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Artículo de método

Imágenes de células vivas de células fúngicas a investigar los modos de entrada y localización subcelular de defensinas de plantas antifúngicas

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DOI:

10.3791/55995

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24 de diciembre de 2017

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1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

Planta defensinas juegan un papel importante en defensa de la planta contra patógenos. Para el uso efectivo de estos péptidos antifúngicos como antifúngicos, comprender sus modos de acción (MOA) es crítico. Aquí, se describe un método de proyección de imagen de células vivas para estudiar los aspectos críticos de MOA de estos péptidos.

Resumen

Pequeños ricos en cisteína defensinas son uno de los mayores grupos de péptidos de defensa anfitrión presentes en todas las plantas. Muchos defensinas de plantas exhiben potentes en vitro la actividad antifúngica contra un amplio espectro de hongos patógenos y por lo tanto tienen el potencial para ser utilizados como agentes antifúngicos en cultivos transgénicos. Con el fin de aprovechar todo el potencial de defensinas de plantas para el control de enfermedades, es crucial dilucidar sus mecanismos de acción (MOA). Con el advenimiento de las técnicas de microscopía avanzada, proyección de imagen de células vivas se ha convertido en una poderosa herramienta para la comprensión de la dinámica de la MOA antihongos de defensinas de plantas. Aquí, se describe un método de imagen de microscopía confocal en células vivas usando dos planta fluorescente etiquetado defensinas (MtDef4 y MtDef5) en combinación con colorantes fluorescentes vitales. Esta técnica permite la visualización en tiempo real y análisis de los eventos dinámicos de la imputación de MtDef4 y MtDef5 en células fúngicas. Lo importante, esta prueba genera una riqueza de información, incluyendo la cinética de la internalización, modo de entrada y localización subcelular de estos péptidos. Junto con otras herramientas biológicas de la célula, estos métodos han proporcionado penetraciones importantes en la dinámica y complejidad de MOA de estos péptidos. Estas herramientas también pueden utilizarse para comparar el MOA de estos péptidos contra diversos hongos.

Introducción

Las plantas han desarrollado un sofisticado sistema inmune innato para la defensa contra patógeno microbiana planta1. Que expresan numerosos péptidos de defensa del anfitrión codificada por el gen con supuesta actividad antimicrobiana2. De hecho, muchos de estos péptidos muestran actividad antimicrobiana en vitro3. Defensinas constituyen uno de los mayores grupos de péptidos de defensa del huésped en el Reino de planta4. Estos péptidos ricos en cisteína, catiónicos presentan actividad inhibitoria del crecimiento potente contra hongos y oomicetos patógenos en la concentraciones micromolar y representan una de las primeras líneas de defensa contra estos agentes patógenos5,6. Debido a su potente actividad antifúngica, defensinas pueden explotarse en aplicaciones agribiotechnological para generar cultivos resistentes a la enfermedad. Sobre-expresión constitutiva de varios defensinas de plantas se ha demostrado para mejorar la resistencia a enfermedades en las pruebas de invernadero y campo de cultivos transgénicos6. Es importante desentrañar los mecanismos de acción (MOA) de estos péptidos antifúngicos para aprovechar plenamente su potencial como herramientas eficaces para la protección de cultivos. Sin embargo, el MOA de estas defensinas de plantas es poco conocido. La evidencia actual sugiere que exhiben diferentes MOA5,6,7,8. Algunas defensinas actúan extracelularmente sobre hongos objetivo específico plasma pared celular membrana residente esfingolípidos, alteran la integridad de la membrana y activan vías de toxicidad celular9,10,11. Recientemente, sin embargo, defensinas antihongos que translocan en células fúngicas han sido descubiertos12,13,14. Algunas de estas defensinas se unen a fosfolípidos bioactivos reside en la membrana, forman complejos oligoméricos y permeabilizar las membranas de plasma15,16,17. Así, se han aclarado algunos aspectos de la MOA de defensinas de plantas. Sin embargo, el MOA de defensinas de plantas probablemente implica una compleja serie de eventos que aún no han sido identificados e integrado en un modelo integral. En particular, queda un gran vacío en nuestro conocimiento de las dianas celulares de estos péptidos.

