Cuantificación de células procedentes de donantes es necesaria para supervisar el engraftment después del trasplante de células madre en pacientes con hemoglobinopatías. Una combinación de la clasificación de celda basados en citometría de flujo, análisis de formación de Colonia y posterior análisis de corto tándem repeticiones pueden utilizarse para evaluar la proliferación y diferenciación de progenitores en el compartimiento eritroide.
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Artículo de método
Detección de células progenitoras eritroides de donantes Residual después del trasplante de células madre hematopoyéticas para los pacientes con hemoglobinopatías
En este artículo
Resumen
Resumen
La presencia de quimerismo incompleto se observa en una gran proporción de pacientes después de trasplante de médula ósea para la talasemia mayor o enfermedad de células falciformes. Esta observación tiene enormes consecuencias, como estrategias de inmunomodulación terapéutica posterior pueden mejorar el resultado clínico. Convencionalmente, análisis reacción-basado cadena de la polimerasa de repeticiones en tándem cortas se utiliza para identificar el quimerismo en las células sanguíneas derivadas de donantes. Sin embargo, este método está restringido a las células nucleadas y no puede distinguir entre linajes unicelular disociados. Aplicamos el análisis de repeticiones en tándem cortas de células progenitoras hematopoyéticas ordenados por citometría de flujo y esto comparado con el análisis de repeticiones en tándem cortas de ráfaga-formación seleccionada - colonias eritroides, ambos recogidos del hueso médula ósea. Con este método que son capaces de demostrar los diferentes proliferación y diferenciación de células del donante en el compartimiento eritroide. Esta técnica es elegible para completar el seguimiento actual de quimerismo en el trasplante de células madre que se ajuste y por lo tanto puede ser aplicados estudios clínicos en el futuro, la célula de vástago investigación y diseño de ensayos de terapia genética.
Introducción
Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) es el enfoque curativo sólo está disponible para una variedad de trastornos genéticos innatos del sistema hematopoyético, lograr tasas de supervivencia libre de enfermedad de más del 90% de lo contrario altamente comprometida y vida útil limitada de pacientes1. La eficacia de esta importante herramienta terapéutica ha sido optimizada por limitar la toxicidad de pre- y post-trasplante regímenes2, pero también por las intervenciones encaminadas a mantener la función estable del injerto, que se cuantifica por la vigilancia estrecha de células procedentes de donant....
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Protocolo
1. aislamiento de células hematopoyéticas de la médula ósea por clasificación de células activado por fluorescencia multiparámetro
- muestra tinción
- antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados:
- medios de gradiente para la preparación de mononucleares células tubos (GM), cónico 50 mL
- tubos de flujo de 12 x 75 mm para la tinción de las células
- tampón de tinción: tampón de fosfato salino (PBS) + 3% de suero de ternero fetal (FCS)
- pipetas < / l i >
- FC bloque y tinción de anticuerpos (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Con esta combinación de fl....
- antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados:
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Resultados
Separación de progenitores lymphohematopoietic por clasificación de celular FACS
Aquí demostramos resultados de clasificación de las poblaciones celulares necesarios para posteriores análisis de STR. Células de médula ósea fueron manchadas con V450 conjugado anti-CD45 FITC conjugado anti-CD36 y conjugado con APC anti-CD34. La población de interés es de las megacariocitos progenitores (MEP), nucleadas las células.......
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Discusión
El objetivo del actual estudio es proporcionar al público una combinación de dos enfoques para el análisis de quimerismo donante/receptor en progenitores eritroides después de HSCT en pacientes trataron por Hemoglobinopatías: 1.) clasificación celular activado por fluorescencia de células progenitoras hematopoyéticas en muestras de médula ósea seguidas de análisis de repeticiones en tándem cortas y 2.) Unidad Formadora de colonias de crecimiento de las células de la médula ósea, clasificación de las colonias en varios ti.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Kinderkrebshilfe arco iris Südtirol.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Eliminar RBC |
| Tubos cónicos de 50 mL | Falcon | 14-432-22 | Preparación de la muestra |
| 12 tubos de flujo de 75 mm | Falcon | 352002 | Clasificación FACS |
| Salina tamponada con fosfato | Gibco | 10010023 | PBS |
| Suero fetal para terneros | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (inactivado por calor) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Azul de tripano | Gibco | 15250061 | |
| Hemocitómetro | Invitrogen Inc. | C10227 | Conteo automático |
| de células Hank' s Solución salina equilibrada | Gibco | 14025092 | Tampón de suspensión en el análisis FACS |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Componente del tampón de suspensión |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Bloque FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Clasificador |
| Recombinante eritropoyetina humana | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove' s Dulbecco modificado' s | Medio Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Componente del medio de cultivo Perlas |
| magnéticas CD34+ | Milteny Biotech | 130-046-702 | Purificación de CD34 |
| + G-CSF humano G-CSF Gibco | PHC2031 | Ensayo de UFC | |
| recombinante SCF humano | Gibco | CTP2113 | CFU-Ensayo |
| GM-CSF humano | Gibco | PHC2015 | CFU-Ensayo |
| Recombinante humano IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinante humano IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medio | Tecnologías de células madre | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Kit de extracción de sangre | Qiagen | 51306 | Aislamiento de ADN |
| Nanodrop ND-1000 fotómetro de espectros | Thermo Scientific | ND 1000 | Cuantificación |
| ADN Libre de ADNasa H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | Preparación de ADN |
| AmplTaq Gold ADN polimerasa | Biociencia aplicada | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradiente Eppendorf | 6321000019 | PCR | |
| Hi-Di Formamid | Biociencia Aplicada | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Tamaño Estándar | Biociencia Aplicada | 4310361 | PCR |
| 3130 Analizador Genético Biociencia | Aplicada | 313001R | PCR |
Referencias
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J.
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Clasificaci n celular por citometr a de flujoan lisis de repeticiones cortas en t ndemc lulas mononucleares de m dula seaensayo de unidades formadoras de coloniasselecci n de c lulas CD36 CD45extracci n de ADN y an lisis de PCRt cnica de seguimiento del quimerismoinjerto de pacientes con hemoglobinopat as
