara (derecha). Las hojas opacas de poliéster encierran la cámara en todas las caras excepto la cara inferior, que permite la luz a través del panel de luz de fondo infrarrojo. Los números 1, 2 y 3 corresponden a las capas de extrusión en (B). ( B ) Esquema de vista desde arriba de capas de extrusión que comprenden el marco de cámara de comportamiento. Esto incluye la capa superior (1), la capa de ensamblaje de montaje de cámara central (2) y la capa de etapa inferior (3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Plantillas de colocación de solución y de alineación de placas. ( A ) La plantilla de colocación de solución tiene cuatro cuadrantes y marcadores de alineación de números. La solución de control se coloca en los cuadrantes superior izquierdo e inferior derecho mientras que la solución experimental se coloca en los cuadrantes superior derecho e inferior izquierdo. ( B ) La plantilla de alineación de placas tiene solamente marcadores de alineación de números para minimizar la oclusión de los gusanos en el campo de visión durante la grabación y análisis de vídeo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ejemplo de datos recopilados utilizando este ensayo. ( A ) valores del Índice de Preferencia (PI) para el N2 de tipo salvaje y C. elegans mutante M> en respuesta a tampón M13 y CuCl $ _₂ $ 10 mM. Los gusanos N2 no mostraron ninguna preferencia entre el control y los ROIs experimentales cuando la solución de control M13 se colocó en ambos ROI, pero evitó fuertemente el retorno de la inversión experimental cuando se colocaron iones de cobre (PI = 0,02 y -0,67, respectivamente). Osm-3 (p802) mutantes y ocr-2 (ak47) mutantes mostró significativamente disminución evitación de los iones de cobre en comparación con N2 (PI = -0,1 y 0,2, respectivamente). N = 6 ensayos para cada par de genotipo-tratamiento,> 360 gusanos por ensayo, las barras de error indican ± 1 SEM, *** p <0,001, ANOVA unidireccional seguido de la prueba Tukey Hichamly Significant Difference (HSD) post-hoc. ( B ) Parcelas de ocupación de gusanos representativas para gusanos N2 con tampón M13 en ROIs (superior) y gusanos N2 con tampón M13 en el ROI de control y iones de cobre en el ROI experimental (parte inferior). La escala de color por debajo de cada gráfico de ocupación representa el número de píxeles de gusano.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película suplementaria 1: respuesta conductual de los gusanos N2 a cloruro de cobre 10 mM. Los gusanos se atraen a los cuadrantes de control con tampón M13 (superior izquierdo e inferior derecho), pero evitan fuertemente los cuadrantes que contienen iones de cobre disueltos en tampón M13 (superior derecha e inferior izquierda). El video se grabó a 1 fotograma por segundo y aceleró 15x. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película complementaria 2: Respuesta conductual de los gusanos ocr-2 (ak47) a cloruro de cobre 10 mM. Los gusanos vagan hasta una extensión aproximadamente igual en ambos cuadrantes de control con tampón M13 (superior izquierdo e inferior derecho) y el cuadranteS que contienen iones de cobre disueltos en tampón M13 (superior derecha e inferior izquierda) a lo largo de la duración de la grabación. Los mutantes muestran una ligera preferencia por los cuadrantes que contienen iones de cobre al comienzo de la grabación. El video se grabó a 1 fotograma por segundo y aceleró 15x. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario: Plantillas de colocación de solución y alineación de plantillas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Un paso crítico en el protocolo es asegurar que las placas de ensayo tengan un nivel consistente de sequedad a través de diferentes días experimentales. Diferentes niveles de sequedad resultarán en diferentes velocidades de difusión de la solución en el agar y, en consecuencia, variaciones en el resultado del comportamiento. Por lo tanto, las placas de ensayo siempre deben estar frescas en la tarde antes de los experimentos. El número de gusanos ensayados por ensayo también debe ser regulado para facilitar la comparación entre los tratamientos. Para referencia, un gusano de tipo salvaje pone 4-10 huevos / h en promedio produciendo> 360 gusanos por ensayo si se sigue el protocolo de sincronización del gusano anterior ¹⁷ . Si ciertas cepas mutantes están defec- tando huevos, recoja más gusanos adultos grávidos para la puesta de huevos para alcanzar el número objetivo de progenie. Otro paso importante en el protocolo es manejar los gusanos suavemente durante el proceso de lavado y la colocación del gusano. Los gusanos son sensibles a los estímulos mecánicos, que provocan respuestas de S y la inhibición ^{de la} deposición de huevos ¹⁸ . Además, se debe tener cuidado de definir el ROI con precisión y determinar el valor óptimo de umbral constante para condiciones de iluminación específicas antes de continuar con el análisis de vídeo. También se recomienda repetir los procesos de calibración y de umbral si ha transcurrido un período de tiempo prolongado desde el último experimento.

