Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

Resumen

Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Resumen

La aorta es la arteria más grande en el cuerpo. La pared aórtica se compone de una capa interna de células endoteliales, una capa intermedia de alternan laminillas elásticas y células musculares lisas (SMCs) y una capa externa de fibroblastos y matriz extracelular. En contraste con el extenso estudio de modelos patológicos (por ejemplo, ateroesclerosis) en la aorta del adulto, mucho menos se sabe sobre la aorta embrionaria y perinatal. Aquí, nos centramos en comités y protocolos para el análisis de la morfogénesis y patogénesis de la SMCs aorta embrionarias y perinatales en el desarrollo normal y la enfermedad. Específicamente, los cuatro protocolos incluidos son: i) en vivo destino embrionario mapeo y análisis clonal; II) explante aorta embrionaria cultura; III) aislamiento SMC de la aorta perinatal; y iv) colocación de mini-bomba osmótico subcutánea en ratones embarazadas (o no-). Así, estos enfoques facilitan la investigación de los orígenes, destino y arquitectura clonal de comités en la aorta en vivo. Que permiten la modulación de morfogénesis de aorta embrionaria en el útero por la continua exposición a agentes farmacológicos. Además, explantes de tejido aórtico aislado o comités aórticas pueden utilizarse para ganar penetraciones en el papel de objetivos gen específico durante procesos fundamentales tales como la migración, proliferación y muscularization. Estos experimentos de generación de hipótesis en comités aislados y la aorta explanted entonces pueden evaluarse en el contexto de en vivo a través de enfoques farmacológicos y genéticos.

Introducción

Circulatorio de la función de los organismos multicelulares para entregar nutrientes y oxígeno a las células son no en contacto con el medio externo y para eliminar productos de desecho y dióxido de carbono de estas células. En vertebrados, el sistema circulatorio primario consiste en el corazón, que las bombas de la sangre a través de una serie de vasos sanguíneos. Las paredes de grandes vasos sanguíneos, como arterias y venas, consisten en tres capas: i) la íntima o capa interna de células endoteliales; II) los medios de comunicación o capa media alternancia circunferencial alargada de las células musculares lisas comités y laminillas elásticas; y iii) la adventicia o capa externa de tejido conectivo y los fibroblastos. La gran mayoría de los estudios en biología vascular se centran en las células endoteliales, investiga la formación de nuevos tubos de revestimiento de células endoteliales a través de la angiogénesis. En comparación, comités reciben relativamente poca atención. Sin embargo, los comités son un tipo de célula fundamental en la construcción de la pared arterial normal y patologías vasculares.

La aorta es la arteria de mayor calibre en el cuerpo, recibiendo el gasto cardíaco del ventrículo izquierdo del corazón. Es afectado por diversas enfermedades humanas, incluyendo la aterosclerosis, aneurisma y disección. En organismos adultos, la aorta y sus ramas principales son intensamente estudiados en modelos de enfermedad vascular. Por ejemplo, dieta alta en grasas alimentó ratones que son nulos para el gen que codifica el receptor de lipoproteína de baja densidad o apolipoproteína E, desarrollar la ateroesclerosis, y estudios recientes de asignación de destino indican que SMCs preexistentes dan lugar a múltiples tipos de células en la ¹de la placa aterosclerótica. En aneurismas de la aorta, los cambios patológicos incluyen SMC apoptosis y matriz extracelular remodelación^2,3.

Sustancialmente se sabe menos sobre SMC morfogénesis y patogénesis durante los períodos embrionarios y perinatales. Aquí, le ofrecemos protocolos para estudiar embrionaria y perinatal aórtica SMCs en vivo, en explantes de tejidos y en células aisladas. Por ejemplo, la primera sección del protocolo delinea destino mapeo y análisis clonal en ratones embrionarios. Recombinase de CRE expresado bajo el control de un promotor específico de célula facilita el marcado de células específicas y su progenie^4,5,6; sin embargo, el control temporal de células específicas de etiquetado puede ser difícil durante el desarrollo embrionario en ratones. En este contexto, con los embriones expresando el CreER condicional bajo un promotor activo en comités (e.g.,Myh11 o Acta2) y un reportero de Cre, ofrecemos métodos para inyectar el tamoxifeno o su metabolito activo 4-OH-tamoxifeno en las madres embarazadas y para analizar las células etiquetadas en embriones o vástagos postnatal. Además, en contraste con estudios de asignación de destino, que predominantemente utilizan Cre reporteros con un solo reportero fluoróforo^1,7, análisis clonal es sustancialmente mejorado con reporteros de Cre de varios colores.

