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Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

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DOI:

10.3791/55994

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25 de agosto de 2017

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1Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

En este artículo

Resumen

Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

Resumen

Vectores de virus adeno-asociado (AAV) son un reactivo dominante en las neurociencias agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) optogenetics, cre-lox targeting, etcetera. El objetivo de este manuscrito es ayudar al investigador tratar de transferencia de genes de la expansiva del sistema nervioso central (SNC) en la rata mediante inyección en la vena cola de AAV. Expresión de gran escala es relevante para las condiciones con patología extensa, y un modelo de rata es significativo debido a su mayor tamaño y las semejanzas fisiológicas a los seres humanos en comparación con ratones. En esta aplicación de ejemplo, una transducción neuronal de gran escala se utiliza para imitar una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la médula espinal entera, esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La transducción eficiente de CNS de gran escala también puede utilizarse para proporcionar factores de proteína terapéutica en estudios pre-clínicos. Después de un intervalo de expresión después de la inyección de varias semanas, se evaluaron los efectos de la transducción. Para una proteína fluorescente verde (GFP) control de vectores, la cantidad de GFP en el cerebelo calcula rápidamente y confiablemente por un programa básico de la proyección de imagen. Para fenotipos de enfermedad motor que son inducidos por la ALS respuesta transactive proteína DNA-proteína de 43 kDa (TDP-43), los déficits son anotados por rotarod y el reflejo del escape. Más allá de modelos de enfermedad y la terapia génica, existen diversas aplicaciones potenciales para el gene de gran escala dirigidas a descrito aquí. El uso expandido de este método ayudará a acelerar la prueba de las neurociencias y la Neurogenética de hipótesis.

Introducción

Vectores de virus recombinante adeno-asociado (AAV) son herramientas imprescindibles para la investigación del CNS porque son tan eficaces transducción in vivo de neuronas. Los vectores AAV son muy versátiles para estudiar diferentes transgenes e isoformas de la proteína, diferentes tejidos, diferentes especie y diferentes vías de administración. Por ejemplo, AAV puede ser administrado a ratones por un periférico, relativamente no-invasivo, inyección intravenosa para transducir las neuronas en el SNC como primero descrito en Foust et al. y Duque et al. (véase papel de JOVE por Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 se utiliza este enfoque de entrega de genes en ratas expresar eficientemente cualquier proteína fluorescente verde (GFP) o la ALS proteínas, respuesta transactive ADN-proteína de 43 kDa (TDP-43) en el SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 trabajo en ratas es significativo porque los parámetros fisiológicos y metabólicos de la rata están más cercanos de los seres humanos en comparación con ratones y hay ensayos conductuales y toxicológicos diseñados específicamente para las ratas. Además, más líneas de ratas transgénicas están volviendo disponibles que puede ser utilizado en estudios de transferencia de genes AAV.

Se detallan métodos expansivos CNS transferencia de genes en la rata y cuantificación rápida y confiable de los resultados. Transducción de CNS de gran escala se utiliza para imitar la sintomatología de la ELA en ratas expresando TDP-43 a lo largo de la médula espinal. El método es inyecciones de vena de cola del vector TDP-43 a ratas adultas jóvenes según lo utilizado en Jackson et al. 6 , 8 , 9 después de varias semanas, déficits motor TDP-43-inducida son marcados por dos métodos: escapar de reflejo y rotarod en Dayton et al. y Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 para el vector de control GFP, en análisis post-mortem, la zona fluorescente del cerebelo se calcula como un índice de eficiencia de la transducción de señales en Jackson et al. 6 , 8 el análisis del cerebelo ha demostrado para ser un índice rápido y confiable del grado de transducción CNS después de la entrega del gene periférico y debe ser aplicable a una variedad de métodos de transferencia génica de periférica a central.

