Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

Summary

Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.

Abstract

Para obtener cultivos celulares 2D tradicional cultivo celular 3D, hemos integrado microfabricación con tecnología cryogelation para producir macroporoso microescala cryogels (microcryogels), que puede ser cargado con una variedad de tipos de la célula para formar microtissues 3D. Adjunto, presentamos el protocolo para fabricar microtissues 3D versátil y sus aplicaciones en la terapia regenerativa y la investigación de la droga. Tamaño y microcryogels forma controlable puede ser fabricado en un chip de la matriz, que puede ser cosechada de chip como portadores cargados de células individuales para terapia regenerativa inyectable o ser más montado en un chip en arreglos de discos de microtissue 3D de alto rendimiento detección de drogas. Debido a la alta naturaleza elástico de estos cryogels de microescala, microtissues 3D exhiben gran inyectabilidad de terapia mínimamente invasiva celular protegiendo a las células de la fuerza de esquileo mecánico durante la inyección. Esto asegura la supervivencia realzada de la célula y el efecto terapéutico en el modelo murino de isquemia del miembro. Mientras tanto, conjunto de matrices de microtissue 3D en un formato estándar de 384-multi-well facilita el uso de instalaciones comunes de laboratorio y equipo, lo que permite la detección en esta plataforma de cultura celular 3D versátil de alto rendimiento drogas.

Introduction

Cultura tradicional de la célula en aplanado superficies de dos dimensiones (2D), como una placa de cultivo o placas de varios pocillos, apenas puede provocar comportamientos celulares cerca de sus Estados nativos. Precisa recapitulación de microambientes celulares nativos, que forman parte de diversos tipos de células, matrices extracelulares y factores solubles bioactivos en arquitecturas (3D) tridimensional^{1,2,3 ,4}, es esencial para construir biomimicking tejidos en vitro para aplicaciones en medicina regenerativa, ingeniería de tejidos, biología fundamental de investigación y drogas descubrimiento^{5,6,7 ,8,9}.

En lugar de cultivo celular 2D, cultivo celular 3D es ampliamente utilizado para avanzar la micro arquitectura biomimética y características funcionales de las células cultivan en vitro. Es un método de cultura popular celular 3D agregadas células en esferoides^7,8,9,10. Esferoides celulares podrían ser inyectados a los tejidos lesionados con mayor retención celular y la supervivencia en comparación con la inyección de células dispersas. Sin embargo, inevitable lesión mecánica impuesta en las células por la fuerza de esquileo flúida durante la inyección y tamaños no uniformes esferoide llevan al pobre celular efectos terapéuticos^11,12,13. Del mismo modo, la inherente falta de uniformidad durante la agregación de esferoides ha hecho su traducción a 3D celular alto rendimiento de detección de drogas difíciles¹⁰.

Otro método para el cultivo celular 3D se logra con la ayuda de biomateriales, que por lo general encapsula las células en acuosos hidrogeles o andamios porosos. Permite una mayor flexibilidad en la construcción de arquitecturas 3D. Para la terapia, las células encapsuladas en andamios a granel se entregan generalmente al cuerpo animal a través de implantes quirúrgicos, invasivos y traumáticos, por lo tanto restringiendo su traducción amplia al paciente. Por otro lado, acuosos hidrogeles permiten terapia mínimamente invasiva mediante la inyección de células suspendidas en solución precursora de hidrogel en cuerpos de animales, lo que en situ la gelificación a través de termo-, reticulación química o enzimática¹¹. Sin embargo, como las células se entregan mientras que los precursores de hidrogel son todavía en un estado acuoso, están también expuestos a esquileo mecánico durante la inyección. No sólo esto, reticulación química o enzimática durante la gelación en situ de hidrogel también podría imponer daño a las células dentro de. Para la detección de drogas, cultivos celulares asistida biomaterial problemas con uniformidad, capacidad de control y rendimiento. Utilizando hidrogeles, las células normalmente participan durante la gelificación, por el cual el proceso puede afectar la función y viabilidad de las células. Congelación durante la siembra de células también impide el uso por la mayoría de equipos de alto rendimiento, puesto que el hidrogel deba conservarse en hielo para evitar la congelación antes de la siembra de la célula, y el hidrogel puede atasc dispensadora de puntas, que son generalmente muy delgadas para asegurar la exactitud de proyección de alto rendimiento. Andamios de formados potencialmente podrían separar procedimientos de fabricación del biomaterial de cultivo celular, sin embargo la mayoría están disponibles como materiales a granel con relativamente bajo rendimiento¹⁴productos a base de andamio.

