Artículo de método

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

DOI:

10.3791/56063

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9 de agosto de 2017

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1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

En este artículo

Resumen

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En proyección de imagen es una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento celular en tiempo real. Aquí, describimos un protocolo para Time-lapse vídeo-microscopía de células de la corteza cerebral primaria que permite un examen detallado de las fases promulgadas durante la progresión del linaje de las células madre neurales primarias diferenciadas neuronas y glia.

Resumen

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Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las células progenitoras someterse a varias rondas de divisiones celulares simétricas y asimétricas para generar nuevos progenitores o neuronas postmitotic. Más tarde, algunos progenitores cambiar a una suerte de gliogenic, añadiendo a las poblaciones de astrositos y oligodendrocyte. Usando Time-lapse vídeo-microscopía de cultivos de células de la corteza cerebral primaria, es posible estudiar los mecanismos celulares y moleculares que controlan el modo de la división celular y parámetros de ciclo celular de células progenitoras. Del mismo modo, el destino de postmitotic células puede ser examinado usando reportero fluorescente específica de la célula proteínas o proyección de imagen la inmunocitoquímica. Más importante aún, todas estas características pueden ser analizadas a nivel unicelular, permitiendo la identificación de progenitores comprometidos con la generación de tipos celulares específicos. Manipulación de expresión génica puede realizarse también mediante transfección viral mediada, lo que permite el estudio de fenómenos celulares autónomos y célula autónoma. Finalmente, el uso de proteínas fluorescentes de fusión permite el estudio de la distribución simétrica y asimétrica de las proteínas durante la división y la correlación con el destino de las células hijas. Aquí, describimos el método de microscopia video Time-lapse para primaria corteza cerebral células murinas para hasta varios días de la imagen y analizar el modo de división celular, duración del ciclo celular y destino de las células recién generadas. También describimos un método simple para transfectar las células progenitoras, que pueden aplicarse para manipular genes de interés o simplemente etiquetar las células con proteínas de reportero.

Introducción

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Las células madre neurales (NSC) generan neuronas y células macroglial durante el desarrollo de la corteza cerebral. En principios corticogenesis, NSCs someterse a varias rondas de división simétrica de la célula y amplían las progenitoras. Entonces, NSCs dividen asimétricamente para generar las neuronas directamente o indirectamente a través de productos intermedios1. Sólo en medio - al final-corticogenesis, progenitores cambiar para generar astrocitos y oligodendrocitos2,3,4. Sin embargo, los mecanismos de información que controlan la proliferación celular y diferenciación, así como la contribución de los progenitores sino restringida a la generación de tipos singulares de neuronas o células macroglial siguen siendo un asunto de intenso debate4,5,6. El potencial de generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos de NSCs corticales individuales ha sido extensivamente estudiado en vitro y en vivo con una gran variedad de técnicas tales como: vivir en culturas de célula de solo7,8,9,10,11,12,la13; en vivo imágenes de alta densidad culturas culturas3,14,15; en vivo imagen en rebanada culturas16,17,18; Análisis clonal con viral mediada por vectores genéticos etiquetado en culturas de alta densidad14,15,19,20,21; Análisis clonal en vivo utilizando retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; y análisis clonal en vivo mediante animales transgénicos34.

Cada una de estas técnicas presenta ventajas y desventajas. Por ejemplo, en vivo calco de linaje es susceptible a los reagrupamientos y división errores3, conduce a conclusiones contradictorias acerca del potencial de los progenitores corticales. Además, tanto estudios in vitro e in vivo basan en el etiquetado de células progenitoras en momentos tempranos y posterior análisis de linajes celulares pueden estar influenciada por la ocurrencia de muerte celular durante la progresión de linaje35. Por lo tanto, un sistema apropiado para analizar el potencial de NSCs solo debe permitir la identificación de todas las células que generan, así como la caracterización apropiada de los sinos de la célula dentro del linaje. Combinación de cultivo celular primaria y la proyección de imagen vivo proporciona esta configuración. Usando sola célula cultura y microscopia video Time-lapse, Templo et al han demostrado el interruptor en el linaje de los progenitores de la corteza cerebral individual de neurogénesis gliogenesis11. Más tarde, utilizaron el mismo sistema para demostrar que se generan diferentes tipos de neuronas de un solo progenitor cortical12. Sin embargo, este sistema presenta una importante salvedad: sólo 1% de progenitores corticales aislados en corticogenesis temprano generar clones de 4 o más progenie9. Después de la adición de FGF2, la frecuencia de las células generadoras de 4 o más células aumenta a 8-10%9. Sin embargo, este número es demasiado pequeño teniendo en cuenta que prácticamente todos los progenitores corticales son proliferativos en esta etapa. Por otra parte, los efectos potenciales de FGF2 en Especificación de destino no se puede descartar de36. Para evitar estas limitaciones, se utilizaron cultivos de células de alta densidad que apoyan la proliferación de ambos ventricular (expresión de Pax6) y subventricular de progenitores cortical (Tbr2-expresando)15. Por otra parte, la observación en tiempo real de estas culturas ha demostrado que varias características de la progresión de linaje del NSC se reproducen en estas condiciones, como modo de división celular, alargamiento del ciclo celular, potencial de las células para generar neuronas y glia, entre otros3,15. Más recientemente, también hemos utilizado este sistema para mostrar que CREB-señalización afecta la supervivencia de la célula de las neuronas de la corteza cerebral inmadura en ratones37. Por lo tanto, creemos que Time-lapse vídeo-microscopía de corteza cerebral murina primaria las células cultivadas en alta densidad es una herramienta poderosa y accesible para el estudio de mecanismos celulares y moleculares de la progresión del ciclo celular, el modo de división celular, supervivencia celular y especificación de destino celular. Este último se puede lograr mediante animales transgénicos, permitiendo la identificación de destinos específicos de la célula en tiempo real38,39,40 o el uso de la proyección de imagen immunocytochemistry3,38,41,42.