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Protocolo

todos los procedimientos siguieron las pautas apropiadas de NIH. Todos los procedimientos siguieron protocolos animales que fueron aprobados por el cuidado Animal y uso en LSU Health Sciences Center en Shreveport. Para este procedimiento se utilizaron ratas hembras Sprague-Dawley a las 6 semanas de edad.

1. determinar los dosis/volúmenes de vector necesitada

  1. pesan las ratas al ser inyectado y determinar la cantidad de vector viral necesaria para cada animal basadas en el título (concentración) de la preparación del vector. Usan dosis de vectores que han tenido éxito para la expresión eficiente de la rata del CNS previamente (ver Jackson et al. 6).
    Nota: para el AAV9 TDP-43 o AAV9 GFP, una dosis típica es entre 3 x 10 13 - 1 x 10 14 vector genomas/kg. Las ratas adultas jóvenes a las 6 semanas de edad pesan unos 150 g.
  2. Hacer dosis equivalentes por kg en todos los animales para comparaciones sistemáticas. Asegúrese de que el volumen supere los volúmenes estándar inyección aconsejada (250-500 μl de una rata de 250 g). Un volumen de inyección típica es 200 μl a una rata adulta joven.

2. Preparar la estación de trabajo

  1. reunir materiales necesarios: una película de parafina cuadrado (aproximadamente 5 x 5 cm) por animal, cojín de preparación de un alcohol por gasas animales, (2-3 por animal), puntas de pipeta y una micropipeta.
  2. Preparación de la superficie de trabajo de limpieza de la superficie con etanol al 70%. Coloque una almohadilla de calefacción hacia abajo con la temperatura regulada a la baja (~ 37 ° C). Coloque una almohadilla de banco encima de la almohada eléctrica.
  3. Preparar la anestesia de gas (isoflurano). Asegurar suficiente oxígeno y gas anestesia para el procedimiento. Limpiar la mascarilla de anestesia y cámara de inducción con etanol al 70% y coloque la máscara de la anestesia sobre la almohadilla del Banco.

3. Preparar el vector

  1. descongelar el vector a temperatura ambiente y un tubo de microcentrífuga estéril para cada animal de la etiqueta.
  2. Pipeta el volumen de AAV determinado en paso 1.1 en el tubo correspondiente y llevar el volumen hasta el volumen de inyección deseado (aquí, 200 μl) con Ringer entibiada ' s solución o solución salina.
  3. Vortex la muestra para 1-2 s y y la entonces pulsación centrifugue durante 5 s para traer la muestra a la parte inferior del tubo de.
  4. Pipeta el volumen total de inyección para la rata por el tubo y en la Plaza de la película de parafina.
  5. Colocar una aguja de 30 calibre en una jeringa de 1 mL.
  6. Coloque la aguja con el bisel mirando hacia abajo en el vector en la película de parafina. Tire el émbolo de la jeringa hasta que el virus está en la aguja y la jeringa. Tenga cuidado para evitar burbujas de aire en la aguja, que se hace más fácil con la práctica.

4. Preparar la rata

  1. gire el oxígeno hasta 1 L/min y la anestesia isoflurano en 5%. Asegúrese de que la anestesia de gas fluye a la cámara de inducción revisando todas las mangueras de conexión y llave de paso orientaciones.
  2. Colocar la rata en la cámara de inducción de anestesia de gas alrededor de 3 minutos, hasta que la rata es insensible.
  3. Garantizar la adecuada profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie. No debe haber ningún movimiento en el pie o la pierna después del pellizco del dedo del pie.
  4. Reducir la anestesia isoflurano al 2% para el mantenimiento de la anestesia y ajuste la llave de paso para que la anestesia está fluyendo a la máscara de la anestesia.
  5. Colocar la rata ' s de la nariz en la máscara de la anestesia y ajustar la rata que está mintiendo en su lado.
  6. Identificar la vena lateral de la cola.
    Nota: Las venas laterales de la cola se encuentran en aproximadamente 10 a 2 o ' reloj con la parte superior dorsal de la cola como 12 o ' reloj. Con la rata acostado a su lado, la vena lateral de la cola debe estar hacia arriba
  7. Limpiar la zona de inyección con el cojín de la preparación de alcohol. El sitio de inyección es dos tercios la longitud de la cola.