Para superar algunas de las deficiencias de los actuales métodos de cultura 3D, hemos desarrollado una tecnología de microfabricación-cryogelation integrado para fabricar un microcryogel estándar y fácil de usar array chip¹⁵. En este protocolo, gelatina es seleccionada para ejemplificar la técnica de fabricación de microcryogel ya que es biocompatible, degradable, rentable, y ninguna modificación adicional se requiere para la fijación de la célula. Otros polímeros de fuentes naturales o sintéticas también podrían utilizarse para la fabricación, dependiendo de la aplicación. Mediante esta tecnología, podemos fabricar microcryogels miniatura y muy elástico con controlable tamaño, forma y diseño. Cuando está cargado con una variedad de tipos de la célula, microtissues 3D podría formado para diversas aplicaciones. Estas características únicas permiten inyectabilidad deseado, protección celular y retención dirigida después de la inyección en vivo para mayor efectos terapéuticos. No sólo esto, la microcryogels podría ser procesado más lejos para formar matrices de microtissue 3D que son compatibles con el equipo común de laboratorio e instrumentos para realizar el cultivo celular de alto rendimiento para detección de drogas versátil y otros ensayos celulares. Aquí, vamos detallamos el proceso de fabricación de microcryogels y su posterior tratamiento como microtissues 3D individuales o conjuntos de microtissue 3D para dos aplicaciones importantes, terapia celular y detección de drogas, respectivamente^10,15 .

Protocol

experimentos con animales seguido estricto protocolo aprobado por el Comité de ética Animal en el centro de análisis biomédico de la Universidad de Tsinghua. Bajo aprobación del Comité de ética, el tejido adiposo humano se obtuvo del Departamento de cirugía plástica de Pekín Unión Hospital con consentimiento informado de los pacientes.

1. fabricación de 3D Microcryogels

1. diseño y fabricación de chips de gama microstencil
   1. uso un software comercial para diseño de matrices de geometrías específicas, tales como círculos, elipses, triángulos o tréboles ¹⁴, dependiendo de la aplicación subsecuente.
      Nota: Consulte la sección 2 del protocolo para la medicina regenerativa y artículo 3 del protocolo para la detección de drogas para detalles de diseño.
   2. Importar el diseño en el software que acompaña a la máquina de grabado láser de grabado del laser. Utilizando la configuración de láser según las recomendaciones de la fábrica de la máquina de grabado láser, láser-grabado el diseño importado a Poly (methymethacrylate) (PMMA) hojas de.
   3. Lavar las fichas de microstencil arsenal con agua desionizada para limpiar residuos del grabado del laser. Seca la matriz microstencil virutas a 60 ° C. tienda en una bolsa sellada a temperatura ambiente durante meses.
2. Fabricación de fichas de microcryogel arsenal
   1. 4 lugar microstencil array de chips en la bandeja de muestra e introducir en el plasma limpiador. Cierre la puerta de la máquina y encienda la bomba de vacío durante 2 min., girar en la potencia de RF máxima (18 W) para el tratamiento de las virutas de la matriz de microstencil en el plasma limpiador por 3 min a temperatura ambiente para incrementar la hidrofilicidad.
   2. Gelatina de 0,06 g añadir a 1 mL de agua desionizada para formar 6% (peso/vol) gelatina solución precursora (suficiente para hacer 5 chips). Caliente a 60 ° C en un baño de agua para disolver adecuadamente. Incubar en hielo por 5 min
   3. Agregar 3 μl de glutaraldehido en la solución precursora de gelatina a una concentración final de 0.3%. Mezclar muy bien.
   4. Solución de precursora pipeta de 200 μL con glutaraldehido en la superficie superior de la viruta de la matriz de microstencil.
      Nota: 200 μL es suficiente para un chip de 75 x 25 mm independientemente del diseño. Aumentar la cantidad proporcionalmente cuando se incrementa la superficie de la viruta de.
   5. Manualmente se distribuya la solución sobre el chip raspando la parte posterior y hacia atrás con una varilla de vidrio doblada 2 a 3 veces.
      Nota: Cada micro pozo en el chip de microstencil puede ser llenada con solución precursora debido a su naturaleza hidrofílica después del tratamiento de plasma.
   6. Inmediatamente Coloque el chip de la matriz llena de solución precursora en un congelador de-20 ° C por 16 h de cryogelation.
   7. Ajustar el liofilizador a-40 ° C durante 30 minutos colocar los chips de gama después de cryogelation en el liofilizador y liofilizar las virutas de la matriz por 2 h en vacío.
      Nota: La gelatina microcryogels con macroporos interconectados se forman porque el hielo formado durante cryogelation sublimes en el liofilizador.
   8. Proceder a 2 para el tratamiento de la isquemia crítica del miembro (CLI) de la sección y la sección 3 para proyección de alto rendimiento drogas.