Con los avances recientes en tecnologías de la microscopia y el desarrollo de nuevas sondas fluorescentes, técnicas de imagen de células vivas ahora utilizan con frecuencia para estudiar el MOA de péptidos antimicrobianos (AMPs). Estas técnicas complementan ampliamente utilizados métodos como la inmunolocalización, microscopia electrónica, microscopía de fuerza atómica o de tomografía de rayos x18, que se emplean sobre todo para analizar los efectos de los péptidos antifúngicos en la morfología y crecimiento de las células fúngicas incluyendo el estudio de la integridad de la pared celular, alteraciones en los patrones de crecimiento/ramificación de celdas, así como la permeabilización de la membrana plasmática y matando. Sin embargo, estos estudios se han limitado a las células en un cierto momento la proyección de imagen después del tratamiento con los péptidos en lugar de realizar la proyección de imagen en las células del mismo para monitorear sus cambios dinámicos en respuesta al desafío de Defensina Time-lapse. En los últimos años, uso de fluorescencia etiquetadas péptidos junto con células vivas usando microscopia confocal de imágenes ha permitido una visualización en tiempo real de la dinámica de las interacciones de la AMP – microbio. Ambos naturalmente purificaron y síntesis química de péptidos antifúngicos pueden etiquetados con etiquetas fluorescentes (p. ej., DyLight, rodamina, BODIPY o Alexa Fluor basado en colorantes) y observado directamente durante su interacción con las células de Time-lapse imágenes de células vivas. El uso de estos etiquetados péptidos ha aumentado significativamente nuestra comprensión de los diferentes aspectos de su MOA incluyendo el modo de entrada, localización subcelular, tráfico intracelular y sitios de acción antifúngica dentro de las células vivas de hongos 18.

Recientemente, varios estudios han demostrado que varios péptidos antifúngicos incluyendo planta defensinas se internalizan por vivir células fúngicas12,14,19,20. El MDA de estas defensinas probablemente implica interacción con objetivos intracelulares. Recientemente hemos reportado la acción antifúngica de una planta de Defensina MtDef4 en dos hongos ascomiceto Neurospora crassa y Fusarium graminearum. MtDef4 se demostró que utilizar diferentes vías para la entrada de la célula fúngica y localización subcelular en estos hongos14. Este estudio utilizada químicamente sintetizado tetrametil rodamina (TAMRA)-con la etiqueta MtDef4 en combinación con colorantes fluorescentes vitales (el tinte selectiva de la membrana, FM4-64; colorante florescente de membrana, SYTOX Green y el tinte de reportero de muerte celular, yoduro de propidio) y inhibidores metabólicos. Estos análisis demostraron la cinética de la internalización de la MtDef4, sus mecanismos de transporte intracelular y sus objetivos subcelulares14.

Aquí, se presenta un protocolo para obtener imágenes de células vivas usando microscopia confocal. El protocolo utiliza fluorescencia etiquetadas péptidos en combinación con colorantes vitales fluorescentes para estudiar interacciones Defensina-hongos de la planta, en particular, las vías de desplazamiento y los blancos intracelulares de defensinas en células fúngicas.

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Protocolo

1. etiquetado de defensinas con fluoróforos

  1. Seleccione un fluoróforo que tiene mínimo efecto sobre las propiedades antimicrobianas, así como la captación y localización de Defensina dentro de la célula viva.
    Nota: Seleccionar fluoróforo óptima depende de objetivos experimentales específicos. Deben considerarse las propiedades espectrales y químicas, fotoestabilidad, tamaño y carga del fluoróforo.
  2. Etiqueta Defensina con el fluoróforo seleccionado utilizando un péptido apropiado etiquetado kit disponible de proveedores comerciales. Por otra parte, sintetizar químicamente defensinas fluoróforo. En este estudio, la etiqueta MtDef5 Defensina con DyLight550 utilizando un etiquetado comercial kit según protocolo y tetrametilo colorante textil de fabricante (TAMRA)-etiqueta MtDef4 Defensina fue químicamente sintetizada comercialmente.
    Nota: Se recomienda utilizar químicamente sintetizado fluoróforo tagged péptidos (especialmente para péptidos cortos de 50 aminoácidos o menos) desde el fluoróforo puede conectarse el residuo de N o C terminal del péptido para asegurar el mínimo efecto en su actividad antimicrobiana. Síntesis de péptidos largos con más de tres enlaces de disulfuro es un reto. En este caso, es aconsejable que ese péptido ser marcado con un fluoróforo óptimo utilizando un péptido disponible comercialmente conveniente kit de etiquetado.
  3. Prueba en vitro la actividad antimicrobiana de la Defensina etiquetados y determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) contra los hongos para ser investigado.
    Nota: En este estudio, se determinó el micro DyLight550-MtDef5 y TMR-MtDef4 contra Neurospora crassa y Fusarium graminearum.

