Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Resumen

Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

Resumen

Vectores de virus adeno-asociado (AAV) son un reactivo dominante en las neurociencias agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) optogenetics, cre-lox targeting, etcetera. El objetivo de este manuscrito es ayudar al investigador tratar de transferencia de genes de la expansiva del sistema nervioso central (SNC) en la rata mediante inyección en la vena cola de AAV. Expresión de gran escala es relevante para las condiciones con patología extensa, y un modelo de rata es significativo debido a su mayor tamaño y las semejanzas fisiológicas a los seres humanos en comparación con ratones. En esta aplicación de ejemplo, una transducción neuronal de gran escala se utiliza para imitar una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la médula espinal entera, esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La transducción eficiente de CNS de gran escala también puede utilizarse para proporcionar factores de proteína terapéutica en estudios pre-clínicos. Después de un intervalo de expresión después de la inyección de varias semanas, se evaluaron los efectos de la transducción. Para una proteína fluorescente verde (GFP) control de vectores, la cantidad de GFP en el cerebelo calcula rápidamente y confiablemente por un programa básico de la proyección de imagen. Para fenotipos de enfermedad motor que son inducidos por la ALS respuesta transactive proteína DNA-proteína de 43 kDa (TDP-43), los déficits son anotados por rotarod y el reflejo del escape. Más allá de modelos de enfermedad y la terapia génica, existen diversas aplicaciones potenciales para el gene de gran escala dirigidas a descrito aquí. El uso expandido de este método ayudará a acelerar la prueba de las neurociencias y la Neurogenética de hipótesis.

Introducción

Vectores de virus recombinante adeno-asociado (AAV) son herramientas imprescindibles para la investigación del CNS porque son tan eficaces transducción in vivo de neuronas. Los vectores AAV son muy versátiles para estudiar diferentes transgenes e isoformas de la proteína, diferentes tejidos, diferentes especie y diferentes vías de administración. Por ejemplo, AAV puede ser administrado a ratones por un periférico, relativamente no-invasivo, inyección intravenosa para transducir las neuronas en el SNC como primero descrito en Foust et al. y Duque et al. (véase papel de JOVE por Gombash et al. (2014)). ^{1 ,}

Protocolo

todos los procedimientos siguieron las pautas apropiadas de NIH. Todos los procedimientos siguieron protocolos animales que fueron aprobados por el cuidado Animal y uso en LSU Health Sciences Center en Shreveport. Para este procedimiento se utilizaron ratas hembras Sprague-Dawley a las 6 semanas de edad.

1. determinar los dosis/volúmenes de vector necesitada

1. pesan las ratas al ser inyectado y determinar la cantidad de vector viral necesaria para cada animal basadas en el título (concentración) de la preparación del vector. Usan dosis de vectores que han tenido éxito para la expresión eficiente de la rata del CNS previamente (ver....

Resultados

TDP-43 deficiencias motoras inducidas deben presentarse dentro de 2 a 6 semanas dependiendo de la dosis de la AAV TDP-43 usado (figura 1). Inyecciones de vena de cola dará como resultado parcial o sin impedimentos; el AAV debe alcanzar el torrente sanguíneo para producir el efecto. Una inyección exitosa de AAV GFP resultará en la expresión de GFP en el cerebro y la médula espinal de una manera dependiente de dosis de vector. Cuando se utiliza el promotor reco.......

Discusión

Una variedad de rutas de entrega han sido probados para vectores AAV: intraparenquimal, intra-cerebroventricular, intra-tecal, intravenosa, intranasal, intramuscular, etcetera. Cada ruta puede tener ventajas como inconvenientes. Administración de cola vena de AAV a ratas adultas es un método confiable para lograr la constante de transducción del CNS. El método de inyección periférica evita la introducción de una cánula de inyección en los tejidos de la CNS y por lo tanto es mínimamente invasivo. La expresión eficiente de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Báscula	Pelouze	SP5
Nalgene cubo Thermo	Scientific	12014000	4000 mL
Tubo de microcentrífuga	USA Scientific	1615-5500
Solución de Ringer Lactato	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vórtice	Centrífuga de	128101
	Eppendorf	22624415
Película de laboratorio	Bemis	PM996
Jeringa de 1 mL	BD 309626		Viene con una aguja de 25 g adjunta. Reemplace con aguja de 27-30 g para inyección
Aguja de 30 g	BD	305106
Isoflurano	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurano USP 250 mL
Mascarilla de anestesia	Kopf Instruments	906
Gasa	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Puntas de pipeta	USA Scientific	1111-0816
Micropipeta	Gilson	4642080
Gas vaporizador de anestesia	SurgiVet	4214322	Classic T3
Eliminador de anestesia a gas	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Almohadilla térmica	Sears	17280
Almohadilla de banco	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 ratas/ 4 ratones
70% Etanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 prueba
70% Isopropanol	VWR	89108-160
Scion Imagen	Scion Corporation
GFP Tag Anticuerpo policlonal	Invitrogen	A11122	Anticuerpo primario - dilución 1:500
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Anticuerpo secundario - dilución 1:300
Microscopio Axioskop 40	Zeiss

Fisher Scientific