Las secciones segunda y terceros del protocolo describen los métodos para aislar y cultivar explantes aórticos embrionarios y aórticas comités de recién nacidos, respectivamente. Estos enfoques permiten la manipulación de vías de señalización, concretamente en explantes aórticos o PYME y para analizar los efectos directos de los agentes farmacológicos. Así, el papel de genes específicos en el tejido de interés puede ser defendido en una manera mucho más rápida que a través de manipulaciones genéticas tradicionales en ratones. Además, los estudios aislados de SMC facilitan el análisis de la migración celular y adherencia, que son técnicamente limitado en vivo.

Por último, la cuarta sección de protocolo delinea la colocación de una mini-bomba osmótica subcutánea repleta de agentes farmacológicos en ratones embarazadas (o no-). Este método facilita el análisis del efecto sobre el desarrollo embrionario causada por agentes que requieren infusión continua debido a metabolismo rápido. La alternativa de inyecciones frecuentes no es práctica para muchos agentes y debe evitarse, ya que puede causar malestar significativo en la presa embarazada.

Protocolo

todos los protocolos de ratón son aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en Universidad de Yale.

1. mapeo de destino embrionario In Vivo y análisis Clonal

Nota: hemos utilizado estos enfoques ampliamente para evaluar los orígenes de las células y su arquitectura clonal en modelos de desarrollo y la enfermedad ^{7 , 8 , 9 , 10}.