2. Cosecha Microcryogels Individual para Microtissues 3D forma inyectable para el tratamiento de CLI

1. cosecha individual microcryogels
   1. diseño de matrices (75 mm × 25 mm) de 600 círculos, cada uno con 400 μm de diámetro, en software comercial para la construcción de microtissue 3D inyectable. Uso de PMMA de 300 μm de espesor para la fabricación de chip de microstencil matriz como indica en la sección 1.1.
   2. Fabricar chips de matriz de microcryogel como en la sección 1.2.
   3. Fabricar una matriz de PDMS perno del eyector con el mismo diseño como en el paso 2.1.1 por litografía blanda estándar ^{16 , 17}.
   4. El recubrimiento del chip de matriz microcryogel en la parte superior del conjunto de perno del eyector de PDMS, alineando cada microcryogel con un perno del eyector en la matriz. Presione el chip de la matriz de microcryogel hacia la matriz de pin eyector para empujar el microcryogels de los micropocillos con las clavijas que sobresalen en la matriz de pin eyector PDMS cosecha individual microcryogels.
   5. El microcryogel la cosecha en el agua y recoger con la ayuda de los filtros de la célula. Use un colador para recoger microcryogels de un chip (es decir, 600 microcryogels).
   6. Microcryogels de lavado con 0,1 M NaBH ₄ en hielo por 20 min calmar cualquier residuo de aldehído uncross-enlazados. Utilizar 5 mL de 0.1 M NaBH ₄ por chip. Descarte de NaBH ₄ y lavar con 5 mL de agua desionizada durante 15 min de 3 a 5 veces, cada vez.
   7. Tirar el agua de la coladera de la célula y reunir microcryogels en un clúster por colador celular y un clúster en un plato de Petri de 35 mm con una pinza curva. Añadir 50-70 μl desionizada agua a cada cluster y cubre la tapa de la caja Petri. Golpear suavemente la placa de Petri en la mesa de nivelar todos los microcryogels, para que no microcryogels son mentira en la parte superior otro microcryogel para formar una monocapa de microcryogels en la superficie de la placa de Petri.
   8. Congelar las microcryogels cosechadas a-20 ° C por 4 a las 16 h antes de lyophilizing de 2 h (ver paso 1.2.7). Almacenar microcryogels en el vacío a temperatura ambiente hasta su utilización más.
2. Caracterización de microcryogels
   1. evaluar los poros de la microcryogels mediante la exploración de la proyección de imagen de microscopia electrónica (SEM).
      1. Inmovilizar la microcryogels cosechada y liofilizado en un portamuestras por cinta adhesiva de doble cara y escudo de oro con un recubridor sputter por 90 s, antes de la proyección de imagen por SEM ¹¹. Evaluar y analizar la distribución de diámetros de poros en el microcryogel de siete diferentes imágenes de SEM utilizando software de análisis de imagen.
   2. Peso un grupo de 600 microcryogels liofilizados en un plato de Petri de 35 mm para el peso de la gelatina seca microcryogels (GMs). Añadir agua desionizada μl 60 a la agrupación de microcryogels liofilizado y esperar 30 s para microcryogels absorben el agua y se hinchan. Pesar el microcryogels hinchado. Relación hinchazón
      1. Determine el equilibrio y la porosidad del microcryogels, como el cociente del peso de la hinchada microcryogels de microcryogels de la gelatina seca y la relación de peso del agua celebrada en microcryogels al de microcryogels hidratada, respectivamente ¹³.
