Se describe un método basado en HPLC para la determinación de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilenuramínico en hígado y leche de ratón.
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Artículo de método
Determinación de ácidos siálicos en hígado y muestras de leche de tipo salvaje y
En este artículo
Resumen
Resumen
El CMAH (citidina monofosfato-N-acetilneuramínico hidroxilasa) es responsable de la oxidación de citidina monofosfato-N-acetilneuramínico en mamíferos. Sin embargo, los seres humanos no pueden oxidar el ácido monofosfato de citidina-N-acetilneuramínico a ácido monofosfato de citidina-N-glicolilneuramínico debido a una deleción del exón primario del gen CMAH . Para entender los efectos y las implicaciones de la falta de actividad de CMAH con más detalle, un modelo de eliminación de Cmah en ratones es de gran interés en la investigación básica y aplicada. El método de análisis para determinar el fenotipo de este modelo de ratón se describe aquí en detalle y se basa en la detección de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilenuramínico en el hígado y leche de ratones knock-out de tipo salvaje y Cmah . Los ácidos siálicos endógenos se liberan y se derivatizan con o-fenilendiamina para generar derivados fluorogénicos, que pueden analizarse posteriormente por HPLC. El protocolo presentado puede serTambién se aplicó para el análisis de leche y muestras de tejidos de otros orígenes, y puede ser útil para investigar los efectos nutricionales y para la salud del ácido N-glicolilneuramínico.
Introducción
El ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y el ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) son los ácidos siálicos más comunes en la mayoría de los mamíferos 1 . Aunque son capaces de sintetizar endógenamente Neu5Ac, los seres humanos no son capaces de producir Neu5Gc debido a una deleción primaria de exón en el gen CMAH que codifica para una hidroxilasa 2 , 3 de CMP-Neu5Ac. Sin embargo, los productos alimenticios de origen animal pueden ser fuentes dietéticas de Neu5Gc 4 , 5 , 6 , lo que conduc....
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Protocolo
Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Ético del Centro Experimental de Animales de la Universidad Agrícola de Nanjing de acuerdo con las Directrices Nacionales para el Bienestar Animal Experimental (Ministerio de Ciencia y Tecnología, RP de China, 2006) con los animales alojados en un SPF (ID de permiso: SYXK-J-2011-0037).
1. Cmah Knock-out modelo de ratón
- Utilizar ratones C57B1 / 6 de tipo salvaje del Centro de Medicina Comparada de la Universidad de Yangzhou (China).
NOTA: Se generaron ratones knock-out Cmah basándose en la información proporcionada a part....
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Resultados
Una representación esquemática del método de análisis descrito se muestra en la Figura 1 e incluye el aislamiento de ácidos siálicos de leche y muestras de hígado de ratones mutantes knock-out de tipo salvaje y Cmah y la derivatización de fluorescencia y análisis HPLC de estos componentes. La Figura 2 y la Figura 3 muestran cromatogramas HPLC representativos de ácidos siálicos derivatizados.......
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Discusión
El protocolo presentado aquí permite la evaluación fenotípica de ratones knock-out homocigóticos Cmah analizando y cuantificando las cantidades relativas de Neu5Gc de leche y muestras de hígado. El análisis se realizó utilizando una configuración de HPLC estándar con detección de fluorescencia. El paso más crítico de este procedimiento es la preparación de las columnas de intercambio aniónico y la realización de la cromatografía de intercambio aniónico; Para sedimentar la resina adecuadamente y para re.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de Ciencias Naturales de China (los números de subvención 31471703, A0201300537 y 31671854 a JV y LL), y el plan de 100 Talentos Extranjeros (concesión número JSB2014012 a JV).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| químicos: | |||
| K Scientific Ltd | 75234 | ||
| Herramientas/Materiales: | |||
| 3 mL Tubos SPE | Supelco | Sigma 57024 | columnas de extracción vacías en fase sólida |
| Luer llave de paso Sigma | S7396 | para detener el flujo del tubo SPE | |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 malla |
| Amoladora de tejidos Dounce | Sigma | D8938 | apretado |
| análisis de HPLC: | |||
| vial de HPLC de alta recuperación | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| Sistema de HPLC | Shimadzu | Nexera | |
| Detector de fluorescencia para HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Columna | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4,6 mm |
| Grado LCMS H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| Acetonitrilo de grado LCMS | Merck Millipore | #100029 | |
| Solución de hidróxido de amonio | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
Referencias
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A.
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Reimpresiones y permisos
