Method Article

Proyección de alto rendimiento para la herencia basados en proteína en S. cerevisiae

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe una metodología de alto rendimiento para funcionalmente basados en proteína herencia en S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La codificación de la información biológica que es accesible a las generaciones futuras se obtiene generalmente mediante cambios en la secuencia de ADN. Herencia longeva codificada en proteínas conformación (en lugar de secuencia) durante mucho tiempo ha sido visto como cambio de paradigma pero rara. Los mejores ejemplos de tales elementos epigenéticos caracterizados son los priones, que poseen un comportamiento uno mismo-montaje que puede conducir la manifestación hereditaria de fenotipos nuevos. Muchos priones arquetípicos mostrar un sesgo de secuencia impactante de N/Q-rico y montan en un doblez amiloideo. Estas características inusuales han informado de más esfuerzos de investigación para identificar nuevas proteínas del prión. Sin embargo, por lo menos tres priones conocidos (incluyendo el fundador del prión, PrPSc) no albergan estas características bioquímicas. Por lo tanto, desarrollamos un método alternativo para probar el alcance de la herencia basados en proteínas, basada en una propiedad de la acción de masas: la sobreexpresión transitoria de las proteínas del prión aumenta la frecuencia en que adquieren una conformación de plantillas de uno mismo. Este artículo describe un método para el análisis de la capacidad de la levadura ORFeome para obtener la herencia basados en proteínas. Usando esta estrategia, hemos encontrado que > 1% de proteínas de levadura podrían impulsar la aparición de rasgos biológicos que duradero, estable y se presentó con mayor frecuencia que la mutación genética. Este enfoque puede ser empleado en alto rendimiento en todo ORFeomes o como un paradigma de proyección específica para redes genéticas específicas o estímulos ambientales. Como pantallas genéticas adelantados definen numerosas vías de señalización y de desarrollo, estas técnicas proporcionan una metodología para investigar la influencia de la herencia basados en proteína en procesos biológicos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistemas biológicos con frecuencia experimentan fluctuaciones transitorias en abundancia de la proteína. No está claro si éstos tienen un impacto duradero en la formación del fenotipo de un organismo o de las generaciones futuras. Los casos más conocidos de esta biología implican una clase rara de las proteínas, los priones, que conducen a la aparición de rasgos hereditarios sin modificación del genoma. En cambio, estos proteinaceous y enfectious las partículas transmiten fenotipos mediante cambios perpetúa a sí mismo a la conformación de la proteína1,2. Este tipo de herencia fue descubierto como la causa de los patrones de herencia inusual de una enfermedad neurodegenerativa devastadora. Sin embargo, estudios en organismos que van desde hongos hasta mamíferos3,4,5,6,7,8,9,10 han revelado desde entonces que elementos como prión pueden conferir valor adaptativo. Sin embargo, los priones han sido vistos como una fascinante pero rara rareza biológica.

Esta sabiduría que prevalece en parte se lleva a cabo porque la caracterización de la herencia basados en proteínas durante mucho tiempo ha sido restringida por un pequeño conjunto de ejemplos. Los esfuerzos recientes de cribado sistemático han ampliado esta imagen significativamente mediante la identificación de varios nuevos priones de bona fide 11 y casi dos docenas de proteína dominios12 con capacidad de conversión conformacional de combustible-como prión. Sin embargo, debido a estos enfoques se han centrado generalmente en sesgos de secuencia del aminoácido fuerte, los priones que se han descubierto compartan las propiedades bioquímicas de la Fundación levadura prions [PSI+]13,14[URE3]15y [RNQ+]11,16. Estos incluyen: 1) modulares dominios que son ricos en tramos largos polímeros de asparagina (N) y glutamina (Q), 2) el conjunto en un amiloide [prión+] conformación17,18,19y 3) completan dependencia disaggregase Hsp104 función de propagación fiel de madre a hija13,20,21. De hecho, muchos bona fide priones, incluyendo [GAR+], [Het-s] y aun el original del prión (PrPSc), sería faltado bajo criterios estrictos. Tal vez lo más importante, serían incapaces de capturar nuevos mecanismos de herencia basados en proteína22. Así, la verdadera amplitud biológica de tales fenómenos puede ser mucho más común en la naturaleza que se suponía.

