Linfoma del manto (MCL) es un difícil de tratar el trastorno de la célula de B y es igualmente difícil establecer un modelo de ratón de xenoinjerto de MCL primaria a estudiar y desarrollar la terapéutica. Aquí, describimos el establecimiento acertado de xenoinjertos MCL en ratones para ayudar a comprender su biología subyacente.
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Artículo de método
Engraftment de tumor en un modelo de ratón de xenoinjerto de linfoma de manto humano
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Resumen
Resumen
Los linfocitos B son actores clave en la circulación de células inmunitarias y principalmente hogar y residen en los órganos linfoides. Mientras que las células B normales sólo proliferan cuando estimulados por los linfocitos T, células B oncogénicas sobrevivirán y amplían autónomamente en nichos de órgano indefinido. Linfoma del manto (MCL) es un tal trastorno de la célula de B, donde la tasa mediana de supervivencia de los pacientes es 4-5 años. Esto requiere la necesidad de mecanismos efectivos por que se bloquean el autoguiado hacia el blanco y el injerto de estas células con el fin de aumentar la supervivencia y longevidad de los pacientes. Por lo tanto, el esfuerzo para desarrollar un modelo de ratón de xenoinjerto para estudiar la eficacia de la terapéutica MCL bloqueando la recalada mecanismo en vivo es de suma importancia. Desarrollo de receptores animales para xenotransplante de células humanas para probar drogas etapa temprana largo han sido perseguido, como modelos de ratón preclínicos relevantes son cruciales para nuevos agentes terapéuticos pantalla. Este modelo animal se desarrolla para evitar el rechazo al injerto humano y establecer un modelo para enfermedades humanas, y puede ser una herramienta extremadamente útil para el estudio de progresión de la enfermedad de tipos diferentes de linfoma y para efectuar la prueba preclínica de fármacos candidatos para malignidades hematológicas, como MCL. Hemos establecido un modelo de ratón de xenoinjerto que servirá como un excelente recurso para estudiar y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para MCL.
Introducción
Linfocitos por naturaleza un papel importante en la vigilancia inmune, y trata de linfocitos es un paso crítico en la inmunidad específica de antígeno1,2de montaje. Este proceso incluye la migración de linfocitos T del timo al torrente sanguíneo y de allí a los órganos linfoides secundarios, incluyendo los ganglios linfáticos, placas de Peyer y bazo, donde se encuentran los antígenos afines. Los linfocitos B diferencian en la médula ósea y migran como ingenuo células en los folículos de los órganos linfoides secundarios3. Algunas de estas células B antígeno con su receptor unen y son activados por células T específicas. Proliferación y diferenciación de estas células B empuja las células Naive B desactivado, en la zona del manto del folículo. Las células activadas pueden distinguir entonces en memoria B las células, que patrullan el cuerpo, o maduran en inmunoglobulinas secretoras de las células plasmáticas que migran a la médula ósea4.
MCL se produce cuando los linfocitos B en la zona del manto se transforman en un tumor. Estas células de linfoma residen en el microambiente de los órganos linfoides y proliferan independientemente de linfocitos T específicos de control. Sin embargo, en un determinado momento de densidad escapan de este nicho y recirculan en el torrente sanguíneo en búsqueda de nichos en otros órganos. Teniendo en cuenta la complejidad de las moléculas de adhesión y la promiscuidad de quimiocinas y sus receptores, el mecanismo de este celular trata en vivo es mal entendido y por lo tanto dificulta la terapia. Se necesitan métodos nuevos para bloquear este proceso de migración para evitar que las células del linfoma B llegando a microambientes nuevo.
MCL es uno de los más difíciles para el tratamiento de tumores malignos de células B. El desarrollo de un fenotipo neoplásico de MCL es el resultado de una cascada multietapa, caracterizado por la adquisición de propiedades biológicas únicas. En el momento del diagnóstico, mayoría (70%) de los pacientes ya presentan una enfermedad diseminada, con una mayoría de casos exponiendo implicación extranodal en bazo, médula ósea, y en el tracto gastrointestinal5,6. En los pacientes tratados, recaídas de tumores resistentes dentro de unos años es común, a pesar de la quimioterapia convencional induce tasas de remisión alta a corto plazo7,8. Aquí presentamos un nuevo modelo de enfermedad que puede ayudar a entender su biología subyacente y difusión MCL: establecimos un modelo humano del ratón del xenoinjerto MCL que se originaron en las células del tumor primario de los pacientes. Esperamos que este modelo ayudará a desarrollar estrategias terapéuticas contra difusión de MCL y posiblemente proporcionar nuevas perspectivas clínicas para óptimo diagnóstico y tratamiento de los pacientes recaídos.
