Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Resumen

Aquí, proponemos un protocolo para la diferenciación condrogénica de células madre pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células mononucleares de sangre del cordón umbilical.

Resumen

El cartílago articular humano carece de la capacidad de repararse. Por lo tanto, la degeneración del cartílago no se trata por tratamientos curativos sino por tratamientos conservadores. Actualmente, se están haciendo esfuerzos para regenerar el cartílago dañado con condrocitos expandidos ex vivo o células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BMSCs). Sin embargo, la viabilidad limitada y la inestabilidad de estas células limitan su aplicación en la reconstrucción del cartílago. Las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSCs) han recibido atención científica como una nueva alternativa para aplicaciones regenerativas. Con ilimitada capacidad de auto-renovación y multipotencia, HiPSCs se han destacado como una nueva fuente de células de reemplazo para la reparación del cartílago. Sin embargo, la obtención de una gran cantidad de gránulos condrogénicos de alta calidad es un reto importante para su aplicación clínica. En este estudio, se utilizó el cuerpo embrioide (EB) derivado de las células de crecimiento para la diferenciación condrogénica. La condrogénesis exitosa fue confirmada por PCR yD con azul alciano, azul de toluidina y anticuerpos contra los tipos de colágeno I y II (COL1A1 y COL2A1, respectivamente). Proporcionamos un método detallado para la diferenciación de células madre mononucleares derivadas de células madre ipSCs (CBMC-hiPSCs) en chondrogenic pellets.

Introducción

El uso de hiPSCs representa una nueva estrategia para la detección de drogas y estudios mecánicos de diversas enfermedades. Desde una perspectiva regenerativa, hiPSCs son también una fuente potencial para la sustitución de los tejidos dañados que tienen capacidad de curación limitada, como el cartílago articular ^{1 , 2} .

La regeneración del cartílago articular nativo ha sido un reto durante varias décadas. El cartílago articular es un tejido suave y blanco que recubre el extremo de los huesos, protegiéndolos de la fricción. Sin embargo, tiene una capacidad regenerativa limitada cua....

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC12TISI0861). CBMCs utilizados para la reprogramación se obtuvieron directamente del Banco de Sangre de Cordón del Hospital St. Mary de Seúl.

1. Diferenciación condrogénica de iPSCs

1. Generación CBMC-iPSC
   1. Generar CBMC-hiPSCs utilizando el protocolo mostrado en nuestro trabajo anterior ²³ .
   2. Recoja las células de la sangre en un tubo cónico de 15 ml y cuente con un hemocitómetro.
   3. Preparar 3 x 105 células y centrifugarlas durante 5 min a 515 xg y RT. Desechar e....

Resultados

En este estudio, hemos generado gránulos condrogénicos de CBMC-hiPSCs por inducir las células de extracción de EBs. La diferenciación condrogénica se indujo utilizando CBMC-HiPSCs con confirmada alta pluripotencia [ ^11] . Un esquema simple de nuestro protocolo se muestra en la Figura 1A . Antes de la diferenciación, las colonias de iPSC se expandieron ( Figura 1B ). Los iPSCs ampliado se ensamblaron como .......

Discusión

Este protocolo generó con éxito HiPSCs de CBMCs. Se reprogramaron CBMCs a hiPSCs utilizando un vector viral Sendai que contiene Yamanaka factores [ ^24] . Tres casos se utilizaron en la diferenciación, y todos los experimentos generados con éxito chondrogenic pellets utilizando este protocolo. Numerosos estudios han informado de protocolos para la diferenciación de hiPSCs en condrocitos ^{25 , 26 , 27 .......}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Artículos de plástico
100 mm Plato	TPP	93100
Placa de 6 pocillos	TPP	92006
50 mL Tubo Córnico	SPL	50050
15 mL Tubo Córnico	SPL	50015
10 mL Pipeta Desechable	Falcon	7551
5 mL Pipeta desechable	Falcon	7543
Placa de 12 pocillos	TPP	92012
Name	Company	Número de catálogo	Descripción
>E8 Materiales medianos
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medio (500 mL)
Bicarbonato de sodio	Life Technologies	25080-094	E8 Medio (Conc.: 543 μ g/mL)
Selenito de Sodio	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medio  (Conc.: 14 ng/mL)
Transfferina humana	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medio (Conc.: 10.7 μ g/mL)
Básico FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medio  (Conc.: 100 ng/mL)
Insulina	Humana Life Technologies	12585-014	E8 Medio (Conc.: 20 μ g/mL)
TGF humano y beta; 1	Peprotech	100-21	E8 Medio (Conc.: 2 ng/mL)
Ácido Ascórbico	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medio  (Conc.: 64 y mu; g/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectina	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibidor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Número de catálogo	Descripción
control de calidad Materiales
18 mm Cubierta de vidrio	superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovación	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Albúmina sérica bovina	Vector Lab	SP-5050
Anticuerpo anti-SSEA4	Millipore	MAB4304
Anticuerpo Anti-Oct4	Santa Cruz	SC9081
Anticuerpo Anti-TRA-1-60	Millipore	MAB4360
Anticuerpo anti-Sox2	Biolegend	630801
Anticuerpo Anti-TRA-1-81	Millipore	MAB4381
Anticuerpo Anti-Klf4	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón anti-anti-ratón IgG (H+L)	sonda molecular	A11029
Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo anti-conejo IgG (H+L)	Sonda molecular	A11037
Sonda molecular DAPI		D1306
Reactivo antidecoloración de oro	prolongado Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovación	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Albúmina sérica bovina	Vector Lab	SP-5050
Anti-Colágeno II	anticuerpo abcam	ab34712	1:100
Azul Alcián	Sigma Aldrich	A3157-10G
Verde Rápido FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Rojo rápido nuclear	Americanmastertech	STNFR100
xileno	Duksan	115
Etanol	Duksan	64-17-5
Solución de hematoxilina de Mayer	Industrias químicas puras	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Portaobjetos de vidrio, recubierto	Hyun il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Cloroformo	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore 109634
Etanol	Duksan	64-17-5
RevertAid Primera hebra Kit de síntesis de ADNc	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Número de catálogo	Descripción
Materiales de diferenciación condrogénica
DMEM	Life Technologies	11885	Componente de medios condrogénicos (500 mL)
Penicilina Estreptomicina	Life Technologies	P4333	Componente de medios condrogénicos (Conc.: 1%)
Ácido ascórbico	Sigma Aldrich	A8960	Componente condrogénico del medio (Conc.: 64 μ g/mL)
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)	Life Technologies	11140-050	Componente de medios condrogénicos (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R& D	355-BM-050	Componente de medio condrogénico (Conc.: 100 ng/ml)
Hman recombinante TGF-beta3	R& D	243-B3-002	Componente de medios condrogénicos (Conc.: 10 ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028 Componente de	medios condrógenos (Conc.: 1%)
ITS+ Premix	BD	354352	Componente de medios condrogénicos (Conc.: 1%)
Dexametasona-Soluble en agua	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Componente de medios condrogénicos (Conc.: 10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Componente de medios condrogénicos (Conc.: 1%)
Solución de piruvato de sodio	Sigma Aldrich	S8636	Componente de medios condrogénicos (Conc.: 1%)
L-Prolina	Sigma Aldrich P5607-25G		Medios condrogénicos componente (40 μ g/ml)