5. Inyectar el vector

  1. Sujete la cola ligeramente por encima de la zona de inyección con un dedo directamente sobre la vena lateral de la cola; esto dilatar la vena.
  2. Con el bisel hacia arriba, alinee la aguja con la vena de la cola visible en la misma dirección.
  3. Perforar la piel sobre la vena de la cola mientras se toma gran cuidado para evitar que la otra mano sosteniendo la cola y presión sobre la vena de la cola.
  4. Libere la presión de la vena de la cola para permitir el flujo normal de sangre.
  5. Mover la aguja en la vena. Para asegurar que la aguja ha perforado la vena de la cola, tire levemente del émbolo. Si la aguja está en la vena, la sangre fluirá dentro de la aguja.
    1. Reposicionar la aguja según sea necesario. A continuación, para estabilizar la aguja, mover la mano sobre el sitio de la inyección a debajo del sitio de la inyección y mantenga el extremo de la jeringa contra la cola.
  6. Lentamente inyectar el vector en la cola (aproximadamente 20 μl/s).
    Nota: La vena puede perder el color como el vector atraviesa. Los signos que se inyectó la solución fuera de la vena incluyen blebbing, palidez de la piel, o resistencia al inyectar el vector. Con la práctica, puede minimizarse la exposición extra vascular.
  7. Después de que el vector ha sido administrado, retire la aguja de la rata y coloque una almohadilla de Gasa contra el sitio de la inyección para ayudar a frenar la sangría de 30-60 s.

6. Limpieza

  1. apagar el isoflurano anestesia y oxígeno. Supervisar la rata hasta que recupere conciencia y luego devolverlo a su jaula.
  2. Cuidadosamente coloque las agujas en el contenedor de objetos punzantes. Disponer de otros materiales desechables que están potencialmente contaminadas con AAV en un recipiente de riesgo biológico apropiado. Limpiar las estaciones de trabajo con etanol al 70%.

7. Evaluar reflejo de escape trasera

Nota: miembro posterior déficit generalmente se presenta 2 a 6 semanas después de la transferencia de genes de la TDP-43, dependiendo de la dosis de vector.

  1. En una superficie plana clara de escombros, con dos dedos coge la rata ' s cola de aproximadamente 2 cm del cuerpo. Levante suavemente la rata hasta que las extremidades anteriores están colgando mientras se observa la parte inferior ventral de la rata.
    1. Realizar el procedimiento cada semana durante el curso del tiempo experimental después de la transferencia de genes (por ejemplo, hasta 12 semanas después de la transferencia de genes).
      Nota: Anotar también déficits de miembro anterior de esta manera, pero déficits trasera son más probables que ocurra en este modelo, dependiendo de la dosis de vector utilizada.
  2. Observar los miembros posteriores de 10 s. Nota Si uno o ambos miembros posteriores aprietan hacia la línea media durante los 10 s.
  3. Repetir esta prueba para un total de tres veces con 30 s entre los ensayos. Si uno o ambos miembros posteriores son cerrados para cada uno de los tres ensayos, la rata muestra disfunción del motor. Registrar los datos (manualmente en notas) como cualquier déficit de miembro posterior unilateral o bilateral actual si hay constante apretamiento en los tres ensayos.