2. hongos cultivos y crecimiento medio

  1. Transferencia de conidios de un cultivo N. crassa inclinación tubo que contenga medio agar de Vogel21 e incubar a temperatura ambiente bajo la luz durante 5 días.
  2. La cultura F. graminearum PH-1 tensión en las placas que contengan completa medio (CM)22 a 28 º c durante 5 días. Para la producción de conidios, inocular 4 tapones (10 mm de diámetro) de la cultura 5 días de edad de F. graminearum PH-1 en 50 mL de medio de carboximetil celulosa (CMC) (celulosa carboximetil de 15 g, 1 g, extracto de levadura, 0.5 g de MgSO4.7 H2O, 1 g de NH 4 NO3y 1 g KH2PO4) y la cultura para el 4-7 días a 28 º c en un agitador rotatorio a 180 rpm.

3. preparación de la suspensión Conidial

  1. Suspensión de conidios de F. graminearum
    1. Mezclar el cultivo líquido de F. graminearum y conidios recogemos filtrando cultura fungicida de 1,5 mL a través de dos capas de material de filtración (como Miracloth) en un tubo de microcentrífuga de 2 mL. Centrifugue la suspensión conidial en 13.226 x velocidad g en una microcentrífuga durante 2 minutos.
    2. Deseche el sobrenadante y agregar 1 mL de agua estéril para lavar el pellet.
    3. Centrifugar la suspensión conidial en 13.226 x velocidad g en una microcentrífuga para 2 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de X SFM (medios fungicidas sintéticos) 223.
    4. Contar las conidias utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio de luz.
    5. Ajustar la suspensión conidial a 10 conidias/mL,5 con 2 X SFM.
  2. Suspensión conidial de N. crassa
    1. Transferir una cantidad pequeña de cultura creciente (5 días de edad) de N. crassa utilizando un asa de inoculación a un tubo de microcentrífuga que contiene 2 mL de medio líquido de Vogel.
    2. Mezclar la suspensión conidial y filtro a través del material de la filtración en un nuevo tubo de microcentrífuga.
    3. Centrifugar la suspensión conidial a velocidad máxima en una microcentrífuga para 2 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado conidial en 1 mL de medio líquido de Vogel.
    4. Contar las conidias utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio de luz.
    5. Ajustar la suspensión conidial a5 10 conidias/mL con medio líquido de Vogel.

