Se cree que las bacteriocinas juegan un papel clave en la definición de la diversidad microbiana en diferentes nichos ecológicos. Aquí, describimos un procedimiento eficiente para evaluar cómo bacteriocinas afectan la composición microbiota intestinal en un modelo animal.
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Artículo de método
Un método para evaluar los efectos de bacteriocinas en la microbiota intestinal de ratones
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Se plantean preguntas muy intrigantes con nuestro avance en el conocimiento sobre la composición de la microbiota intestinal y su relación con la salud, particularmente en relación con los factores que contribuyen al mantenimiento del equilibrio poblacional. Sin embargo, existen limitadas metodologías disponibles para evaluar estos factores. Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos producidos por muchas bacterias que pueden conferir una ventaja competitiva para la adquisición de alimentos y / o establecimiento de nichos. Muchas cepas de bacterias probióticas de ácido láctico (LAB) tienen un gran potencial para promover la salud humana y animal al prevenir el crecimiento de patógenos. También pueden utilizarse para la inmunomodulación, ya que producen bacteriocinas. Sin embargo, la actividad antagonista de las bacteriocinas se determina normalmente mediante bioensayos de laboratorio en condiciones bien definidas pero sobre simplificadas en comparación con el complejo ambiente intestinal en seres humanos y animales, donde las bacterias se enfrentan a influencias multifactoriales del huésped y cientos de especies microbianasCompartiendo el mismo nicho. Este trabajo describe un procedimiento completo y eficiente para evaluar el efecto De una variedad de bacteriocinas con diferentes especificidades de blanco en un sistema murino. Los cambios en la composición de la microbiota durante el tratamiento con bacteriocina se monitorean usando secuenciación de ADNr 16S de composición. Nuestro enfoque utiliza tanto los productores de bacteriocina como sus mutantes isogénicos no productores de bacteriocinas, este último dando la capacidad de distinguir bacteriocinas relacionadas con las modificaciones no relacionadas con la bacteriocina de la microbiota. La extracción de ADN fecal y los métodos de secuenciación del 16S rDNA son consistentes y, junto con la bioinformática, constituyen un potente procedimiento para detectar cambios débiles en los perfiles bacterianos y establecer correlaciones entre las poblaciones bacterianas y los marcadores de salud en términos de concentración de colesterol y triglicéridos. Nuestro protocolo es genérico y por lo tanto puede utilizarse para estudiar otros compuestos o nutrientes con el potencial de alterar el mic anfitriónRobiota, ya sea al estudiar la toxicidad o los efectos beneficiosos.
Introducción
Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos producidos por una amplia gama de especies bacterianas 1 , 2 . Estos compuestos y sus productores, especialmente LAB, han sido explorados y explotados en todo el mundo durante décadas para sus aplicaciones potenciales en la preservación de los alimentos y la medicina 3 . Se conocen varias bacteriocinas para matar patógenos importantes, incluyendo especies de Listeria, Enterococcus, Staphylococcus y Bacillus . Algunas bacteriocinas incluso tienen la capacidad de modular la respuesta inmune 4 . Mucha....
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Protocolo
El cuidado y manipulación deben llevarse a cabo en una unidad especializada de cuidado de animales. Los procedimientos aquí descritos fueron aprobados por el Comité de Ética correspondiente de la Universidad de Valencia y las autoridades locales, siguiendo los principios de cuidado de animales de laboratorio obligatorio por la Ley de la Unión Europea y 2010/63 / UE y el Gobierno español RD 53/2013 sobre protección de animales Utilizados para fines científicos, con el fin de respetar el principio 3R en la experimentación animal (Reemplazo, Reducción, Refinamiento).
1. Culturas bacterianas congeladas utilizadas para inocular ratones
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Resultados
La producción de bacteriocinas ha sido considerada como una característica probiótica positiva en LAB, ya que se supuso que previene el crecimiento de bacterias y patógenos oportunistas. El objetivo de este trabajo fue mostrar la capacidad de las bacteriocinas para modular las poblaciones de microbiota intestinal en un modelo de ratón. Para ello, se desarrolló un procedimiento para comparar el efecto de la ingesta de cepas productoras de bacteriocina y sus cepas isogénicas no productoras.......
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Discusión
El procedimiento descrito aquí se ha utilizado para determinar si los cambios en la microbiota están ligados a la salud o la edad. Diferentes partes del protocolo son importantes, pero entre ellas, el muestreo de las heces, la elección del fragmento de ADN a ser secuenciado y analizado, y la realización de la extracción de ADN y el análisis bioinformático podría ser sin duda los puntos más críticos. El muestreo es crucial porque, por razones éticas, los ratones no deben ser subrayados y porque se sabe que cambia la prop.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Subvención de la AEMA NILS Ciencia y Movilidad Coordinada de Sostenibilidad de Investigadores (referencia 017-ABEL-CM-2013). CB y GP-M. Fueron apoyados por la subvención AGL2015-70487-P del Ministerio de Economía y Competitividad. OCOU y DBD fueron apoyados por un programa estratégico de la beca para la investigación de la ciencia del alimento de la universidad noruega de las ciencias de la vida (NMBU) (proyecto 1205051025). También queremos agradecer a Inmaculada Noguera por su ayuda en el cuidado de los animales y el muestreo y por Jesús Dehesa por su ayuda para asegurar la disponibilidad de materiales de laboratorio en la instalac....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones Balb/c (hembra) | Los ratones Harlan | deben tener entre 6 y 8 semanas de edad Placa de | |
| Petri de plástico | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Caldo de infusión cerebro-corazón | Conda | 1400.00 | |
| Agar bacteriológico europeo | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarosa D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x Tampón TAE | Thermo Scientific | 15558042 | |
| Caldo MRS | Difco | 288130 | |
| PBS comprimidos | Sigma | P4417-100TAB | |
| báscula | Mettler Toledo | PB602-S | |
| pinza estéril | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5424 | |
| Centrífuga | Hermle | Z383K | |
| cloruro de sodio | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, España | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Etanol AppliChem Panreac | 131086.1214 | ||
| Qubit fluorómetro | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Kit de ensayo | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, EE. UU | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta Kit de cuantificación de bibliotecas NGS | Quanta BioSciences, Maryland, EE. UU | 733-2300 | |
| Kit de reactivos MiSeq v3 | Illumina, San Diego, California, EE. UU. | MS-102-3003 | |
| Primers para la amplificación | Los cebadores contienen la región V3-V4 del gen bacteriano 16S rRNA y los adaptadores de voladizo de Illumina: 5'-TCG TCG GCA GCG GA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3' y 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3' | ||
| Nextera XT Kit | de índices FC-131-1002 | Índices y adaptadores de secuenciación Illumina | |
| Micromortle para tubos de 1,5 mL, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Perlas de vidrio, 0,1 mm de diámetro | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel y PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolisina | Sigma | M9901-10KU | |
| lisozima | Roche | 10837059001 | |
| proteinasa K | Roche | 3115887001 | |
| ARNasa A | Sigma | R4875 |
Referencias
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54
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Reimpresiones y permisos