Una limitación de este método es que no es adecuado para ensayar pequeñas poblaciones de gusanos. Sin embargo, si se llevan a cabo los controles apropiados para determinar la influencia de la presencia de alimentos en el comportamiento sensorial, también es posible utilizar alimentos para restringir la localización exploratoria espacial de los gusanos como en el ensayo de retención. Además, este método no está destinado a estudiar la navegación por gradiente de estímulo debido a la proximidad y pequeñas cantidades de las gotas de solución de control y experimentales utilizadas.

E_content "> En el futuro, el software de programación que permite el rastreo multi-gusano y la extracción de características de gusano único se pueden integrar en este sistema ^{19 , 20. La} grabación de parámetros sutiles de comportamiento de un solo gusano, tales como velocidades de inversión y amplitud de curvas Un cuadro más detallado de la conducta quimiosensorial de un gusano individual en el contexto de un ensayo basado en la población.El ensayo también puede modificarse para estudiar la habituación perforando agujeros a través del ROI utilizando agujas de jeringa con el tamaño de calibre apropiado y llenar los agujeros con agar infundido Con el compuesto experimental o el tampón de control Esto asegurará una concentración superficial más consistente del compuesto durante un período de tiempo de registro más largo como sea necesario durante los estudios de habituación Otra aplicación potencial de este método es conducir estudios de comportamiento comparativos a través de diferentes especies de nematodos. Además, la cámara de comportamientoPueden modificarse de múltiples maneras para estudiar las respuestas conductuales a los estímulos multimodales. Para aplicaciones optogenéticas, se pueden conectar matrices LED de alta intensidad junto al montaje de la cámara para activar selectivamente neuronas de interés durante el ensayo. Elementos calefactores, sistemas de refrigeración y sensores de temperatura también se pueden agregar a la configuración para estudiar los efectos de la temperatura en los comportamientos sensoriales. Además, los sistemas de suministro de olores pueden instalarse dentro de la cámara para investigar las interacciones entre las modalidades odorsensorial y quimiosensorial.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Extrusiones de entramado de aluminio con ranuras en T	McMaster-Carr	47065T101	Perfil único, tamaño de 1", sólido
Soportes	McMaster-Carr	47065T236	" de largo para extrusiones de un solo perfil de 1" de alto Sujetadores
compactos de alimentación final	McMaster-Carr	47065T139	1" (individual), paquete de 4
Soportes de panel sólido	giratorios McMaster-Carr	47065T251	alta extrusión de 1"
	McMaster-Carr	47065T91	Para extrusión de 1" de alta extrusión
Lámina acrílica fundida ópticamente transparente	McMaster-Carr	8560K211	3/16" de grosor, 12" x 12"
Tela de poliéster recubierta de vinilo	McMaster-Carr	88505K57	0.027" de grosor, 61" de ancho, negro
Ojales de	latónMcMaster-Carr	9604K22	Tamaño comercial 0, 0.545" de diámetro exterior
Arandelas de acero	McMaster-Carr	90107A029	Tamaño de tornillo de 1/4"
Tornillos de cabeza redondeada	McMaster-Carr	90272A546	1/4" - 20 tamaño de rosca, 1 - 1/2" de largo
Retroiluminación de funcionamiento estándar	Luces de visión inteligente	Ver proveedor local	8" x 8", infrarrojo 850 nm
IVP-C1 Oleta de control variable	Luces de visión inteligente	Ver proveedor
Fuente de alimentación T1	Luces de visión inteligente	Ver proveedor
Microscopio digital Dino	lite Pro AM4113T	Ver proveedor
Soporte de microscopio MS09B	Microscopio digital Dino-Lite	Ver proveedor local