   3. Inyectabilidad de medida de microcryogels con una bomba de jeringa programable integrada con una fuerza digital calibre ¹⁴.
      1. 600 mancha microcryogels por Trypan azul y suspender en 600 μl 15% gelatina solución para lograr una distribución homogénea. Carga de suspensión de microcryogel de 1 mL en jeringa de 1 mL. Inyectar la mezcla a través de una aguja de calibre 27 a la jeringa de 1 mL con una bomba de jeringa programable en velocidad de flujo de 1 mL/min
      2. Inyección en tiempo real monitor fuerza por fuerza digital calibrador de prueba y trazar la curva fuerza-tiempo. Después de la inyección, observar la integridad de microcryogels bajo el microscopio.
         Nota: GMs suspendidos en solución al 15% (peso/vol) gelatina pueden ser suavemente inyectados y permaneció intactas después de la inyección.
   4. Caracterizan la degradabilidad de microcryogels.
      1. En primer lugar, medir el peso de un grupo de 600 microcryogels liofilizados en un plato de Petri de 35 mm como el peso seco. Luego, sumerja 600 microcryogels liofilizados en 2 mL 0,025% (vol/vol) tripsina/EDTA.
      2. Recoge microcryogels de la solución utilizando un colador de células en diferentes puntos temporales (es decir, 10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70 min). Mecha lejos exceso de solución con un pañuelo. Medir el peso de microcryogels en diferentes puntos temporales y calcular el grado de degradación, como el cociente del peso de microcryogel en un determinado momento de tiempo a la de microcryogel al tiempo cero.
3. Autoloading de células en microcryogels a forma microtissues 3D
   1. esterilizar microcryogels de paso 2.1.8 por sistema de esterilización de óxido de etileno con la exposición de gas 12 h seguido de 12 h de desgasificación bajo vacuum.
   2. Eligen humanas derivados del adiposo stromal células mesenquimales (hMSCs) para el tratamiento de ratón trasera isquémica. Aisladas células por los procedimientos siguientes según lo divulgado previamente ¹⁸.
   3. Cultura hMSCs en el crecimiento medio que contiene 2% de suero bovino fetal (FBS), ng/mL 10 factor de crecimiento epidérmico (EGF), 10 bb ng/mL de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-bb), 1 X selenio de transferrina de insulina (ITS), 10 ^-8 M dexametasona, 10 ^-4 M ácido ascórbico 2-fosfato, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL de DMEM/F12. Paso de las células en la proporción de 1:3 cuando confluente. De células de pasaje 3 a 5 en los experimentos siguientes.
   4. Cosecha de hMSCs con tripsina y cuantificar el número de celular con una cámara de conteo de Fuchs-Rosenthal y suspender a una densidad de 8 x 10 ⁶ células/mL en un medio de hMSCs.
   5. Suspensión de hMSCs μl de pipeta 60 en la monocapa de 600 microcryogels con diámetro de 400 μm en un plato de 35 mm de la sección 2.1. Las células son absorbidas automáticamente en las estructuras de micro porosas de la microcryogels.
   6. Mantener en una cámara humidificada y se incuba a 37 ° C por 2 h permitir que las células a conectar. Después de 2 h de incubación, agregar 2 mL medio de cultivo. Cambiar el medio cada 2 días. Cultura microcryogels cargado de hMSCs durante 2 días formar 3D microtissues.
