Artículo de método

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

DOI:

10.3791/56039

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12 de septiembre de 2017

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1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Resumen

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La aorta es la arteria más grande en el cuerpo. La pared aórtica se compone de una capa interna de células endoteliales, una capa intermedia de alternan laminillas elásticas y células musculares lisas (SMCs) y una capa externa de fibroblastos y matriz extracelular. En contraste con el extenso estudio de modelos patológicos (por ejemplo, ateroesclerosis) en la aorta del adulto, mucho menos se sabe sobre la aorta embrionaria y perinatal. Aquí, nos centramos en comités y protocolos para el análisis de la morfogénesis y patogénesis de la SMCs aorta embrionarias y perinatales en el desarrollo normal y la enfermedad. Específicamente, los cuatro protocolos incluidos son: i) en vivo destino embrionario mapeo y análisis clonal; II) explante aorta embrionaria cultura; III) aislamiento SMC de la aorta perinatal; y iv) colocación de mini-bomba osmótico subcutánea en ratones embarazadas (o no-). Así, estos enfoques facilitan la investigación de los orígenes, destino y arquitectura clonal de comités en la aorta en vivo. Que permiten la modulación de morfogénesis de aorta embrionaria en el útero por la continua exposición a agentes farmacológicos. Además, explantes de tejido aórtico aislado o comités aórticas pueden utilizarse para ganar penetraciones en el papel de objetivos gen específico durante procesos fundamentales tales como la migración, proliferación y muscularization. Estos experimentos de generación de hipótesis en comités aislados y la aorta explanted entonces pueden evaluarse en el contexto de en vivo a través de enfoques farmacológicos y genéticos.

Introducción

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Circulatorio de la función de los organismos multicelulares para entregar nutrientes y oxígeno a las células son no en contacto con el medio externo y para eliminar productos de desecho y dióxido de carbono de estas células. En vertebrados, el sistema circulatorio primario consiste en el corazón, que las bombas de la sangre a través de una serie de vasos sanguíneos. Las paredes de grandes vasos sanguíneos, como arterias y venas, consisten en tres capas: i) la íntima o capa interna de células endoteliales; II) los medios de comunicación o capa media alternancia circunferencial alargada de las células musculares lisas comités y laminillas elásticas; y iii) la adventicia....

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Protocolo

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todos los protocolos de ratón son aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en Universidad de Yale.

1. mapeo de destino embrionario In Vivo y análisis Clonal

Nota: hemos utilizado estos enfoques ampliamente para evaluar los orígenes de las células y su arquitectura clonal en modelos de desarrollo y la enfermedad 7 , 8 , 9 , 10.

  1. establece apareamiento entre ratones con un CreER y ratones con un reportero de Cre.
    Nota: Se utiliza un CreER pa....

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Resultados

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En un representante análisis clonal de comités en el mutante de embriones para el Eln (el gene que codifica la elastina proteína de matriz extracelular), Eln(+/-), CreER Acta2T2 ratones fueron apoyadas en ratones Eln(+/-) también lleva la multicolor ROSA26R(Rb/Rb) reportero. Como se describe en el paso 1, se revisaron las bujías presas embarazadas fueron inducidos con una inyección de tamoxifeno solo (1,5 mg) en E12........

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Discusión

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En contraste con las investigaciones extensas de la aorta murina y sus ramas principales en adultos condiciones patológicas, tales como modelos de aterosclerosis, se sabe menos sobre la morfogénesis y la patogenesia de la aorta embrionaria y perinatal. Aquí nos centramos en la aorta embrionaria/perinatal, especialmente las PYME y proporcionar protocolos para estudiar la aorta a través de en vivo, explantes de tejido, y aislamiento de SMC se acerca. Estos enfoques cortesía proporcionan al investigador con diverso.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Dean Li para el intercambio de protocolo de su laboratorio para el aislamiento de SMC aórtica. Apoyo financiero fue provisto por los institutos nacionales de salud (R21NS088854, R01HL125815 y R01HL133016 a D.M.G), la Asociación Americana del corazón (14GRNT19990019 subvenciones a D.M.G.) y la Universidad de Yale (Brown-Coxe beca para A.M. y puesta en marcha fondos a D.M.G.).

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
TamoxifenoSigmaT5648
Aceite de maízSigmaC-8267Vehículo para tamoxifeno
4-OH-tamoxifenoSigmaH7904Metabolito activo del tamoxifeno
ProgesteronaSigmaP8783-5GUso a la mitad de la concentración del compuesto OCT de tamoxifeno
Sakura tissue tek4583Para la fabricación de criobloques
CryomoldsPolysciences inc18986
DAPISigmaD9542Tinción IHC del núcleo, concentración final 5 mg/mL
Cy3 anticuerpo anti-SMA conjugado directamente SigmaA2547Tinción IHQ de SMA, dilución final 1:500
Anticuerpo anti-CD31BD Pharmingen550274IHC tinción de GFP, concentración final 0,006 mg/mL
Anticuerpo anti-GFPThermo Fisher ScientificA-11121Tinción IHQ de CD31, concentración final 0,0016 mg/mL
Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra, Alexa 647Life Technologiesa21244Tinción de IHC, concentración final 0,004 mg/mL
Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra, Alexa 488Life Technologiesa11008Tinción de IHC, concentración final 0,004 mg/mL
DMEMThermo Fisher Scientific10567-014Para cultivo celular
FBSThermo Fisher Scientific10437028
Anticuerpo bloqueador de integrina beta3BD Biosciences553343 Clon 2C9. G2, concentración final 0,02 mg/mL
ColagenasaWorthington Biochemical Corp44H14977APara la digestión de la aorta
ElastaseWorthington Biochemical Corp34K15139Para la digestión de la aorta
Antibiótico-antimicótico (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
FGF humano recombinantePromegaG5071
Recombinante EGF humanoPromegaG5021
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Anfotericina BThermo Fisher Scientific 15290026
Placas de cultivo de tejidosMinibomba
AlzetDurect Corporation2001
ECLIPSE 80i Vertical Microscopio fluorescenteNikon 
  TCS  SP5Sónico Leica
Branson 450ratones VWR
Myh11-CreERT2El laboratorio Jackson 19079
Acta2-CreERT2Obtenidos del laboratorio del Dr. Pierre Chambon y Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2El Laboratorio Jackson 8463
ratones ROSA26R(mTmG/mTmG)El Laboratorio Jackson  
ROSA26R(EYFP/EYFP)ratones El Laboratorio Jackson   006148 
ROSA26R(Confeti/Confeti) ratonesEl Laboratorio Jackson 13731
ROSA26R(Rb/Rb)ratones Laboratorio del Dr. Irv WeissmanObtenido del laboratorio del Dr. Irv Weissman
osmótica Corning CLS430165 Ratones ratones 026862

Referencias

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  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smoo....

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Etiquetas

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