Para investigar esta cuestión, se empleó una estrategia de alto rendimiento de todo el proteoma. Una característica de los priones, incluyendo PrPSc, [GAR+], y [Het-s], es que la sobreexpresión transitoria de las proteínas causales aumenta fuertemente la tasa de prión adquisición15,23,24,25,26. Hemos aprovechado esta característica para pedir sistemáticamente, a través de toda la levadura ORFeome, si Estados estables basados en proteína, epigenéticos podrían ser iniciados por transitoriamente induce la sobreexpresión de proteínas individuales. Es bien sabido que sobreexpresión de proteína puede alterar los fenotipos27. Sin embargo, las proteínas del prión son inusuales porque su superproducción temporal produce un cambio en el fenotipo que es heredable por cientos de generaciones después de la sobreexpresión de inicial. Previamente hemos tomado ventaja de esta característica, así como los patrones de herencia inusual de elementos genéticos basados en proteínas, para identificar docenas de proteínas que son capaces de heritably re-wiring fenotípicas paisajes sin alterar el genoma28. Aunque algunos identifican proteínas fueron conocido como los priones, la mayoría eran no, lo que subraya la potencia de este enfoque para descubrir nuevas formas de herencia basados en proteína.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sobreexpresión inicial

  1. Transformar las células de levadura (en este caso, BY4741 MAT a haploides) previamente cultivadas en líquido YPD (10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona y 20 g de glucosa por 1 L) con las construcciones candidatas deseadas de la biblioteca FLEXGene ORFeome (ORF de levadura bajo el control de un promotor inducible por galactosa en la columna vertebral del plásmido centromérico marcado con URA3, pBY01129).
  2. Use palillos de dientes esterilizados en autoclave para elegir cuatro colonias separadas de estas transformaciones para que sirvan como réplicas biológicas. Cultivarlos durante 48-72 h en 150 μL de SRaffinose-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y 20 g de rafinosa por 1 L) en placas de 96 pocillos. Inocular las colonias de la primera ORF en el pocillo A1 de todas las placas, las colonias de la segunda ORF en A2 de todas las placas, etc.
    NOTA: Todos los pasos de crecimiento se llevan a cabo a 30 °C y a niveles atmosféricos de CO2 (407.05 ppm), a menos que se indique lo contrario.
  3. Confirme que los cultivos están saturados (células visibles a simple vista en el fondo de cada pocillo) y utilice un robot de manipulación de líquidos para inocular una matriz 1:4 de 1 μL de cada pocillo de placa de 96 pocillos en 4 pocillos separados de una placa de 384 pocillos llena de 45 μL de SGal-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de nitrógeno base de levadura sin aminoácidos, y 20 g de galactosa por 1 L) por pocillo.
    NOTA: Esto crea una placa compuesta en la que 4 réplicas biológicas de cada ORF están dispuestas en un patrón cuadrado.
  4. Al mismo tiempo, prepare placas separadas de 384 pocillos que contengan 45 μL de SGal-URA con los factores estresantes de interés (por ejemplo, cloruro de manganeso a 20 mM) por pocillo. Inocular esta placa de la misma manera que en el paso 1.3.
    NOTA: Para lograr el mayor rango dinámico para la detección fenotípica, se recomienda una serie de dilución de 2 veces alrededor de la concentración LD50 de un factor estresante dado. Esto se puede hacer de antemano para determinar la concentración óptima a la que observar tanto el crecimiento mejorado como el reducido.
  5. Como control paralelo final, inocule una tercera placa de 384 pocillos de la misma manera, con el mismo estresor incluido en el medio que no induzca la expresión de plásmidos. Asegúrese de que la placa contenga 45 μL de SD-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de nitrógeno base de levadura sin aminoácidos y 20 g de glucosa por 1 L) por pocillo y se inocule como en los pasos 1.3 y 1.4.
  6. Coloque inmediatamente las placas con celdas en un apilador de microplacas y configure el protocolo para un circuito continuo de 72 horas, midiendo el OD600 con un lector de microplacas equipado con apiladores a temperatura ambiente y CO2 atmosférico (407,05 ppm).