Presentamos un protocolo paso a paso para preparar el cultivo de células de la corteza cerebral primaria apoyando la proliferación de NSCs y la subsecuente generación de neuronas y células macroglial. También discutimos el uso de la transfección mediada por retrovirus para manipular la expresión genética de células individuales, que pueden ser identificados y rastreados a nivel unicelular usando microscopia video Time-lapse. Este protocolo se puede utilizar para el estudio de las células de la corteza cerebral primaria aisladas desde el principio hasta el final de la corticogenesis en roedores, pero unos pocos ajustes pueden ser requeridos según la etapa14. NSC aislado de otras fuentes también puede ser estudiada usando microscopia video Time-lapse de culturas 2D, pero el sistema de cultivo adecuado debe determinarse comparando celulares comportamientos in vitro e in vivo38,43.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales vivos descritos en este protocolo se realizan de acuerdo con las leyes nacionales e internacionales y fueron aprobados por el Comité Universitario de Cuidado y Uso de Animales (CEUA/UFRN) local, bajo la licencia 009/2014. El siguiente protocolo se realiza en un entorno estéril. Se espera estar familiarizado con el cultivo celular básico.

1. Microdisección telencéfalo dorsolateral

  1. Prepare el medio de disección (100 mL): 98,5 mL de solución salina balanceada de Hank (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL y 10.000 μg/mL).
  2. Filtrar-esterilizar el medio de disección.
  3. Extracción de embriones de día 14 (E14) de una ratón embarazada C57/Bl6 (Mus musculus) bajo anestesia con isoflurano.
    NOTA: Considere E0 como el día de la detección del tapón vaginal. La disección debe completarse a más tardar 1 h después de la extracción de la rata preñada. Este protocolo también se aplica a los embriones E11-E17.
  4. Extraer los embriones mediante histerectomía en condiciones estériles.
  5. Transfiera los embriones a una placa de Petri con medio de disección frío (4 °C).
  6. Extrae los sesos del cráneo cortando a lo largo de la fisura longitudinal. El número de embriones suele variar de cinco a diez. Cada cerebro E14 produce aproximadamente 2 x 106 células, incluidos los progenitores y las neuronas postmitóticas (relación 1:1)
    NOTA: Utilice el microscopio estereoscópico para los siguientes pasos.
  7. Retire las meninges con pinzas de disección. Divide el telencéfalo por la mitad para separar los hemisferios. Para aislar el telencéfalo dorsolateral, corte a lo largo de la curva dorsomedial y el límite palial-subpalial con pinzas de disección. Transfiera el telencéfalo dorsolateral a un tubo de 2 mL con medio de disección frío (4 °C) hasta que se disecen todos los cerebros.