1. establece apareamiento entre ratones con un CreER y ratones con un reportero de Cre.
   Nota: Se utiliza un CreER para SMC marcado. Myh11-CreERT2 o CreERT2 Acta2 ratones ^{11 , 12} se utiliza comúnmente para este propósito. Hemos utilizado ratones de ROSA26R-CreERT2 ¹³ para marcar ampliamente tejidos embrionarios.
   1. Para análisis clonal, utilice un multicolor Cre reportero (por ejemplo, confeti o ratones del arco iris [Rb]) ^{8 , 14 , 15} y para la asignación de destino, utilice un reportero de Cre solo color (por ejemplo, ROSA26R-YFP ratones ¹⁶) o el reportero de Cre de doble color ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) ¹⁷.
      Nota: Este esquema de crianza utiliza ratones adultos que tienen 2-6 meses de edad (generalmente ~ 30 g) y la generación de embriones con un CreER y un reportero de Cre.
2. Compruebe tapones vaginales en la mañana usando un metal de sondan y consideran a mediodía en el día de detección de enchufe como día embrionario (E) 0.5.
3. Separar la hembra del macho cuando se detecta un enchufe de.
4. Prepare 4-OH-tamoxifeno y soluciones de trabajo de tamoxifeno.
   1. Para 4-OH-tamoxifeno, disolver 5 mg en 50 μl de etanol al 100%, vortex por 2 min y luego añadir 450 μl de aceite de maíz. En el hielo, someter a ultrasonidos a nivel de la salida 2 para 10 ciclos de s con descanso entre ciclos hasta que la muestra se refresca abajo. Después la muestra se haya disuelto completamente (normalmente ~ 4-5 ciclos de sonicación), tomar 200 μL de solución de sonicación y disolver en 1.800 μl del aceite de maíz para hacer la solución de trabajo final (4-OH-tamoxifeno, 1 mg/mL).
   2. De tamoxifeno, diluir a 50 mg/mL en etanol al 100% y agitar hasta que se disuelva. Diluido en aceite de maíz para hacer la solución final (tamoxifen 10 mg/mL) y agitar a 45 ° C para garantizar que esté completamente disuelta.
5. De inducción embrionaria temprana, inyectar 4-OH-tamoxifeno por vía intraperitoneal a una presa embarazada.
   1. Usan inyecciones de 4-OH-tamoxifeno (~ 150 μg por ratón embarazado, o aproximadamente 5 mg/kg de peso) en E5.5 y posteriormente como rinden presa viable, embriones y crías de.
   2. Uso de tamoxifeno en dosis de 0.5 - 1.5 mg (o 17-50 mg/kg) para presas embarazadas con embriones en ~ E9 y después de eso. Use una aguja de 30G para todas las inyecciones.
      Nota: Filtración con filtro 0,22 μm típicamente se utiliza para esterilizar todas las mezclas antes de la inyección.
6. Para análisis clonal, utilizar inyecciones intraperitoneales de altas dosis de 4-OH-tamoxifeno (p. ej., 5 mg/kg) o tamoxifeno (p. ej., 50 mg/kg) para marcar varias celdas.
   1. Para marcar las células individuales, valorar a la dosis de 4-OH-tamoxifeno o tamoxifeno que en el tejido de interés (es decir, la aorta), casi todos los embriones analizados (como se describe a continuación al final de esta sección) no tienen sólo las células o las células etiquetadas de un solo color; Esta es la dosis umbral.
7. Para marcar células en el período gestacional media tardía y rastrear su destino o clonality en el ratón postnatal, inyectar progesterona en la cavidad intraperitoneal de la presa embarazada concomitante con tamoxifeno en el 1:2 (progesterona: tamoxifeno) relación dosis.
   Nota: Dosis de tamoxifeno son 17-50 mg/kg y dosis de progesterona son 8.5-25 mg/kg (es decir, la mitad de las dosis de tamoxifeno). La inyección de progesterona puede retrasar el trabajo de ~ 1-2 días.
8. Euthanize la presa embarazada con embriones de una edad deseada utilizando un método de caída libre, donde la presa se coloca en un recipiente que contiene el algodón o gasa empapada con isoflurano no diluido. Confirman muerte por abrir la cavidad torácica para inducir neumotórax, retirando los órganos vitales, o realizando la dislocación cervical.
9. Limpiar el abdomen con etanol al 70%. Usar tijeras para abrir el abdomen y disecar hacia fuera del útero. Retire los embriones del útero y separar cuidadosamente los embriones de la placenta y el saco vitelino mediante fórceps.
10. Eutanasia los embriones en E15 o mayores mediante la realización de la dislocación cervical o Decapitación con tijeras quirúrgicas o una cuchilla afilada.
    Nota: Embriones menores de E15 mueren rápidamente después de eutanasia de la madre o la eliminación de los embriones de la madre.
11. Colocar los embriones en PBS helado y cortar un pequeño trozo de cola con unas tijeras a genotipo del CreER y Cre reportero de.
12. Fijar los embriones en paraformaldehído al 4% a 4 ° C por 2 h. lavar los embriones tres veces en PBS y luego incubar los embriones en sacarosa de 30% en PBS en tubos de 15 mL, esperar hasta que se hunden, que puede tardar hasta dos días.
13. Relleno de plástico de congelación los moldes hasta 2/3 del máximo nivel con la temperatura de corte óptimo (OCT) compuesto. Coloque cada embrión en posición vertical en el molde, completamente sumergido en octubre incubar 10 min a temperatura ambiente (RT) para minimizar las burbujas.
14. Lugar de congelación bloques de tejido en un hielo seco, baño de etanol 70% para congelar. Almacenar los bloques a -80 ° C.
15. Ajustar la temperatura de criostato a-22 ° C y cortar bloques para generar secciones transversales a través de la aorta entera, 10-20 μm de espesor. Secar los portaobjetos a temperatura ambiente por 30 min antes del almacenamiento a -80 ° C.
16. Descongelar las diapositivas a temperatura ambiente, protegidos de la luz para evitar el blanqueo de fluoróforos. Lave los portaobjetos con PBS Tween20 0.1%.
    1. Para análisis clonal, mancha las diapositivas para núcleos (DAPI, 5 mg/mL) y directamente la imagen otros fluoróforos en el reportero de Cre de arco iris (Cerulean: 433 nm de excitación máxima, 475 nm emisión máximo; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm 610 nm).
       1. Uso los siguientes filtros para la detección de fluoróforos con un microscopio fluorescente vertical: DAPI (excitación max/ancho de banda 350/50 nm, emisión max/banda 460/50 nm), Cerulean (excitación 436/20 nm, emisión 480/40 nm), rojo texas (excitación 560 / 40 nm, emisión 630/75 nm) y filtro personalizado para separar mCherry mOrange (excitación 577/10 nm, emisión 630/50 nm).
    2. Para la asignación de destino con el reportero de Cre mTmG, detectar GFP (484 nm, 510 nm), ya sea por proyección de imagen directamente o mediante inmunotinción. Para la proyección de imagen con un microscopio fluorescente vertical Utilice un filtro GFP (excitación 470/40 nm, emisión 525/50 nm).
    3. Para la inmunotinción, incubar secciones con anticuerpos primarios durante la noche a 4 º C, lavar con 0,1% Tritón X-100 en PBS y luego incubar con anticuerpos secundarios para 1 h. uso anti-CD31 (concentración final 0,0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) y Cy3-anticuerpos primarios directamente conjugados anti-SMA (dilución final de 1: 500) y antibodie secundaria del usos directamente conjugado con fluoróforos (dilución final de 1: 500) (véase la Tabla de materiales).
17. Diapositivas de imágenes con un microscopio fluorescente vertical (aumento: 4 X - 20 X) o microscopio de confocal (10 X-63 X). Para alta magnificación, utilice un 63 proyección de imagen confocal x objetivo de aceite con una apertura numérica de 0.6 1.4 y un tamaño de fotograma de 1.024 x 1.024 píxeles.