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Protocolo
Las muestras de sangre humana fueron utilizadas según procedimientos aprobados por los comités de experimentación humana del Hospital Universitario de Ginebra y de ética local.
Animales procedimientos fueron realizados según el institucional ética Comité de Animal Care en Ginebra, Suiza y la Oficina veterinaria Cantonal (número de autorización: 26/GE/15).
1. preparación de células mononucleares de sangre periférica primaria (PBMCs) por separación de gradiente de densidad
Nota: 3-5 mL de sangre periférica se obtuvo de pacientes con MCL en una fase leucémica. El diagnóstico fue establecido de acuerdo con criterios estándar de diagnóstico para citometría de flujo (CD5 +, CD23−, CD200 +, población monoclonal de células B) y posteriormente confirmado por la presencia de la translocación cromosómica t(11;14) y sobreexpresión de ciclina D1. En todos los casos, células B monoclonales constituyeron a > 90% de la población total de células B. Las células restantes fueron principalmente monocitos y algunos linfocitos T.
- Diluir 5 mL (1:1) de la muestra de sangre MCL con 5 mL de medio de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (figura 1A).
- Invertir los medios gradiente de densidad (Tabla de materiales) varias veces antes de su uso para asegurar una mezcla completa.
- Añadir 5 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de 15 mL con un aspirador de pipeta.
- Capa de la muestra de sangre diluida suavemente sobre los medios de gradiente de densidad en el tubo de centrífuga de 15 mL con un aspirador (relación medios gradiente de densidad de la sangre debe ser 2:1, por ejemplo, 10 mL de sangre a 5 mL de medio de gradiente de densidad). Debe tenerse cuidado para no mezclar las dos capas (figura 1B, C).
- Centrifugar la muestra a 400 x g durante 40 min a temperatura ambiente con los frenos de la centrifugadora apagados.
- Suavemente con una pipeta Pasteur estéril, aspirar la capa media (anillo blanquecino, delgado marcado con una flecha (figura 1, E)) que contiene las células mononucleares y transferirlos a un tubo limpio.
- Lavado de células mononucleares
- Estimar el volumen de la suspensión de células transferidas y añadirle 3 volúmenes de estéril 1 x de tampón fosfato salino (PBS) con 1% de albúmina sérica bovina (BSA).
- Mezcle la suspensión mediante pipeteo arriba y abajo varias veces.
- Centrifugar la suspensión a 400-500 x g durante 10-15 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante para obtener el precipitado de células y repetir el paso de lavado.
- Quite el sobrenadante y resuspender las células en el volumen deseado, por ejemplo, 1 o 2 mL de PBS.
- Contar el número de células por un contador de células automatizado o manualmente usando un hemocitómetro (cámara de Neubauer).
2. enriquecimiento de las células B por selección negativa de células B
- Diluir las células en PBS a una concentración final de 50 x 106 células/mL.
- Transferir las células a 5 mL tubo de poliestireno fondo redondo. Añadir 100 μl de anticuerpo cóctel del kit de enriquecimiento de la célula de B de 2 ml de la suspensión celular y suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo (figura 2-1).
- Incube las células a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Brevemente vortex las partículas magnéticas proporcionan en el kit de enriquecimiento de células B durante 30 s (figura 2-2). Añadir 150 μL de las partículas magnéticas a 2 mL de la muestra.
- Incubar la muestra para otros 5 minutos a temperatura ambiente.
- Llevar el volumen de muestra a 2.5 mL con PBS de x 1 que contiene 2% de suero de ternero fetal (FCS) y ácido etilendiaminotetraacético de 1 mM (EDTA). Coloque el tubo en el imán e incubar el tubo por otro 3-5 min (figura 2-3).
- Recoger el imán con el tubo en su lugar y en un movimiento continuo, decantar el tubo para que la suspensión de células enriquecido se recoge en un tubo fresco (figura 2-4). Contar las células por un contador de células automatizado o manualmente usando un hemocitómetro para obtener el rendimiento total de las células de B.
Nota: Normalmente, el rendimiento es ~ 105 B células/mL para normal las células de B y 5-50 x 106 células/mL para MCL. - Confirmar la pureza del enriquecimiento de la célula de B
- Tomar ~ 50.000 células e incubar las células con anticuerpos anti-CD19/CD20 (1:20 dilución) y anticuerpo anti-CD45, junto a diferentes fluorocromos (1:10 dilución) a temperatura ambiente durante 15-30 min.
- Lavar con 1 mL de 1 x PBS + 1% de BSA, centrifugar las células a 400-500 x g durante 5 min y resuspender las células en ~ 200 μL de PBS.
