Aquí, presentamos un protocolo para la imagen en vivo de la fusión del paladar secundario de ratón mediante microscopía confocal. Este protocolo puede usarse en combinación con una variedad de líneas de ratón fluorescentes de reportero, y con inhibidores de vía para una visión mecánica. Este protocolo puede ser adaptado para imágenes en vivo en otros sistemas de desarrollo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
La fusión de los estantes palatales secundarios para formar el paladar secundario intacto es un proceso clave en el desarrollo de los mamíferos y su alteración puede conducir a la hendidura del paladar secundario, una anomalía congénita común en los seres humanos. La fusión del paladar secundario ha sido ampliamente estudiada conduciendo a varios mecanismos celulares propuestos que pueden mediar en este proceso. Sin embargo, estos estudios se han realizado principalmente en tejidos embrionarios fijos en puntos de tiempo progresivos durante el desarrollo o en cultivos de explantes fijos analizados en puntos de tiempo estáticos. El análisis estático es limitado para el análisis de los procesos morfogenéticos dinámicos tales como una fusión del paladar y qué tipos de comportamientos celulares dinámicos median en la fusión palatal se entiende incompletamente. Aquí se describe un protocolo para la imagen en vivo de fusión de paladar secundario ex vivo en embriones de ratón. Para examinar los comportamientos celulares de la fusión del paladar, Keratin14 -cre específico epitelial se utilizó para etiquetar las células epiteliales del paladar en ROSEmbriones reporter flox A26-mTmG. Para visualizar la actina filamentosa, se utilizaron ratones reporteros Lifeact-mRFPruby . La imagen en vivo de la fusión del paladar secundario se realizó mediante la disección de estanterías palatales secundarias recientemente adheridas de embriones embrionarios de día (E) 14.5 y el cultivo en medios que contenían agarosa en un plato inferior de vidrio para permitir la formación de imágenes con un microscopio confocal invertido. Usando este método, hemos detectado una variedad de nuevos comportamientos celulares durante la fusión palatina secundaria. Una apreciación de cómo distintos comportamientos celulares se coordinan en el espacio y el tiempo contribuye en gran medida a nuestra comprensión de este proceso dinámico morfogenético. Este protocolo se puede aplicar a líneas de ratones mutantes, o cultivos tratados con inhibidores farmacológicos para avanzar en la comprensión de cómo se controla la fusión de paladar secundaria.
Introducción
La fusión de tejidos es un paso importante en el desarrollo de múltiples órganos. Los principales defectos de nacimiento humanos, tales como labio leporino y paladar hendido, espina bífida y malformaciones del corazón pueden ser resultado de defectos en la fusión de tejidos 1 . La fusión del paladar secundario del ratón ha sido ampliamente estudiada para identificar los mecanismos celulares y moleculares que controlan la fusión de tejidos en el desarrollo 2 , 3 , 4 . En el ratón, el desarrollo del paladar secundario comienza alrededor de E11.5 con el ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos de la Universidad de California en San Francisco Cuidado de Animales institucional y Comité de Uso.
1. Preparación de medios de imagen en vivo
- Preparación de medios de cultivo líquidos
- Añadir 20% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mu g / ml de estreptomicina, 200 mu g / ml de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium medios de comunicación.
NOTA: Los medios de imagen en vivo se han fabricado justo antes de la obtención de imágenes. Este med....
- Añadir 20% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mu g / ml de estreptomicina, 200 mu g / ml de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium medios de comunicación.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La visualización en vivo del cultivo de explantes de paladar reveló múltiples procesos celulares que median la fusión del paladar 6 . Los contactos iniciales entre dos células epiteliales se hacen por protrusiones de membrana ( Figura 2 B-2E ). Cuando dos capas epiteliales se encuentran, forman una MES multicelular, seguida de intercalación para formar una MES de capa celular integrada a través de la convergencia epit.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Imágenes en vivo de la morfogénesis del tejido con el cultivo de explante de órganos 3D puede proporcionar información detallada sobre los procesos celulares que no se puede mostrar en el análisis de tinción convencional de secciones de tejido fijo. Utilizando cultivo de explantes in vitro de paladar secundario embrionario de ratón, se observaron varios comportamientos celulares interesantes que nos llevaron a proponer un nuevo mecanismo de fusión del paladar que implica la convergencia epitelial y la extrusión.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias al Sr. Douglas Benson para las conversaciones iniciales con respecto a la imagen secundaria del paladar. También reconocemos a David Castaneda-Castellanos (Leica) y Chris Rieken (Zeiss) por su ayuda para ajustar las condiciones de imagen en microscopía confocal. Agradecemos a Lynsey Hamilton (Bitplane) por sugerencias útiles para el análisis cuantitativo de imágenes usando el software Imaris. Este trabajo fue financiado por NIH / NIDCR R01 DE025887.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| DMEM/F12 | Tecnología Life | 11330-032 | |
| Suero fetal bovino | Tecnología Life | 16000-044 | |
| L-glutamina | Tecnología Life | 25030-081 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A4544-100G | |
| Penicilina/Estreptomicina | Life technology | 15140-122 | |
| Agarosa de bajo punto de fusión | BioExpress | E-3111-125 | |
| Plato con fondo de vidrio de 35 mm | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Vaselina (Vaselina) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Ratones | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Alelo = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Alelo = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscopio | |||
| White Light Microscopio confocal SP5 | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer | Microscopía |
Referencias
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birt....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