2. Explante cultura Aorta embrionaria

Nota: este acercamiento fue utilizado previamente para evaluar la función de la integrina beta3 en estenosis de la explanted Eln ^{(- / -)} aorta embrionaria ^{9 , 18}.

1. eutanasia a una presa embarazada programado en E15.5 por inhalación isoflurano exceso, según paso 1.8, por encima de.
2. Cosecha y eutanasia a los embriones, según pasos 1.9-1.10, encima de.
3. Colocar el embrión abúlicamente y pin las extremidades extendidas a la mesa de disección. Visualizar con un estereoscopio de disección y utilice tijeras para cortar una incisión vertical desde el abdomen a través del esternón en el tórax superior. A disecar el timo, tráquea, pulmones, esófago, hígado e intestino.
4. Suavemente tire el corazón ventral con unas pinzas y tijeras para disecar la aorta de la cara dorsal de las cavidades torácica y abdominales. Para liberar la aorta, la corte en la raíz proximal y las distales abdominales posiciones.
5. Coloque la aorta en helada PBS estéril en una campana de cultivo celular. Transferencia de la aorta a una placa de 24 pocillos y cultura en DMEM con 0.5% FBS para hasta 24 h a 37 ° C.
   Nota: El medio de cultivo puede ser suplido con un anticuerpo de bloqueo (p. ej., anti-integrina αvβ3 anticuerpo en 0,02 mg/mL ⁹; vea la Tabla de materiales) o con un agente farmacológico.
6. Lavar la aorta dos veces con PBS y luego arreglarlo con paraformaldehído al 4% por 20 min.
7. Lavado tres veces con PBS y la transferencia de la aorta a un tubo de 1,5 mL con 30% de sacarosa en PBS. Después de que la aorta se hunde, hacer bloques de tejido congelado, corte secciones y immunostain, como se describe en pasos 1.13 1.15, por encima de.