2. Disociación celular y enchapado

  1. Prepare el medio de proliferación (50 mL de DMEM+10% FCS): 44 mL de Medio de Águila Modificado con Dulbecco (DMEM), 5 mL de Suero Fetal para Terneros (FCS), 0,5 mL de glucosa al 40%, 0,5 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL y 10.000 μg/mL). Filtrar-esterilizar el medio de proliferación.
  2. Prepare el medio de diferenciación (50 mL de DMEM+2% B27): 48 mL de DMEM, 1 mL de B27, 0,5 mL de glucosa al 40%, 0,5 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL y 10.000 μg/mL). Filtrar-esterilizar el medio de diferenciación.
  3. Después de la microdisección del telencéfalo dorsolateral de ratones E14, centrifugar el tubo con el tejido recolectado y el medio de disección frío (durante 5 min a 4 °C, 340 x g) para precipitar el tejido.
  4. Retirar el sobrenadante con una pipeta y añadir 1 mL de tripsina-EDTA (0,05%) precalentado (37 °C) para la digestión química. Incubar durante 15 min a 37 °C. Añadir 2 mL de medio de proliferación para detener la actividad de la tripsina.
  5. Pula la punta de una pipeta Pasteur de vidrio sobre un quemador de gas o un mechero Bunsen durante unos segundos para estrechar ligeramente la abertura. Lave la pipeta aspirando FCS para recubrir la punta. Evitando burbujas, disocie mecánicamente las células con una pipeta Pasteur pulida al fuego y recubierta de FCS.
  6. Centrifugar las células (durante 5 min a 4 °C, 340 x g). Retire el sobrenadante con una pipeta. Añadir 1 mL de medio de proliferación y resuspender las células con una pipeta. Repita este paso una vez.
  7. Prepare una dilución 1:1 de la suspensión celular utilizando una solución de azul de tripano al 0,4%. Las células no viables serán azules. Cuente el número de células viables (sin teñir) utilizando una cámara de Neubauer.
  8. Diluir las células en medio de proliferación para obtener 106 células/mL. Añadir 500 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (aproximadamente 2,5 × 105 células/cm2). Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2.
    NOTA: No utilice cubreobjetos de vidrio, ya que pueden moverse durante el experimento y cambiar el campo de observación. Alternativamente, use placas de cultivo de tejidos con fondo de vidrio.
    NOTA: Si no está utilizando placas multiplato tratadas con cultivo celular, es importante tratar previamente sus placas con Poly-D-Lysin (50 μg/ml) 2 h a 37 °C. Las placas tratadas con PDL se pueden almacenar a 4 °C después de lavarlas con agua destilada.

3. Transfección mediada por retrovirales

NOTA: Este es un método simple para transfectar solo células progenitoras. Sin embargo, se pueden utilizar otros vectores virales o la transfección química/eléctrica para insertar genes de interés en células cultivadas.

  1. Para manipular la expresión génica y marcar las células con proteínas reporteras fluorescentes, agregue retrovirus portadores de plásmidos con genes de interés 2 h después de la siembra celular.
    NOTA: Los vectores retrovirales solo se integran en el genoma de las células en división. Por lo tanto, es importante infectar las células cuando la proliferación es alta.
    NOTA: Utilizamos un plásmido que contiene la secuencia de fusión Beta-actina/CMV (CAG) y un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) seguido de la secuencia codificante para la proteína fluorescente verde (GFP), designada pCAG-IRES-GFP44. Los genes de interés podrían clonarse entre el promotor CAG y la secuencia IRES37.
  2. Diluir el retrovirus en medio de diferenciación para obtener el número deseado de partículas por mL. Añadir 500 μL de medio de diferenciación con retrovirus a cada pocillo.
    NOTA: La cantidad de retrovirus utilizados depende de su título y debe calcularse para obtener de 50 a 100 células infectadas por pocillo. Este título permite la identificación de clones aislados que expresan GFP, cuya relación puede confirmarse aún más mediante el seguimiento de imágenes de contraste de fase (ver sección 6). La valoración del retrovirus debe realizarse utilizando la misma población de células45.

4. Lapso de tiempo Videomicroscopía

NOTA: Este paso requiere un microscopio de fluorescencia invertida con cámara de incubación (ver Tabla de Materiales).

