ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Zhicheng Zhang; Kurt Boonen; Meixia Li; Koen Geuten

doi:10.3791/56011

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Artículo de método

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

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DOI:

10.3791/56011

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28 de julio de 2017

Zhicheng Zhang¹ , Kurt Boonen¹ , Meixia Li¹ , Koen Geuten¹

¹Department of Biology, KU Leuven

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

Resumen

Las proteínas de unión a ARN (RBPs) determinan el destino de los ARNs. Participan en todas las vías de la biogénesis del ARN y contribuyen especialmente a la regulación génica post-transcripcional (PTGR) de los ARN mensajeros (mRNAs). En los últimos años, se han aislado con éxito varios proteomas unidos a ARNm a partir de líneas de células de levaduras y mamíferos mediante el uso de un nuevo método denominado "captura de interactomas de mRNA", que permite la identificación de proteínas mRNA-binding (mRBPs) Directamente desde un entorno fisiológico. El método se compone de reticulación, pull-down y purificación de complejos de ribonucleoproteína mensajera (mRNPs) por bolas de oligo (dT) in vivo , y la posterior identificación de las proteínas reticuladas por espectrometría de masas (MS). Recientemente, aplicando el mismo método, se han reportado simultáneamente varios proteomas vegetales unidos a ARNm de diferentes fuentes de tejido de Arabidopsis : plántulas etioladas, tejido foliar,Protoplastos de mesófilo de hojas y células de raíces cultivadas. Aquí, presentamos el optimizado mRNA interactome método de captura de Arabidopsis thaliana hoja mesofilo protoplastos, un tipo de célula que sirve como una herramienta versátil para los experimentos que incluyen diversos ensayos celulares. Las condiciones para un rendimiento óptimo de la proteína incluyen la cantidad de tejido de partida y la duración de la irradiación UV. En el proteoma unido a ARNm obtenido a partir de un experimento de escala media (10 ^ { ^7} células), se encontró que las RBP que tenían capacidad de unión a ARN estaban sobre-representadas y se identificaron muchas RBP nuevas. El experimento se puede ampliar (10 ⁹ células), y el método optimizado se puede aplicar a otros tipos de células vegetales y especies para aislar, catalogar y comparar los proteomas unidos a mRNA en las plantas.

Introducción

Los eucariotas utilizan múltiples vías reguladoras de la biogénesis del ARN para mantener los procesos biológicos celulares. Entre los tipos conocidos de ARN, el ARNm es muy diverso y lleva la capacidad de codificación de las proteínas y sus isoformas ^1. La ruta PTGR dirige los destinos de los pre-mRNAs ² ^, ³ . RBPs de diferentes familias de genes controlan la regulación de ARN, y en PTGR, mRBPs específicos guían mRNAs a través de interacciones físicas directas, formando mRNPs funcional. Por lo tanto, la identificación y caracterización de mRBPs y sus mRNPs es fundamental para entender....