- Adquirir las muestras de células por citometría de flujo y analizar la pureza de las células de B. La pureza es en su mayoría > 90% por este método (figura 3).
3. desarrollo del modelo de ratón de xenoinjerto
- Suspender ~ 40-60 x 106 células en 150-200 μL de PBS 1 x (volumen necesaria para inyectar al ratón).
- Inyecte 150 μL de la suspensión celular por vía intravenosa (i.v.) en cada vena de la cola de ratones inmunodeficientes 6-7 semana viejo de la gamma (NSG) del NOD scid independientemente del género (Figura 4A).
- Permitir que los ratones a desarrollar linfoma humano de aproximadamente 10 semanas.
Nota: Las células de linfoma humano primario toman mucho más tiempo para desarrollar tumor en comparación con líneas de células de linfoma humano (~ 3 semanas). - Cuando los animales comienzan a mostrar síntomas de una enfermedad mortal como la pérdida de peso, pelo rizado, parálisis de extremidades, disminución de la actividad, etc., sacrificar a los ratones por CO2 asfixia seguida por punción cardiaca corazón para obtener sangre.
- Recogemos diferentes órganos como médula ósea, bazo y hígado por disección de los ratones y recoger sangre periférica por extraer sangre desde el corazón en el momento del sacrificio para el análisis de engraftment de tumor (Figura 4B -F).
4. Análisis de quimerismo de células tumorales Engrafted en diferentes órganos
- Después de recoger los diferentes órganos, procesarlos por la interrupción mecánica para generar suspensiones de la célula después de lisis de glóbulos rojos (gr) con 200 μL de 1 x de buffer de cloruro de amonio potasio de sangre y médula ósea, 500 μl de bazo y 2 mL para el hígado .
- Cuente y teñir las células con anticuerpos de células B humanas, es decir, anti-CD19, anti-CD20 y anti-CD45.
Nota: Ratones NSG carecen las células de B y por lo tanto, para el análisis, se tiñen las células con marcadores de células B específicas humanas. - Analizar las células de cada órgano mediante citometría de flujo por que bloquean a las células B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
- Cuantificar las células del tumor implantada en diversos órganos derivadas de ratones MCL inyectado en las células cerradas base como se indica en el paso 4.3 (figura 4).
Nota: Para detalles, véase Tabla de materiales .
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Resultados
El manuscrito describe un protocolo optimizado para el desarrollo exitoso de un modelo de ratón de xenoinjerto de engraftment de células MCL. Preparación de una población celular pura (en este caso células MCL), es muy crítico para desarrollar exitosos xenoinjertos MCL. La figura 1 representa los pasos preparativas para el aislamiento de células mononucleares de sangre del paciente MCL por separación de gradiente de densidad. Las células mononucleares son pro...
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Discusión
Los ensayos clínicos son posibles para los medicamentos que están en una etapa avanzada de desarrollo pero no se puede utilizar para el descubrimiento de medicamentos. Esfuerzos para desarrollar a animales destinatarios para xenotransplante de células humanas para probar drogas etapa temprana largo han sido llevadas a cabo. Aquí presentamos un modelo animal que evita el rechazo al injerto humano y puede establecer un modelo para enfermedades humanas, como MCL. Esto es en la actualidad un modelo de xenoinjerto de vanguard...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Ligue Genevoise contre le Cancer, Fundación Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 y 2914-02-2012 y subvención de Fundación de ciencia nacional suizo 31003A_156760 y 310030-153456.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medios Ficoll-paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | para la separación de células mononucleares |
| RPMI Medium 1640 | Gibco-Life technologies | 61870-010 | para la dilución de muestras de sangre |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | lavado de células |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | para la preparación de PBS con 1% de BSA utilizado en el lavado de células durante el aislamiento |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | marcador de células pan-B humanas |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | marcador de células pan-B humanas |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | marcador de células pan-B humanas |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | marcador |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | Proteína de superficie celular típicamente ausente en MCL |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | Marcador panleucocítico |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | Proteína de superficie celular típicamente ausente en ratones MCL |
| NOD scid gamma (NSG) | Charles River Laboratories | 5557 | utilizado para desarrollar xenoinjertos MCL en este estudio |
| Kit de enriquecimiento de células B humanas Easy sep | Tecnologías de células madre | 19054 | utilizadas para enriquecer células B para obtener células puras para inyectar en ratones |
| FACS | Beckman Coulter | Navios | utilizado para caracterizar la muestra de MCL y estudiar los órganos para el injerto de MCL |
| 1X tampón | tampón de lisis de sangre roja (NH4Cl 8,024 mg / l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA. Na2 y punto medio; 2H2O 3.722 mg/l ) |
Referencias
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