Artículo de método

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

DOI:

10.3791/56063

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9 de agosto de 2017

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1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

En este artículo

Resumen

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En proyección de imagen es una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento celular en tiempo real. Aquí, describimos un protocolo para Time-lapse vídeo-microscopía de células de la corteza cerebral primaria que permite un examen detallado de las fases promulgadas durante la progresión del linaje de las células madre neurales primarias diferenciadas neuronas y glia.

Resumen

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Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las células progenitoras someterse a varias rondas de divisiones celulares simétricas y asimétricas para generar nuevos progenitores o neuronas postmitotic. Más tarde, algunos progenitores cambiar a una suerte de gliogenic, añadiendo a las poblaciones de astrositos y oligodendrocyte. Usando Time-lapse vídeo-microscopía de cultivos de células de la corteza cerebral primaria, es posible estudiar los mecanismos celulares y moleculares que controlan el modo de la división celular y parámetros de ciclo celular de células progenitoras. Del mismo modo, el destino de postmitotic células puede ser examinado usando reportero fluorescente específica de la célula proteínas o proyección de imagen la inmunocitoquímica. Más importante aún, todas estas características pueden ser analizadas a nivel unicelular, permitiendo la identificación de progenitores comprometidos con la generación de tipos celulares específicos. Manipulación de expresión génica puede realizarse también mediante transfección viral mediada, lo que permite el estudio de fenómenos celulares autónomos y célula autónoma. Finalmente, el uso de proteínas fluorescentes de fusión permite el estudio de la distribución simétrica y asimétrica de las proteínas durante la división y la correlación con el destino de las células hijas. Aquí, describimos el método de microscopia video Time-lapse para primaria corteza cerebral células murinas para hasta varios días de la imagen y analizar el modo de división celular, duración del ciclo celular y destino de las células recién generadas. También describimos un método simple para transfectar las células progenitoras, que pueden aplicarse para manipular genes de interés o simplemente etiquetar las células con proteínas de reportero.

Introducción

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Las células madre neurales (NSC) generan neuronas y células macroglial durante el desarrollo de la corteza cerebral. En principios corticogenesis, NSCs someterse a varias rondas de división simétrica de la célula y amplían las progenitoras. Entonces, NSCs dividen asimétricamente para generar las neuronas directamente o indirectamente a través de productos intermedios1. Sólo en medio - al final-corticogenesis, progenitores cambiar para generar astrocitos y oligodendrocitos2,3,4. Sin embargo, los mecanismos de información que controlan la proliferación c....

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales vivos descritos en este protocolo se realizan de acuerdo con las leyes nacionales e internacionales y fueron aprobados por el Comité Universitario de Cuidado y Uso de Animales (CEUA/UFRN) local, bajo la licencia 009/2014. El siguiente protocolo se realiza en un entorno estéril. Se espera estar familiarizado con el cultivo celular básico.

1. Microdisección telencéfalo dorsolateral

  1. Prepare el medio de disección (100 mL): 98,5 mL de solución salina balanceada de Hank (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL y 10.000 μg/mL).
  2. Filtrar-esteriliz....

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Resultados

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Los cultivos primarios de células de la corteza cerebral aisladas de embriones E14 contienen tanto células progenitoras como neuronales. Durante el período de obtención de imágenes, los progenitores se someten a varias rondas de división celular, aumentando el número de células (Figura 5 y Video Figura 1).

La transfección mediada por retrovirales de unas pocas células progenitoras f.......

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Discusión

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Observación en tiempo real de las células de la corteza cerebral primaria permite el análisis de la proliferación celular, el modo de división celular, duración del ciclo celular, diferenciación celular y la célula de supervivencia3,14,15,37. Lo más importante, permite el estudio de los linajes de unicelulares, conduce a la identificación de las fases intermedias promulgada durante la progresió.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), cabos (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) y FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa Rio Grande do Norte).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Penicilina/estreptomicinaGibco15140122
Dulbecco Medio de águila modificado (DMEM)Gibco12400-024
Suero fetal para terneros (FCS)Gibco10437028
GlucosaGibcoA2494001
B27Gibco17504044
tripsina-EDTA (0,05%)Gibco25300054
Paraformaldehído Sigma16005
Suero de cabraSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
IsofluranoSigma792632
anti-MAP2, ratónSigmaM4403
anti-GFP polloAves0511FP12
DAPISigmaD9542
cabra anti-ratón alexa 594InvitrogenA11005
Cabra anti-pollo alexa 488InvitrogenA11039
ImageJNIH
tTtETH Zurich
Microscopio de observación celularZeiss
Pasteur pipeta
PBS
The Tracking Tool (tTt) softwarehttps://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.htmlenlace de descarga

Referencias

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  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 3....

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Videomicroscop a de lapso de tiempoan lisis de la divisi n celularlongitud del ciclo celulardestino de las c lulas progenitorastransfecci n mediada por virusprote nas reporteras fluorescentesdivisi n sim trica y asim tricaan lisis a nivel de c lula nicac lulas madre neurales

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