   7. Después de 2 días de cultivo, Pipetear 100 microcryogels cargado de hMSCs por pozo en una placa de 96 pocillos, agregar 120 μl de solución de resazurina trabajo preparada según el fabricante ' instrucción de s en cada pozo. Incubar por 2 h a 37 ° C.
      1. Detectar fluorescencia de resazurina metabolizado por las células viables en un lector de microplacas con una longitud de onda ligera excitación de 560 nm y emisión de luz longitud de onda de 590 nm. Establecer una curva estándar del número de célula vs fluorescencia usando hMSCs para interpolar el número de células de intensidad de fluorescencia para futuro experimento según el kit protocolo ¹³.
   8. Evaluar número de hMSCs en microcryogels desde el día 0 a día 4 con resazurina como se describe en paso 2.3.7 desde el día 0 al día 4.
   9. Tinción de células en microcryogels con dilución 1: 500 de calceína AM y la dilución de 1: 250 de yoduro de propidio (conocida como tinción de live/dead) en tampón fosfato salino (PBS) y observar en microscopio de fluorescencia o microscopio de fluorescencia confocal.
4. Inyección de microtissues 3D en vivo para el tratamiento de CLI en modelo de ratón
   1. establecer isquemia crítica trasera de hembras BALB/c nude ratones reportados ^{11 , 19} para determinar el efecto terapéutico de la terapia basada en microtissue 3D.
   2. Transferencia de la microtissues de paso 2.3.6 usando una pipeta de 5 mL en un colador de la célula y a filtrar el medio de cultivo.
   3. Suspender el microtissues 3D cargado de hMSCs en solución de gelatina 15%, con una densidad de 100 microcryogels por 100 solución μl.
   4. Antes de la cirugía, esterilizar instrumentos quirúrgicos por autoclave y realizar la cirugía en un quirófano de animales en un centro de instalaciones animales.
   5. Coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100% con un caudal de 1 L/min eritromicina aplicar sobre los ojos del ratón para evitar que se sequen. A través de una incisión en la piel de 1 cm de largo, ligar la arteria femoral y sus ramas con las suturas de seda de 5-10 y suprimir ¹⁹.
   6. Inyectar del verde del indocyanine (ICG) (0.1 mL de 100 μg/mL) a través de la vena de la cola de inyección para monitorear el flujo de sangre. Realizar la proyección de imagen de fluorescencia ICG con una sistema de imagen de la fluorescencia (aquí, sistema casero) en la geometría de reflexión ¹¹.
   7. Intramuscular inyectar microtissues en tres sitios del músculo gracilis alrededor de la incisión de la arteria utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de calibre 23.
   8. Después de la cirugía, mantener el ratón caliente con una almohadilla de calefacción en la jaula de recuperación. Inyectar en forma subcutánea meloxicam para aliviar el dolor y controlar continuamente hasta que despierto.
   9. Después de 28 días, controlar la eficacia terapéutica de la extremidad tratada con microtissue 3D por fluorescencia imágenes ¹¹.
      Nota: Inyectar en forma subcutánea meloxicam para aliviar el dolor cuando el ratón mostró amputación espontánea.
   10. Euthanize ratones con dióxido de carbono después de la terminación de los experimentos.
       Nota: Aquí, eutanasia con dióxido de carbono se realizó según estricto protocolo aprobado por el Comité de ética Animal en el centro de análisis biomédico de la Universidad de Tsinghua.

