Hemos descrito un protocolo para la realización de hepatectomía parcial (PHx) y trasplante de la célula vía bazo en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratones. En este protocolo, se realiza una incisión para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, seguido por otra incisión para el intrasplenic trasplante de células.
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Artículo de método
Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID
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Resumen
Resumen
Hepatectomía parcial es un método versátil y reproducible para el estudio de la regeneración hepática y el efecto de la terapéutica celular basado en diversas condiciones patológicas. Hepatectomía parcial también facilita el engraftment aumento y proliferación de las células trasplantadas por neovascularización aceleración y migración de células hacia el hígado. Aquí, describimos un protocolo simple para realizar 30% hepatectomía y trasplante de células en el bazo de un no obeso diabético grave había combinado NOD inmunodeficiente. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratón.
En este procedimiento, se realizan dos pequeñas incisiones. La primera incisión es para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, y otra pequeña incisión para exponer el bazo para el intrasplenic trasplante de células. Este procedimiento no requiere ninguna habilidad quirúrgica especializada y puede realizarse en 5-7 minutos con menos estrés y dolor, una recuperación más rápida y mejor supervivencia. Hemos demostrado el trasplante de hepatocitos aislados de una proteína fluorescente verde (GFP) expresando su ratón (transgénicos C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), así como los hepatocitos como células de origen humano (NeoHep) en hepatectomized parcialmente NOD. Ratones de SCID.
Introducción
Actualmente, trasplante de hepatocitos es propuesto como una alternativa al trasplante de órgano entero para tratar a los pacientes tener severos trastornos hepáticos. Se cree que puede superar a los pacientes de trasplante de órgano entero1. Además de los hepatocitos alogénicos2, hepatocitos xenogénica3 y hepatocitos derivados de las células4 también están siendo investigados en modelos animales. En este contexto, el engraftment y autoguiado hacia el blanco potencial de las células trasplantadas en el receptor es un criterio importante para la terapia celular basada en la ....
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Protocolo
En este protocolo los procedimientos han sido aprobados por el Comité institucional de ética Animal del Instituto Nacional de Inmunología, en Nueva Delhi. El número de serie de referencia de la aprobación es AICE #319/13.
Nota: Hay excelentes recursos en procedimientos de cirugía general20 y protocolos específicos para roedores cirugía21. Para aquellos haciendo cirugía animal por primera vez, se recomienda ampliamente practicar procedimientos quirúrgicos en maniquíes antes de operar a los animales.
1. preparación
- Antes del experimento, se mantenga....
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Resultados
Proliferación de hepatocitos después de hepatectomy parcial 30%: La proliferación de hepatocitos en el resto de hígado después de hepatectomy 30% fue examinada por inmunohistoquímica (IHC) para un marcador de proliferación celular, Ki-67. Un día post hepatectomía, los ratones fueron sacrificados, los lóbulos de hígado restantes fueron suprimidos y se obtuvieron secciones de la parafina. Las secciones fueron teñidas con anticuerpos Ki-67, seguido por etiquetado con rábano peroxidasa (HRP) conjugado de ant.......
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Discusión
Hepatectomía parcial es una técnica establecida para investigar la regeneración hepática y hepatectomía excesiva se divulga para imitar el modelo de AHF. Entre los modelos animales de AHF, roedores, especialmente ratones, son el modelo más investigado. Para obtener un modelo de daño hepático en ratones, hasta una hepatectomía del 70% se ha divulgado con una buena supervivencia tasa25,26. Sin embargo en nude y otro ratón inmunodeficiente, una hepatectomía del 70% .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la concesión de la base recibida del Departamento de biotecnología, gobierno de la India en el Instituto Nacional de Inmunología, en Nueva Delhi. Dirección actual del Dr. Bhattacharjee es la división de Gastroenterología, Hepatología y nutrición, Hospital Los Ángeles de los niños.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de anestesia gaseosa | Ugo Basile; Italia | 211000 | |
| Báscula | Goldtech ; Gabinete | adquisiciones locales | |
| (Clase I) | Kartos international; Recortadora | de adquisición local | |
| Panasonic; Japón | ER-GY10 | ||
| Tijera de operación recta con cuchillas afiladas / afiladas | Major Surgicals; Pinzas | de adquisición local | |
| con dentados quirúrgicos | mayores; Adquisición | local de | |
| Micro portaagujas recto y curvo | Merciano ; Inglaterra | BS-13-8 | |
| Jeringa de insulina de 1 ml con 30G *5/16 agujas | Furgoneta Dispo; Jeringa India | ||
| de 1 ml con 26 G * 1/2 aguja | BD ; EE. UU. | REF 303060 | |
| Hilos de nylon | poderoso; India | (1-0) Adquisiciones locales | |
| MERSUTURAS 4-0 Sutura quirúrgica esterilizada con aguja | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 sutura quirúrgica absorbible | Suturas India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sutura quirúrgica con aguja esterilizada Catgut Brotes de algodón crómico |
| hisopos puros Pvt Ltd ; Cinta | de adquisición local | ||
| 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Cinta quirúrgica | |
| Microtomo | Histo-Line Laboratories, Italia | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; | ||
| Carl Zeiss; Alemania | LSM 510 META | ||
| Microscopio de campo brillante | Olympus, Japón | LX51 | |
| Analizador automatizado | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Analizador bioquímico para pruebas funcionales hepáticas |
| Citómetro de flujo | BD ; EE. UU. | BD FACSverse | Evaluación de la presencia de células post trasplante |
| Veet crema depilatoria | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; Isoflurano de EE. UU | . USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxima sodio inyección | |
| de povidona solución de yodo | Ganar-Medicare; India | ||
| Betadine Paraformaldehído | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sacarosa | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T. compuesto |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-albúmina cabra policlonal | Thermo Scientific, Pierce, EE. UU. | PA126081 | |
| anti-conexina 32/GJB1 Abcam policlonal | , Reino Unido | ab64609-500 | |
| antiGFP conejo policlonal | Biotecnología de Santa Cruz; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-cabra | Sondas moleculares, Thermo Fisher Scientific; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-ovejas | Sondas moleculares, Thermo Fisher Scientific; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 pollo anti conejo | Sondas moleculares, Thermo Fisher Scientific; US | A21442 | |
| Cabra anti conejo IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; EE. UU. | 65-6120 | |
| anti-Ki67 anticuerpo | abcam, Reino Unido | ab15580 | |
| Solución de desenmascaramiento de antígenos, base de ácido cítrico | Laboratorios de vectores, EE. UU. | H-3300 | |
| ProLong Diamond montante antidecoloración | Tecnologías de vida, Thermo Fisher scientific; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Sistema Clínico de Coral, India | ||
| KIT SGPT (ALAT) | Sistema Clínico de Coral, India | ||
| Kit de Fosfatasa Alcalina (DEA) | Sistema Clínico de Coral, India | ||
| Solución de Hematoxilina, Sigma de Mayer | ; Solución de | Y MHS16 | |
| alcohólico | ; Montaje | de HT110132 | |
| . | sigma; US | 6522 | |
| Melonex (Analgésico) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Inyección de Meloxicam | |
| Sistema de sustrato líquido mejorado DAB tetraclorhidrato Sigma | ; | D3939 |
Referencias
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and f....
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Reimpresiones y permisos