  1. Después de la infección por retrovirus, coloque la placa de cultivo de tejidos en una incubadora conectada a los controladores de temperatura y CO2.
    NOTA: El precalentamiento de la cámara durante 3 h antes de comenzar la obtención de imágenes podría ayudar a minimizar la deriva y el desenfoque durante la adquisición><. NOTA: La cámara debe mantener las celdas en condiciones constantes de 37 °C y 5% de CO2.
  2. Seleccione una posición en el eje XY para que actúe como punto cero (XY = 0). Esto permitirá una referencia para encontrar las posiciones de nuevo en el futuro, por ejemplo, después de la inmunocitoquímica posterior a la imagen (ver sección 5).
    NOTA: Es recomendable dibujar un signo en la placa que pueda usarse como referencia para determinar el punto cero.
  3. Seleccione las posiciones que se van a visualizar con un aumento de 10X.
    NOTA: Seleccione de 10 a 15 posiciones por pocillo para aumentar la probabilidad de observar células transfectadas retroviralmente.
    NOTA: Los objetivos de gran aumento a larga distancia (20X o 40X) se pueden utilizar para obtener imágenes de mayor resolución. Dependiendo de la distancia de trabajo de los objetivos, es posible que se requieran placas con fondo de vidrio.
  4. Adquiera imágenes de contraste de fase cada 5 minutos e imágenes de fluorescencia cada 3 horas para disminuir la fototoxicidad. Verifique y ajuste el enfoque en las primeras 3 h del experimento, ya que puede cambiar mientras la temperatura se equilibra. Compruebe y ajuste el enfoque diariamente.
    NOTA: Observamos que el enfoque se estabiliza después de las primeras 24 h. Sin embargo, es aconsejable controlar el enfoque y, alternativamente, utilizar un sistema de enfoque automático basado en software.
  5. Después de 7 días, se detenga la adquisición y se proceda a la inmunocitoquímica posterior a la imagen (ver sección 5).
  6. Después de la inmunocitoquímica, vuelva a colocar la placa en la incubadora del microscopio, encuentre el punto cero, reinicie XYZ = 0 y vuelva a cargar el experimento con las posiciones guardadas. Adquiera las imágenes de fluorescencia de cada posición utilizando los filtros de fluorescencia adecuados.

5. Inmunocitoquímica post-imagen

  1. Después de 7 días en cultivo, fije el cultivo celular con fijador de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y debe manipularse en una campana de gases químicos.
  2. Enjuague con 0.5 mL PBS 0.1 M durante 5 min. Repita 3 veces.
  3. Incubar en anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C en tritón al 0,5% y al 10% del suero normal de cabra en PBS 0,1 M.
    NOTA: Utilice el anticuerpo anti-proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2) para confirmar el fenotipo neuronal (IgG1 de ratón, 1:1.000) y anti-GFP para marcar las células transducidas (anticuerpo de pollo, 1:500). Se pueden usar otros anticuerpos para detectar células progenitoras o gliales.
  4. Enjuague con 0.5 mL PBS 0.1 M durante 5 min. Repita 3 veces.
  5. Diluir los anticuerpos secundarios en tritón al 0,5% y el 10% de suero normal de cabra en PBS 0,1 M e incubar durante 2 h a temperatura ambiente. Dilución recomendada: 1:1.000.
  6. Enjuague con 0.5 mL PBS 0.1 M durante 5 min. Repita 3 veces.
  7. Para la tinción de núcleos, incubar las células durante 5 min con 0,1 μg/mL de 4′6′-diamino-2-fenilindona (DAPI) en PBS 0,1 M.
  8. Enjuague con 0.5 mL PBS 0.1 M durante 5 min. Repita 3 veces.
  9. Mantenga las celdas en PBS 0.1 M y protéjalas de la luz (por ejemplo, envuelva la placa con papel de aluminio).

6. Seguimiento celular

NOTA: Aquí, describimos brevemente los pasos principales para analizar datos de microscopía de video lapso de tiempo utilizando el software The Tracking Tool (tTt), que está disponible en el enlace proporcionado en la Tabla de Materiales.

NOTA: Si la adquisición de imágenes se realiza con otro software, importe los datos de imagen con tTt Converter disponible en el instalador de tTt (enlace proporcionado en la Tabla de Materiales). Solo se aceptan formatos de imagen png, tif o jpg. Siga los pasos que se muestran en Figura 1 A - B después de iniciar el convertidor tTt.