3. Asamblea de Microtissue Array Chip para la detección de drogas de alto rendimiento

1. montaje de matriz de microcryogel para el cultivo de la en-viruta celular
   1. modificar el diseño en el punto 1.1, según dimensiones de placa multi-bien convencional, es decir, para el formato 384-multi-well, diseñar una matriz de 16 × 24 pozos (fila por columna), cada uno de separación de 2 mm de diámetro y 4,5 mm de centro a centro.
   2. Laser graba sobre una hoja PMMA espesor de 500 μm, como se describe en la sección 1.1.
   3. Fabricar microcryogels como se describe en la sección 1.2 uso de que el chip de 384-multi-well matriz obtenido paso 3.1.2. Esta matriz que contiene microcryogel es señalada como el chip de la matriz de microcryogel.
   4. El chip de la matriz de microcryogel de lavado con 50 mL 0.1 M NaBH ₄ saciar cualquier aldehído residual uncross-ligado, luego repetidamente enjuague con 50 mL de agua desionizada para h 2 3 veces, cada vez.
   5. Deseche el agua, la congelación de la viruta de la matriz de microcryogel a-20 ° C por 4 a las 16 h antes de 1.llenar según paso 1.2.7.
   6. Diseño de matriz de modificar 384-multi-well en paso 3.1.1 para contener 16 × 24 pozos, cada uno de separación de 3 mm de diámetro y 4,5 mm de centro a centro.
   7. Quitar un lado de la base de una hoja de ultra finas (10 μm) biocompatible doble cara cinta adhesiva y pegarlo a un lado de un pedazo de hoja de PMMA de 3 mm de espesor. Laser graba el diseño del paso 3.1.4 en esta hoja PMMA de 3 mm de espesor según el artículo 1.1. Esta matriz ha sido designada como la matriz embalse.
   8. Alinee el conjunto de microcryogel de la viruta con el chip de depósito matriz y adherirse juntos firmemente para montar el chip de la matriz de microcryogel 3D para el cultivo celular de la en-viruta. Esterilizar por radiación ultravioleta para 1 h.
   9. Matriz 3D microcryogel tienda fichas en vacío a temperatura ambiente durante experimentos adicionales.
2. Drug screening en arreglos de discos de microtissue 3D
   1. llenar una caja húmeda con 25 mL de agua desionizada estéril para servir como una cámara de humedad para el cultivo celular. Pre-heat en un vapor 5% CO ₂ incubadora a 37 ° C.
   2. Cosecha de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NCI-H460) y las células del carcinoma hepatocelular (HepG2) de las placas de cultivo de tejidos según protocolo estándar y vuelva a suspender en medios de cultivo a una densidad final de 1.0 x 10 ⁶ células/mL. Mezclar muy bien.
      Nota: RPM1640 con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL se utiliza para NCI-H460. Uso de DMEM con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL para HepG2.
   3. Extraiga la cámara de humedad de la incubadora. Utilice unas pinzas para cuidadosamente lugar 3D montado microcryogel array chip de paso 3.1.9 de la cámara de humedad. Tener cuidado de no mojar el microcryogels con agua en la cámara de.
   4. Mezclar la suspensión de células, entonces alícuota 3 μl de suspensión celular directamente en el microcryogel en cada pocillo.
      Nota: La punta debe tocar ligeramente la superficie de la microcryogel antes de expulsar de la suspensión celular. Las células son auto cargado en el microcryogel por absorción. No de semilla de las células en los pocillos periféricos.
   5. Añadir 10 μL de los medios de comunicación a cada pocillo después de que las células se siembran en microcryogel con pipeta de varios canales, como un controlador líquido de 96 canales. Medio también se añade a los pocillos periféricos.
      Nota: Los medios de uso RPM1640 con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL streptomycin para las células H460. Utilizar medios DMEM con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL para las células de HepaG2.
   6. Cultura la matriz de célula de carga microcryogel de la viruta en la cámara de humedad durante 24 h en un vapor 5% CO ₂ incubadora a 37 ° C en forma microtissue 3D array.
   7. Disolver doxorrubicina y IMMLG-8439 ⁹ en dimetil sulfóxido (DMSO) para formar una solución stock de 10 mM. Diluir medicamentos con medio de cultivo para formar un gradiente de concentración de la dilución de 10 veces de 2 nM a 200 μm.
   8. Añadir 10 μl de las soluciones de drogas en cada pozo. Usar 0,1% DMSO (diluido en medio) como el control. Incubar la matriz de microtissue 3D cargado de droga en humidificado 5% CO ₂ incubadora a 37 ° C por 24 h.
   9. Añadir 4 μL de solución madre de resazurina en cada pocillo. Incubar a 37 ° C para la matriz de microtissue lugar el 3D de 2 h. en el lector de microplacas y detectar la fluorescencia de resazurina metabolizado por las células viables en una longitud de onda ligera excitación de 560 nm y emisión de luz longitud de onda de 590 nm.
   10. Restar la señal de referencia de resazurina de todos los pozos antes de procesamiento de datos más. Calcular la fracción de viabilidad celular de cada pocillo dividiendo la señal de fluorescencia por la señal de fluorescencia promedio de los pocillos control.
   11. Trazar la curva de dosis-respuesta en software de trazado con la fracción de viabilidad celular como el de las ordenadas y el logaritmo base 10 de la concentración de la droga como el eje x. Interpolar la concentración de inhibición del 50% (IC50) en la fracción de viabilidad de células de 0.5.