3. Aislamiento de SMC de la Aorta Perinatal

Nota: este enfoque está siendo usado para comparar la biología de la SMCs aórticas aislada de Eln ^{(- / -)} y tipo salvaje ratones perinatales.

1. Euthanize un murino pup en el día postnatal (P) 0.5, por dislocación cervical o por decapitación con tijeras quirúrgicas o una cuchilla afilada, como se describe en el paso 1.10, encima de.
2. Realizar paso 2.3 y luego, después de abrir el tórax y el abdomen, punción ventrículo izquierdo con aguja de 23G. Tubería plástica de uso para conectar la aguja a la jeringa que contiene PBS estéril sostenido verticalmente en una posición elevada para que PBS fluye hacia el ventrículo izquierdo por gravedad. Permiten la infusión de PBS estéril en el ventrículo izquierdo hasta el hígado, palidece.
   1. Usar pinzas para remover el tejido adventicial en el exterior de la aorta y disección de la aorta como se describe en el paso 2.4.
3. Digerir la aorta en una única solución de DMEM (500 μl) complementado con 225 de U/mL colagenasa, elastasa U/mL 2.25 y antibiótico-antimicótico durante 45 min a 37 shake C. manual de ° 1 x el tubo cada 5-10 minutos
4. En la campana de la cultura de célula estéril, titurate el tejido digerido por arriba y abajo el pipeteo con una pipeta de 200 μL para generar una suspensión unicelular. Transfiera la suspensión unicelular a un tubo de 15 mL, agregar 2 mL de DMEM y centrifugue a 920 x g durante 5 min a 25 ° C.
5. Descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 3 mL de medio de cultivo SMC (DMEM con 10% FBS suplementados con 1 μg/mL rhFGF, rhEGF 10 μg/mL, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 2.5 μg/mL de anfotericina B). Transferir a una placa de cultivo de 35 mm.
   Nota: A aislamiento inicial, ~ 400.000 células se obtienen de una sola P0.5 wildtype aorta; ~ 300.000 de estas células son PYME.
6. Las células a 37 ° C de la cultura y cambiar a SMC cultura medio fresco cada 3 días. Usando las técnicas estándar con tripsina, paso de las células al confluente. Para los experimentos, se utilizan células de pasos 3-7.

4. Ratones de colocación de mini-bomba osmótica en embarazadas (o no embarazadas) subcutáneas

Nota: este acercamiento fue utilizado previamente para entregar continuamente un agente farmacológico (p. ej., integrina β3 y β5 inhibidor cilengitida) a los embriones en el útero de ⁹. La bomba se inserta en la presa embarazada en E13.5 y mantuvo hasta parto.

1. Anestesiar ratones con 2-5% de isoflurano en oxígeno (velocidad de flujo de 1 L/min) para la inducción y 1-3% para el mantenimiento. Utilizar el reflejo del pellizco del dedo del pie para controlar el nivel de anestesia y ajuste al agente anestésico según sea necesario. Administrar buprenorfina subcutánea (0.05 - 0.1 mg/kg) para la analgesia.
2. Afeitar la espalda baja con clippers. Utilizar instrumentos, guantes y cortinas estériles y mantener los ratones en una placa de calefacción quirúrgico durante la cirugía.
3. Colocar cada ratón en posición prona y frote la espalda con betadine seguido de alcohol isopropílico. Aproximadamente 3-5 cm rostral a la base de la cola en la espalda baja, utilizar un bisturí para hacer una incisión horizontal piel 0.5 - 1.0 cm de longitud sin lesionar el músculo subyacente.
4. Introduzca una pinza en la incisión y se crea un bolsillo subcutáneo rostral para la implantación de la bomba al abrir y cerrar las mordazas de la pinza hemostática.
5. Llenar una mini-bomba osmótica con el agente de elección, según el fabricante ' pautas de s (véase la Tabla de materiales). Introducir la bomba llenada en el bolsillo y cerrar la incisión con pinzas o suturas no absorbible 6-0. Asegurarse de que el tiempo quirúrgico total es menos de 10 minutos
6. Monitor durante el postoperatorio, los ratones cada 15 min hasta que han recuperado de recumbency esternal. Administre buprenorfina subcutánea (0.05 - 0.1 mg/kg) cada 6-12 h durante 48 h. Cuando los ratones han recuperado de la anestesia general, control diario. Retire las pinzas o suturas después de la cirugía 7-10 días.