8. Evaluar la función motora en el rotarod

  1. para configurar el rotarod, coloque una almohadilla de banco bajo el rotarod y aceleración en 4-40 revoluciones por minuto (rpm) durante 2 min (la velocidad aumenta por ~0.3 rpm/s). Para un curso de tiempo de 12 semanas, corren los temas 2, 4, 8 y 12 semanas después gene transfer.
  2. Permite la rata se adapte a la sala de pruebas durante 20 min
  3. Formar la rata con el rotarod por primera vez, primero iniciar el rotarod a una velocidad de 4 rpm, luego colocar la rata en el rotarod. Permiten la rata a caminar una vuelta completa a 4 rpm, a continuación, iniciar la aceleración y permiten la rata a caminar en el rotarod hasta que se desprenda. Continuar entrenamiento hasta que la rata puede caminar constantemente por lo menos 40 s. Una rata adulta sana, los jóvenes será capacitada fácilmente de esta manera.
    1. En el caso de una rata con un notable deterioro motor, que puede impedir que la rata logro una latencia inicial para bajar de 40 s, proporcionar la rata 3-5 intentos de formación antes de comenzar anotando rotarod.
  4. Para comenzar la prueba del rotarod, colocar la rata en el rotarod y empezar a aceleración del rotarod. Nota el tiempo en que la rata cae desde el rotarod; se trata de la latencia a caer. Si la rata se mantiene en el rotarod después 120 s, tapa de la sesión en este momento, quite la rata el rotarod y grabar un estado latente de la caída de 120 s.
  5. Repetir la prueba dos veces más para un total de tres ensayos. Para minimizar el efecto de la fatiga, espacio de los ensayos por lo menos 5 minutos aparte. Promedio de las puntuaciones de los tres ensayos. Una rata adulta intacta por lo general tiene una latencia promedio de caída de > 40 s.
  6. Volver a colocar la rata en la jaula y limpiar el rotarod y alrededores con etanol al 70%.

9. Cuantificación de la expresión de GFP en el cerebelo

  1. anestesiar las ratas y perfusión con tampón fosfato salino (PBS) y luego con paraformaldehído al 4%. Diseccionar el cerebro y la médula espinal y remojando la noche anterior los tejidos en el fijador y luego moverlos a una solución de sacarosa al 30%. Después de equilibrar, cortar secciones coronales de 50 μm en un micrótomo de deslizamiento con congelación etapa 4 , 5 , 6.
  2. Elegir las secciones 3-6 del cerebelo que se espacian uniformemente en los vermis, el lóbulo central del cerebelo. Etiqueta fluorescente GFP para maximizar la señal. Utilizar el anticuerpo primario para GFP en 1: 500 y utilizar el Alexa 488 anticuerpo secundario conjugado a la dilución de 1:300 4 , 5 , 6.
    Nota: Véase referencia 4 , 5 , 6 para más detalles sobre el muestreo, seccionamiento y procedimientos de tinción.
  3. Microfotografía cada sección en la región definida de interés con una lente de baja magnificación usando un microscopio. Uso un objetivo X 2.5 (N.A. 0.12) y filtro Coloque 10, 450-490/515-565 excitación/emisión). Mantener la configuración de la cámara (tiempo de exposición, por ejemplo, 2 s) el mismo a través de las muestras a analizar. Guarde como un. Archivo TIF.
  4. Abrir la microfotografía en el programa de imagen Scion ampliamente disponible, se abrirán dos ventanas. Cierre la ventana indicada como " Color indexado ".
  5. Elegir " opciones de ", entonces " densidad de SliceŔ una gama de tonos se indicará en rojo en la ventana de tabla de búsqueda (LUT). En la ventana, usa los cursores para llenar en la GFP etiquetado específico sólo y cuando el fondo no específico comienza a ser recogido en la imagen.
    Nota: Esto resaltará la zona fluorescente en la microfotografía a cuantificarse. La configuración debe optimizarse para capturar específicamente todas las células visiblemente fluorescentes. Con la práctica, este método puede destacar precisamente la fluorescencia específica.
  6. Antes de medir área fluorescente, primero asegurar que las mediciones efectuadas en las unidades correctas (píxeles). Para ello, haga clic en " Análisis ", luego " Set ScaleŔ la cuarta línea debe decir " unidades ". En la lista desplegable, seleccione píxeles para medir en píxeles y luego haga clic en " OK ". Cambiar las opciones de análisis para " incluyen Interior agujeros " para asegurar la inclusión de todo el cuerpo de la célula en el análisis.
    7. Haga clic en
  7. para medir la zona fluorescente, " analizar " y haga clic en " medida ". Para ver este valor, haga clic en " analizar " haga clic en " Mostrar ResultsŔ aparecerá una ventana de resultados. La medida del área fluorescente será bajo el título con la etiqueta " área ".
  8. Para asegurar la estandarización en las medidas, no cambie los valores de resaltado en la ventana LUT.
  9. Una vez que todas las mediciones se han registrado, un promedio de los valores para cada animal (de 3 a 6 secciones por animal). Utilizar una prueba estadística adecuada para comparar las áreas transduced entre los grupos. 6