    Nota: La frecuencia de la medición del crecimiento dependerá del número de placas (determinado en última instancia por el número de genes y condiciones que el investigador desea sondear) utilizadas en la ejecución. Cuantas más placas se utilicen, más tiempo tardará el lector de placas en completar un bucle y, por lo tanto, mayor será el tiempo entre mediciones (el tiempo de medición por placa es de ~45 s, dependiendo de la instrumentación empleada).
  7. Después de las mediciones de crecimiento, utilice el mismo robot de manipulación de líquidos para transferir 1 μL por pocillo de los cultivos inducidos por SGal-URA (es decir, aquellos que experimentaron sobreexpresión de proteínas) a nuevas placas de 384 pocillos que contienen 45 μL de SD-URA por pocillo (medio que no permite la expresión proteica del plásmido).
    1. Paralelamente, realice inoculaciones análogas de un segundo conjunto de placas de 384 pocillos que contengan 45 μL de SD-URA por pocillo de los cultivos que se cultivaron en SD-URA en presencia de los factores estresantes (es decir, los del paso 1.5).
    2. Haga crecer las placas durante 48 h a 30 °C hasta la saturación en una cámara humidificada (es decir, un recipiente de plástico hermético con una toalla de papel húmeda en el interior).
  8. Tome las placas del paso anterior y reinocule 1 μL por pocillo en placas de 384 pocillos que contienen 45 μL de SD-URA. A continuación, realice una reinoculación separada de 1 μL por pocillo desde la misma placa fuente en una placa separada de 384 pocillos que contenga 45 μL de SD-URA con el estresador.
    NOTA: Esto determinará si los fenotipos de sensibilidad/resistencia a un factor estresante persisten después de que haya cesado la sobreexpresión de proteínas.
  9. Coloque inmediatamente las placas con celdas en un apilador de microplacas y configure el protocolo para un circuito continuo de 48 horas que mida el diámetro exterior600 con un lector de microplacas a temperatura ambiente y CO2 atmosférico (407,05 ppm).
  10. Exporte las mediciones de tiempo frente a OD600 como una tabla XY utilizando el software de lectura de placas. Agrupe las columnas del OD600 para cada réplica biológica y calcule la media. Cree un gráfico XY de tiempo frente a OD600 para generar curvas de crecimiento.
    1. Compare las tasas de crecimiento de los cultivos que han sido sometidos a una sobreexpresión pasada (es decir, los inducidos originalmente en un medio que contiene galactosa antes de la reinoculación en SD-URA) frente a los cultivos que no lo habían sido (es decir, los propagados en glucosa), como se describió anteriormente30.
  11. Para los cultivos que muestran diferencias significativas de crecimiento en respuesta a un factor estresante dado, dependiente de la sobreexpresión de proteínas ancestrales, se debe tomar 1 μL de cada réplica biológica, diluirlo en 10 mL de agua y luego colocar 50 μL en placas que contengan 5-FOA (0,74 g de CSM-URA, 1 g de 5-FOA, 50 mg de uracilo, 6,7 g de levadura nitrogenada base sin aminoácidos, 20 g de glucosa y 20 g de agar por litro). Crecer a 30 °C durante 3 días.
    1. Si esto da como resultado demasiadas o muy pocas colonias por plato, ajuste el factor de dilución en consecuencia.
      Nota: El 5-FOA se convierte en un intermediario tóxico por la vía de biosíntesis del uracilo. Esto provocará una pérdida del plásmido de expresión marcado por URA3 transformado en el primer paso.
  12. Elija de 8 a 32 colonias individuales con palillos de dientes esterilizados en autoclave y fíjelos a placas de 96 pocillos que contengan 150 μL de SD-CSM. Crecer hasta la saturación durante 48-72 h en una cámara humidificada a 30 °C. Utilice estos cultivos para inocular dos nuevos conjuntos de placas de 96 pocillos que contienen 150 μL de SD-CSM, con y sin los factores estresantes del paso 1.11.
  13. Coloque las placas en un apilador de microplacas y configure el protocolo para medir el diámetro exterior600 en un circuito continuo de 48 horas.
  14. Analice los datos como en el paso 1.10 y confirme que las diferencias de crecimiento significativas observadas en el paso 1.10 se mantienen después de la pérdida de plásmidos.
    NOTA: Estas células albergan estados fenotípicos estables que podrían ser indicativos de una herencia basada en proteínas.
  15. Pruebe las células que mantuvieron los fenotipos inducidos para obtener las características clásicas de la herencia basada en proteínas (ver más abajo).

