Planta defensinas juegan un papel importante en defensa de la planta contra patógenos. Para el uso efectivo de estos péptidos antifúngicos como antifúngicos, comprender sus modos de acción (MOA) es crítico. Aquí, se describe un método de proyección de imagen de células vivas para estudiar los aspectos críticos de MOA de estos péptidos.
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Artículo de método
Imágenes de células vivas de células fúngicas a investigar los modos de entrada y localización subcelular de defensinas de plantas antifúngicas
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Resumen
Resumen
Pequeños ricos en cisteína defensinas son uno de los mayores grupos de péptidos de defensa anfitrión presentes en todas las plantas. Muchos defensinas de plantas exhiben potentes en vitro la actividad antifúngica contra un amplio espectro de hongos patógenos y por lo tanto tienen el potencial para ser utilizados como agentes antifúngicos en cultivos transgénicos. Con el fin de aprovechar todo el potencial de defensinas de plantas para el control de enfermedades, es crucial dilucidar sus mecanismos de acción (MOA). Con el advenimiento de las técnicas de microscopía avanzada, proyección de imagen de células vivas se ha convertido en una poderosa herramienta para la comprensión de la dinámica de la MOA antihongos de defensinas de plantas. Aquí, se describe un método de imagen de microscopía confocal en células vivas usando dos planta fluorescente etiquetado defensinas (MtDef4 y MtDef5) en combinación con colorantes fluorescentes vitales. Esta técnica permite la visualización en tiempo real y análisis de los eventos dinámicos de la imputación de MtDef4 y MtDef5 en células fúngicas. Lo importante, esta prueba genera una riqueza de información, incluyendo la cinética de la internalización, modo de entrada y localización subcelular de estos péptidos. Junto con otras herramientas biológicas de la célula, estos métodos han proporcionado penetraciones importantes en la dinámica y complejidad de MOA de estos péptidos. Estas herramientas también pueden utilizarse para comparar el MOA de estos péptidos contra diversos hongos.
Introducción
Las plantas han desarrollado un sofisticado sistema inmune innato para la defensa contra patógeno microbiana planta1. Que expresan numerosos péptidos de defensa del anfitrión codificada por el gen con supuesta actividad antimicrobiana2. De hecho, muchos de estos péptidos muestran actividad antimicrobiana en vitro3. Defensinas constituyen uno de los mayores grupos de péptidos de defensa del huésped en el Reino de planta4. Estos péptidos ricos en cisteína, catiónicos presentan actividad inhibitoria del crecimiento potente contra hongos y oomicetos patógenos en la con....
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Protocolo
1. etiquetado de defensinas con fluoróforos
- Seleccione un fluoróforo que tiene mínimo efecto sobre las propiedades antimicrobianas, así como la captación y localización de Defensina dentro de la célula viva.
Nota: Seleccionar fluoróforo óptima depende de objetivos experimentales específicos. Deben considerarse las propiedades espectrales y químicas, fotoestabilidad, tamaño y carga del fluoróforo. - Etiqueta Defensina con el fluoróforo seleccionado utilizando un péptido apropiado etiquetado kit disponible de proveedores comerciales. Por otra parte, sintetizar químicamente defensinas fluoróforo. En este estudio, la etiqueta MtDef5 Defensina con Dy....
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Resultados
En vivo la proyección de imagen de la célula se llevó a cabo un seguimiento y comparar la internalización y localización subcelular de dos defensinas, MtDef4 y MtDef5, de Medicago truncatula; en células fúngicas. TMR-MtDef4 fue sintetizado químicamente mientras MtDef5 fue marcado con Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conidios se incubaron con cualquiera Defensina en combinación con el tinte selectiva de membrana FM4-64. La figura 1 muestra que el TMR-M.......
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Discusión
En este estudio, una metodología de proyección de imagen células vivas confiable con el uso de fluorescencia etiquetada antifúngico defensinas fue descrita para el estudio de la cinética de la internalización de estos péptidos en células fúngicas y para determinar sus objetivos subcelulares. Este método es una poderosa herramienta para visualizar la dinámica de la interacción entre las células fúngicas y defensinas, temporal y espacial.
Varios métodos se han utilizado para el estudio de la int.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Dr. R. Howard Berg, Director de la instalación de microscopía integrado en el centro Donald Danforth planta ciencia, para su orientación y ayuda con microscopía confocal. Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Kit de etiquetado de anticuerpos | Thermo Scientific | 84530 | |
| Tapete de platos de micropocillos con fondo de vidrio | TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Tela Mira | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X Microscopio confocal | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | para el análisis de imágenes | |
| Imaris software | Bitplane | para el análisis de imágenes |
Referencias
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der ....
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Reimpresiones y permisos