Resultados

En un representante análisis clonal de comités en el mutante de embriones para el Eln (el gene que codifica la elastina proteína de matriz extracelular), Eln^(+/-), CreER Acta2^T2 ratones fueron apoyadas en ratones Eln^(+/-) también lleva la multicolor ROSA26R^(Rb/Rb) reportero. Como se describe en el paso 1, se revisaron las bujías presas embarazadas fueron inducidos con una inyección de tamoxifeno solo (1,5 mg) en E12....

Discusión

En contraste con las investigaciones extensas de la aorta murina y sus ramas principales en adultos condiciones patológicas, tales como modelos de aterosclerosis, se sabe menos sobre la morfogénesis y la patogenesia de la aorta embrionaria y perinatal. Aquí nos centramos en la aorta embrionaria/perinatal, especialmente las PYME y proporcionar protocolos para estudiar la aorta a través de en vivo, explantes de tejido, y aislamiento de SMC se acerca. Estos enfoques cortesía proporcionan al investigador con diverso...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tamoxifeno	Sigma	T5648
Aceite de maíz	Sigma	C-8267	Vehículo para tamoxifeno
4-OH-tamoxifeno	Sigma	H7904	Metabolito activo del tamoxifeno
Progesterona	Sigma	P8783-5G	Uso a la mitad de la concentración del compuesto OCT de tamoxifeno
	Sakura tissue tek	4583	Para la fabricación de criobloques
Cryomolds	Polysciences inc	18986
DAPI	Sigma	D9542	Tinción IHC del núcleo, concentración final 5 mg/mL
Cy3 anticuerpo anti-SMA conjugado directamente Sigma		A2547	Tinción IHQ de SMA, dilución final 1:500
Anticuerpo anti-CD31	BD Pharmingen	550274	IHC tinción de GFP, concentración final 0,006 mg/mL
Anticuerpo anti-GFP	Thermo Fisher Scientific	A-11121	Tinción IHQ de CD31, concentración final 0,0016 mg/mL
Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra, Alexa 647	Life Technologies	a21244	Tinción de IHC, concentración final 0,004 mg/mL
Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra, Alexa 488	Life Technologies	a11008	Tinción de IHC, concentración final 0,004 mg/mL
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10567-014	Para cultivo celular
FBS	Thermo Fisher Scientific	10437028
Anticuerpo bloqueador de integrina beta3	BD Biosciences		553343 Clon 2C9. G2, concentración final 0,02 mg/mL
Colagenasa	Worthington Biochemical Corp	44H14977A	Para la digestión de la aorta
Elastase	Worthington Biochemical Corp	34K15139	Para la digestión de la aorta
Antibiótico-antimicótico (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
FGF humano recombinante	Promega	G5071
Recombinante EGF humano	Promega	G5021
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Anfotericina B	Thermo Fisher Scientific 15290026
Placas de cultivo de tejidos		Minibomba
Alzet	Durect Corporation	2001
ECLIPSE 80i Vertical Microscopio fluorescente	Nikon
TCS  SP5	Sónico Leica
Branson 450	ratones VWR
Myh11-CreERT2	El laboratorio Jackson	19079
		Acta2-CreERT2	Obtenidos del laboratorio del Dr. Pierre Chambon y Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2	El Laboratorio Jackson	8463
ratones ROSA26R(mTmG/mTmG)	El Laboratorio Jackson
ROSA26R(EYFP/EYFP)	ratones El Laboratorio Jackson	006148
ROSA26R(Confeti/Confeti) ratones	El Laboratorio Jackson	13731
ROSA26R(Rb/Rb)	ratones Laboratorio del Dr. Irv Weissman		Obtenido del laboratorio del Dr. Irv Weissman