Results

Fabricación y caracterización de microcryogels para la formación del microtissue 3D.

Según este protocolo, microcryogels fueron fabricados para forma el 3D microtissues y microcryogels individuales o conjuntos de microcryogel y fueron aplicados a la terapia regenerativa y de la droga detección, respectivamente (figura 1). Microstencil fichas de matriz de PMMA fueron aplicados como m...

Discussion

Regenerativos modelos de medicina y en vitro para la detección de drogas son dos aplicaciones importantes de tejido ingeniería^5,6,7,8,9. Mientras que estas dos aplicaciones tienen necesidades muy diferentes, una tierra común entre ellos radica en la necesidad de una más biomiméticos condición de cultivo para mejorar las funciones de la célula

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatina	sigma	G7041	Todos los demás reactivos se compraron a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario.
Glutaraldehído	J& K	902042	Se utiliza como reticulante en la preparación del material.
Cubreobjetos de vidrio (24 x 50 mm)	CITOGLASS, China	10212450C	Para raspar la solución del cursor en chips de matriz de microplantillas.
Sodio  borohidruro de NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	Para lavar el glutaraldehído restante después de la gelificación.
Tarro de vacío	asperts, China	VC8130	Para conservar microgeles al vacío.
Láminas de polimetilmetacrilato (PMMA);	Sunjin Electronics Co., Ltd, China		Hojas ordinarias de PMMA.
Sistema láser	Rayjet Rayjet, Australia	Rayjet 50 C30	Para grabar láminas de PMMA para formar pozos.
Limpiador de plasma	Mycro Technologies, EE. UU.	PDC-32G	Para hacer que el PMMA sea hifofílico.
Liofilizador	Boyikang, China	SC21CL	Para liofilizar materiales.
Solución de azul de tripano (0.4%)	Zhongkekeao, China	DA0065	Para teñir microgeles.
Clorhidrato de doxorrubicina	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	Para probar la resistencia a los medicamentos de las células en microgel 2D o 3D.
Ensayo vivo/muerto	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japón)	CS01-10	Para distinguir células vivas y muertas.
Cell Titer-Blue	Promega (Wisconsin, Estados Unidos).	G8080	Para probar la viabilidad de la célula.
Filtro de células	BD Biosciences, USA	352360	Para recolectar microgeles.
D-Luciferin	SYNCHEM (Alemania)	s039	Para pegar células.
Microscopio electrónico de barrido	FEI, EE. UU	Quanta 200	Para caracterizar la morfología del microgel.
Máquina de ensayos mecánicos	Bose, USA	3230	Para medir las características mecánicas.
Bomba de jeringa programable	World Precision Instruments, EE. UU	ALADINI 1000	Para probar injactabiliy.
Medidor de fuerza digital	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China	H-50	Para probar injactabiliy.
Sistema de esterilización por óxido de etileno	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	Para esterilizar microgeles con gas de óxido de etileno.
Lector de microplacas	Molecular Devices, EE. UU	M5	Para medir la intensidad de fluorescencia en micro-array.
Microscopio confocal	Nikon, Japón	A1Rsi	Para observar la distribución celular en 3D.
Xenógeno  Sistema de imagen Lumina II	Caliper Life Sciences, EE. UU.	IVIS	Para rastrear células en animales.
Estado de trabajo líquido	Diseño de albaricoque,	pipeta S de	. Para cargar el medio o la suspensión de celda de alta potencia.