4. muestra preparación y Microscopía Confocal

  1. Localización subcelular de MtDef4 Defensina en células fúngicas
    1. Pipetear 50 μl de cada suspensión conidial (105 conidios/mL) en el pocillo mm 10 platos de micropocillos de 35 mm cristal inferior. Para la observación de conidios, directamente proceder al siguiente paso, o para la preparación de germlings, pipetee 50 μl de N. crassa y F. graminearum conidios en los platos de cultivo de 35 mm y dejar germinar por 3-6 h a temperatura ambiente.
    2. Añadir 50 μl de Defensina fluorescencia marcada en el micrófono a cada plato de pocillo e incubar durante 2,5 horas. El MIC del fluoróforo defensinas usado aquí (paso 1.3) es el μm 3 de N. crassa y F. graminearum y el MIC de TMR-MtDef4 de N. crassa y F. graminearum era 1 μm y 12 μm, respectivamente.
    3. Añadir 2 μl de membrana selectiva tinte FM4-64 (concentración final: 5 μm) en la cultura plato e incubar por 30 min y montar inmediatamente en el microscopio confocal para la proyección de imagen.
    4. Seleccione el láser de luz blanca (WLL). Utilizar el dos láser fuentes 488 nm y 550 nm para excitar el tinte MtDef4 de TMR y FM4-64, respectivamente. Detectar la fluorescencia de TMR-MtDef4 580-700 nm y detectar tinte FM4-64 a 690-800 nm.
      Nota: Ejecutar la microscopia confocal en el cuarto oscuro.
  2. La proyección de imagen de lapso tiempo de interiorización de Defensina MtDef5
    1. Pipetear 50 μl de la suspensión conidial de N. crassa y F. graminearum (105 conidios/mL) en 10 mm pocillos platos de micropocillos de 35 mm cristal inferior. Pocillo de 10 m m es sin recubrimiento y tiene un vidrio de cobertura no. 1.5 en la parte inferior. Para la observación de conidios, proceder directamente al paso siguiente. Para la observación de germlings, incubar conidios por 3-6 h a temperatura ambiente antes de proceder a la microscopía.
    2. Encienda WLL. Seleccione la línea láser a 550 nm para excitar el fluoróforo defensinas usado aquí (paso 1.3) y FM4-64 con 1.00% de intensidad y activar los detectores correspondientes. El fluoróforo defensinas usado aquí (paso 1.3) fue detectado en 560-600 nm y FM4-64dye fue detectada en el 690-800 nm.
      Nota: Utilizar láser de baja intensidad para celular directo imágenes como intensidad de láser de alta puede dañar las células vivas de hongos.
    3. Montar el plato de pocillo en el microscopio. Encontrar las células usando objetivos de x 10 al principio, luego cambiar a x 100 / 1.44 objetivo de petróleo para un aumento mayor.
      Nota: Ajuste el modo de barrido xyzt (combinación de modos Time-lapse y Z-stack), posición de Z, Zoom, frecuencia de captura de la imagen, etcetera.
antes de proceder al siguiente paso.
  • Añadir 50 μl del fluoróforo defensinas usado aquí (paso 1.3) de la MIC de 3 μm y 2 μl de colorante membrana selectiva FM4-64 (concentración final 5 μm) a cada pocillo un plato y empezar a proyección de imagen de Time-lapse. Colocar pequeños trozos de papel de filtro mojado en los pocillos platos para evitar la evaporación. La frecuencia de captura de la imagen era 3 min 30 s y el período total fue 2 h 30min.
    Nota: Agregar Defensina y fluoróforo después plato de pocillo de montaje en el microscopio puede desenfoque de la región de interés. Por lo tanto, después de agregar la Defensina y fluoróforo al micropocillo, región de interés necesita ser reorientado que puede causar un retraso en la adquisición de la imagen.
  • Usar un microscopio confocal para proyección de imagen confocal todo y llevar a cabo la microscopia a temperatura ambiente en un cuarto oscuro.

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    Resultados

    En vivo la proyección de imagen de la célula se llevó a cabo un seguimiento y comparar la internalización y localización subcelular de dos defensinas, MtDef4 y MtDef5, de Medicago truncatula; en células fúngicas. TMR-MtDef4 fue sintetizado químicamente mientras MtDef5 fue marcado con Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conidios se incubaron con cualquiera Defensina en combinación con el tinte selectiva de membrana FM4-64. La figura 1 muestra que el TMR-M...

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    Discusión

    En este estudio, una metodología de proyección de imagen células vivas confiable con el uso de fluorescencia etiquetada antifúngico defensinas fue descrita para el estudio de la cinética de la internalización de estos péptidos en células fúngicas y para determinar sus objetivos subcelulares. Este método es una poderosa herramienta para visualizar la dinámica de la interacción entre las células fúngicas y defensinas, temporal y espacial.

    Varios métodos se han utilizado para el estudio de la int...

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    Divulgaciones

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Agradecimientos

    Agradecemos a Dr. R. Howard Berg, Director de la instalación de microscopía integrado en el centro Donald Danforth planta ciencia, para su orientación y ayuda con microscopía confocal. Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

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    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    FM4-64 DyeLife TechnologiesT13320
    DyLight 550 Kit de etiquetado de anticuerposThermo Scientific84530
    Tapete de platos de micropocillos con fondo de vidrioTeKP35G-1.5-10-C
    Tela MiraEMD Millipore Corp475855-1R
    SP8-X Microscopio confocalLeica
    ImageJ softwareFiJipara el análisis de imágenes
    Imaris softwareBitplanepara el análisis de imágenes

    Referencias

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