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Resultados

TDP-43 deficiencias motoras inducidas deben presentarse dentro de 2 a 6 semanas dependiendo de la dosis de la AAV TDP-43 usado (figura 1). Inyecciones de vena de cola dará como resultado parcial o sin impedimentos; el AAV debe alcanzar el torrente sanguíneo para producir el efecto. Una inyección exitosa de AAV GFP resultará en la expresión de GFP en el cerebro y la médula espinal de una manera dependiente de dosis de vector. Cuando se utiliza el promotor reco...

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Discusión

Una variedad de rutas de entrega han sido probados para vectores AAV: intraparenquimal, intra-cerebroventricular, intra-tecal, intravenosa, intranasal, intramuscular, etcetera. Cada ruta puede tener ventajas como inconvenientes. Administración de cola vena de AAV a ratas adultas es un método confiable para lograr la constante de transducción del CNS. El método de inyección periférica evita la introducción de una cánula de inyección en los tejidos de la CNS y por lo tanto es mínimamente invasivo. La expresión eficiente de...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Asociación de ALS, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx y una donación benéfica para la investigación de ALS de Thomas Lawson, para lo cual estamos agradecidos. Agradecemos a Elysse huerta y Donna Burney para asesoría y capacitación. JAS fue apoyado por la Fundación mintió e institutos nacionales de salud otorgar GM103418.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BásculaPelouzeSP5
Nalgene cubo ThermoScientific120140004000 mL
Tubo de microcentrífugaUSA Scientific1615-5500
Solución de Ringer LactatoBaxter Healthcare0338-0114-04
Mini vórticeCentrífuga de128101
Eppendorf22624415
Película de laboratorioBemisPM996
Jeringa de 1 mLBD 309626Viene con una aguja de 25 g adjunta.
Reemplace con aguja de 27-30 g para inyección
Aguja de 30 gBD305106
IsofluranoPiramal Healthcare66794-013-25Isoflurano USP 250 mL
Mascarilla de anestesiaKopf Instruments906
GasaHenry Schein100-25242" x 2" (5cm x 5cm)
Puntas de pipetaUSA Scientific1111-0816
MicropipetaGilson4642080
Gas vaporizador de anestesiaSurgiVet4214322Classic T3
Eliminador de anestesia a gasSurgiVet32373B10Enviro-PURE
Almohadilla térmicaSears17280
Almohadilla de bancoVWR56617-006
RotarodPanlab/Harvard Apparatus76-07724 ratas/ 4 ratones
70% EtanolDecon Laboratories, Inc.2401140 prueba
70% IsopropanolVWR89108-160
Scion ImagenScion Corporation
GFP Tag Anticuerpo policlonalInvitrogenA11122Anticuerpo primario - dilución 1:500
AlexaFluor 488InvitrogenA11070Anticuerpo secundario - dilución 1:300
Microscopio Axioskop 40Zeiss
Fisher Scientific

Referencias

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).

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