Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.
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Artículo de método
Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento
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Resumen
Resumen
Para obtener cultivos celulares 2D tradicional cultivo celular 3D, hemos integrado microfabricación con tecnología cryogelation para producir macroporoso microescala cryogels (microcryogels), que puede ser cargado con una variedad de tipos de la célula para formar microtissues 3D. Adjunto, presentamos el protocolo para fabricar microtissues 3D versátil y sus aplicaciones en la terapia regenerativa y la investigación de la droga. Tamaño y microcryogels forma controlable puede ser fabricado en un chip de la matriz, que puede ser cosechada de chip como portadores cargados de células individuales para terapia regenerativa inyectable o ser más montado en un chip en arreglos de discos de microtissue 3D de alto rendimiento detección de drogas. Debido a la alta naturaleza elástico de estos cryogels de microescala, microtissues 3D exhiben gran inyectabilidad de terapia mínimamente invasiva celular protegiendo a las células de la fuerza de esquileo mecánico durante la inyección. Esto asegura la supervivencia realzada de la célula y el efecto terapéutico en el modelo murino de isquemia del miembro. Mientras tanto, conjunto de matrices de microtissue 3D en un formato estándar de 384-multi-well facilita el uso de instalaciones comunes de laboratorio y equipo, lo que permite la detección en esta plataforma de cultura celular 3D versátil de alto rendimiento drogas.
Introducción
Cultura tradicional de la célula en aplanado superficies de dos dimensiones (2D), como una placa de cultivo o placas de varios pocillos, apenas puede provocar comportamientos celulares cerca de sus Estados nativos. Precisa recapitulación de microambientes celulares nativos, que forman parte de diversos tipos de células, matrices extracelulares y factores solubles bioactivos en arquitecturas (3D) tridimensional1,2,3 ,4, es esencial para construir biomimicking tejidos en vitro para aplicaciones en medicina regenerativa, ingeniería de....
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Protocolo
experimentos con animales seguido estricto protocolo aprobado por el Comité de ética Animal en el centro de análisis biomédico de la Universidad de Tsinghua. Bajo aprobación del Comité de ética, el tejido adiposo humano se obtuvo del Departamento de cirugía plástica de Pekín Unión Hospital con consentimiento informado de los pacientes.
1. fabricación de 3D Microcryogels
- diseño y fabricación de chips de gama microstencil
- uso un software comercial para diseño de matrices de geometrías específicas, tales como círculos, elipses, triángulos o tréboles 14, dependiendo de la aplicación ....
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Resultados
Fabricación y caracterización de microcryogels para la formación del microtissue 3D.
Según este protocolo, microcryogels fueron fabricados para forma el 3D microtissues y microcryogels individuales o conjuntos de microcryogel y fueron aplicados a la terapia regenerativa y de la droga detección, respectivamente (figura 1). Microstencil fichas de matriz de PMMA fueron aplicados como m.......
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Discusión
Regenerativos modelos de medicina y en vitro para la detección de drogas son dos aplicaciones importantes de tejido ingeniería5,6,7,8,9. Mientras que estas dos aplicaciones tienen necesidades muy diferentes, una tierra común entre ellos radica en la necesidad de una más biomiméticos condición de cultivo para mejorar las funciones de la célula
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (subvenciones: 81522022, 51461165302). Los autores desean reconocer a todos los miembros de laboratorio de Du de asistencia general.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Gelatina | sigma | G7041 | Todos los demás reactivos se compraron a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario. |
| Glutaraldehído | J& K | 902042 | Se utiliza como reticulante en la preparación del material. |
| Cubreobjetos de vidrio (24 x 50 mm) | CITOGLASS, China | 10212450C | Para raspar la solución del cursor en chips de matriz de microplantillas. |
| Sodio borohidruro de NaBH4 | Beijing Chemical Works | 116-8 | Para lavar el glutaraldehído restante después de la gelificación. |
| Tarro de vacío | asperts, China | VC8130 | Para conservar microgeles al vacío. |
| Láminas de polimetilmetacrilato (PMMA); | Sunjin Electronics Co., Ltd, China | Hojas ordinarias de PMMA. | |
| Sistema láser | Rayjet Rayjet, Australia | Rayjet 50 C30 | Para grabar láminas de PMMA para formar pozos. |
| Limpiador de plasma | Mycro Technologies, EE. UU. | PDC-32G | Para hacer que el PMMA sea hifofílico. |
| Liofilizador | Boyikang, China | SC21CL | Para liofilizar materiales. |
| Solución de azul de tripano (0.4%) | Zhongkekeao, China | DA0065 | Para teñir microgeles. |
| Clorhidrato de doxorrubicina | ENERGY CHEMICAL, China | A01E0801360010 | Para probar la resistencia a los medicamentos de las células en microgel 2D o 3D. |
| Ensayo vivo/muerto | Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japón) | CS01-10 | Para distinguir células vivas y muertas. |
| Cell Titer-Blue | Promega (Wisconsin, Estados Unidos). | G8080 | Para probar la viabilidad de la célula. |
| Filtro de células | BD Biosciences, USA | 352360 | Para recolectar microgeles. |
| D-Luciferin | SYNCHEM (Alemania) | s039 | Para pegar células. |
| Microscopio electrónico de barrido | FEI, EE. UU | Quanta 200 | Para caracterizar la morfología del microgel. |
| Máquina de ensayos mecánicos | Bose, USA | 3230 | Para medir las características mecánicas. |
| Bomba de jeringa programable | World Precision Instruments, EE. UU | ALADINI 1000 | Para probar injactabiliy. |
| Medidor de fuerza digital | HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China | H-50 | Para probar injactabiliy. |
| Sistema de esterilización por óxido de etileno | Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC | AN74i | Para esterilizar microgeles con gas de óxido de etileno. |
| Lector de microplacas | Molecular Devices, EE. UU | M5 | Para medir la intensidad de fluorescencia en micro-array. |
| Microscopio confocal | Nikon, Japón | A1Rsi | Para observar la distribución celular en 3D. |
| Xenógeno Sistema de imagen Lumina II | Caliper Life Sciences, EE. UU. | IVIS | Para rastrear células en animales. |
| Estado de trabajo líquido | Diseño de albaricoque, | pipeta S de | . Para cargar el medio o la suspensión de celda de alta potencia. |
Referencias
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Loessner, D., et al.
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Reimpresiones y permisos