  1. Inicie el software tTt y elija un nombre de usuario. Haga clic en el botón "agregar usuario" y "continuar" (Figura 2A). Busque y seleccione la "TTTWorkFolder" (Figura 2B). Los árboles de linajes, las estadísticas y las imágenes exportadas se guardarán en esta carpeta. A continuación, seleccione el experimento que se va a analizar y cárguelo (Figura 2B).
  2. Si las imágenes fueron convertidas previamente por tTt Converter, haga clic en "LogFileConverter" (Figura 3A) y especifique el número de segundos entre dos puntos de tiempo consecutivos en la ventana de LogFileConverter. Haga clic en "Convertir archivos de registro para todo el experimento" (Figura 1C).
  3. En una lista de imágenes, que aparecen en la ventana de tTt, seleccione las imágenes deseadas que se carguen manualmente o utilizando la opción que se muestra en el programa. Cargar imágenes (Figura 3).
  4. Seleccione Archivo > Abrir > nueva colonia. Haga clic en "Seguimiento", seguido de "Iniciar seguimiento" para iniciar el seguimiento en la posición elegida.
  5. Aparecerá una ventana de película (Figura 4). Seleccione la celda usando el círculo de seguimiento y presione la tecla 0. El software pasará al siguiente fotograma. Mantenga la posición del círculo de seguimiento alrededor de la celda rastreada con el mouse y haga clic en 0 en cada fotograma para agregar una marca de seguimiento en la celda.
  6. Utilice las teclas 1 y 3 para pasar al fotograma anterior o siguiente, respectivamente. Para eliminar una marca de pista, simplemente haga clic en la posición correcta para marcar y presione 0.
  7. Si la celda está dividida, seleccione el botón "división" (rectángulo rojo en Figura 4). Continúe rastreando una celda secundaria presionando Mayús+D. Para realizar un seguimiento de la segunda celda secundaria, selecciónela en el editor de celdas y presione F2.
  8. Si la célula murió durante la microscopía de video, seleccione "apoptosis" (rectángulo azul en Figura 4).
    NOTA: Aunque el software etiqueta el evento como "apoptosis", otros mecanismos pueden ser responsables de la muerte celular.
  9. Si la célula abandona el campo de observación o se entremezcla con las células vecinas impidiendo el seguimiento, seleccione "perdido" (rectángulo verde en Figura 4).
  10. Para detener el seguimiento y continuar más tarde, haga clic en "interrumpir" (rectángulo púrpura en Figura 4).
    NOTA: En la ventana del editor de celdas se generará un árbol durante el seguimiento. Para guardar el árbol de linaje, seleccione Archivo > Guardar > árbol actual (en la ventana Editor de celdas).
  11. Para comenzar a rastrear una celda diferente, haga clic en la celda con el botón derecho del mouse o seleccione la celda con el botón izquierdo del mouse y haga clic en Seguimiento > Comenzar a rastrear.
  12. Para exportar la película con los datos de seguimiento, el software no debe estar en "modo de seguimiento". Para desactivar el modo de seguimiento, ejecute el paso 6.10. En la ventana Película, seleccione Exportar > película. Configura el formato, el rango de fotogramas, el número de fotogramas por segundo y la tasa de bits. Haga clic en "Iniciar exportación".

7. Cuantificaciones

NOTA: Se pueden realizar varias mediciones utilizando datos de microscopía de vídeo46. Aquí, describimos tres posibilidades que se ejemplifican más adelante en la sección de "resultados representativos".

  1. Cuantifique la supervivencia celular para cada linaje celular dividiendo el número de células vivas en diferentes puntos de tiempo por el número total de células generadas antes de que se alcanzaran estos puntos de tiempo dentro de clones individuales37.
  2. Cuantifique la proporción de progenitora simétrica (SP, ambas células hijas continúan proliferando), asimétrica (A, una célula hija continúa proliferando y la otra se vuelve postmitótica) o terminal simétrica (ST, ambas células hijas se vuelven postmitóticas)15,38.
  3. Mide la duración del ciclo celular calculando el lapso de tiempo de las células en proliferación entre su generación y división15.

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Resultados

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Los cultivos primarios de células de la corteza cerebral aisladas de embriones E14 contienen tanto células progenitoras como neuronales. Durante el período de obtención de imágenes, los progenitores se someten a varias rondas de división celular, aumentando el número de células (Figura 5 y Video Figura 1).

La transfección mediada por retrovirales de unas pocas células progenitoras f...

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Discusión

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Observación en tiempo real de las células de la corteza cerebral primaria permite el análisis de la proliferación celular, el modo de división celular, duración del ciclo celular, diferenciación celular y la célula de supervivencia3,14,15,37. Lo más importante, permite el estudio de los linajes de unicelulares, conduce a la identificación de las fases intermedias promulgada durante la progresió...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), cabos (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) y FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa Rio Grande do Norte).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Penicilina/estreptomicinaGibco15140122
Dulbecco Medio de águila modificado (DMEM)Gibco12400-024
Suero fetal para terneros (FCS)Gibco10437028
GlucosaGibcoA2494001
B27Gibco17504044
tripsina-EDTA (0,05%)Gibco25300054
Paraformaldehído Sigma16005
Suero de cabraSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
IsofluranoSigma792632
anti-MAP2, ratónSigmaM4403
anti-GFP polloAves0511FP12
DAPISigmaD9542
cabra anti-ratón alexa 594InvitrogenA11005
Cabra anti-pollo alexa 488InvitrogenA11039
ImageJNIH
tTtETH Zurich
Microscopio de observación celularZeiss
Pasteur pipeta
PBS
The Tracking Tool (tTt) softwarehttps://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.htmlenlace de descarga

Referencias

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  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449(2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76(2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

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