2. Pruebas para la herencia tipo prión

  1. "Curación" mediada por acompañantes
    1. Pruebe la dependencia de acompañantes Hsp104.
      1. Elija una colonia de una cepa de levadura que albergue un estado fenotípico estable, escurra en colonias individuales en una placa YPD (10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 g de glucosa y 20 g de agar por 1 L) que contenga 3 mM de GdnHCl y crezca a 30 °C durante 3 días. Paralelamente, extienda una colonia de una cepa naïve a colonias individuales en YPD+ 3 mM GdnHCl como control de la misma manera.
      2. Repita 2 veces más en placas frescas de YPD que contengan 3 mM de GdnHCl.
      3. Debido a que la exposición a GdnHCl puede aumentar la frecuencia con la que surgen células pequeñas, elija varias colonias que hayan pasado por 3 pasos en GdnHCl y verifique la respiración mitocondrial funcional examinando su capacidad para convertirse en colonias visibles en placas de YP-Glycerol (10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 mL de glicerol y 20 g de agar por 1 L) después de 7 días.
      4. Elija varias colonias de las placas de yp-glicerol y pruebe el mantenimiento de estados fenotípicos estables utilizando el crecimiento en presencia del factor estresante en comparación con los controles no "curados" e ingenuos (es decir, células isogénicas que no albergan el estado fenotípico, como BY4741 MATa haploides) de manera similar a la descrita en el paso 1.13.
    2. Pruebe la dependencia de acompañantes de Hsp70.
      1. "Curar" a través de un plásmido.
        1. Transforme tanto las células ingenuas como las células que albergan estados fenotípicos estables con plásmidos marcados con URA3 que expresan un alelo negativo dominante de Hsp70 (K69M)25,31 de un promotor constitutivo fuerte (GPD).
        2. Elija transformantes individuales para cada uno, escurre a colonias individuales en una placa SD-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 20 g de glucosa y 20 g de agar por 1 L), y crezca durante 3 días a 30 °C yCO2 atmosférico.
        3. Repita este paso 2 veces más en placas SD-URA.
        4. Elija varias colonias y diríjase a una sola colonia en placas de 5-FOA para eliminar el plásmido.
        5. Elija varias colonias individuales para cada aislado y pruebe la retención (o pérdida) de los estados fenotípicos estables de manera similar a la descrita en el paso 1.13.
      2. "Curar" a través del cruzamiento genético.
        1. Cruza BY4741 MAT, una cepa haploide que alberga estados fenotípicos estables y cepas ingenuas del tipo de apareamiento opuesto (en este caso, BY4742 MATα) que albergan deleciones genéticas en dos de los cuatro parálogos de la levadura Hsp70 (ssa1Δ, ssa2Δ).
          NOTA: Esta cepa es deficiente en la función chaperona Hsp70.
        2. Seleccionar para el crecimiento de diploides mediante rayas a colonias individuales en SD-LYS-MET (0,74 g de CSM-LYS-MET, 6,7 g de levadura nitrogenada base sin aminoácidos, 20 g de glucosa y 20 g de agar por 1 L) medio de doble caída.
        3. Recoger colonias diploides individuales y cultivar durante 24 h a 30 °C en 8 mL de medio de preesporulación (0,8% de extracto de levadura, 0,3% de peptona, 10% de dextrosa y 100 mg/L de sulfato de adenina).
        4. Centrifugar los cultivos durante 3 min a 3.000 xg, aspirar el medio de preesporulación (pre-SPO) y lavar los pellets una vez con agua estéril.
        5. Vuelva a suspender los gránulos en 2 ml de medio de esporulación (acetato de potasio al 1%, extracto de levadura al 0,1%, glucosa al 0,05% y mezcla de aminoácidos al 0,01% (2 g de histidina, 10 g de leucina, 2 g de lisina y 2 g de uracilo)). Crece a 25°C durante 5 días.
        6. Mover los cultivos a 30 °C e incubar durante 48 h más.
        7. Evalúe la eficiencia de la esporulación buscando la presencia de tétradas utilizando un microscopio óptico32.
        8. Tome 40 μL de cultivo, centrifugue durante 1 min a 3.000 xg en un tubo de 1,5 mL y vuelva a suspender en un volumen igual de mezcla de enzimas zimolyase (1 M de sorbitol, 0,1 M de EDTA y 10 mg/mL de zimolyase 100T)
        9. Incubar a 25 °C durante 5 min.
        10. Aplique 10 μL de cultivo digerido a una placa de agar YPD muy seca y muy nivelada y permita que el cultivo se extienda lentamente por la placa en línea recta.
        11. Deje que las placas se sequen durante al menos 30 minutos en una campana de flujo laminar.
        12. Con un microscopio de disección, separe las esporas en tétradas y colóquelas en la placa.
        13. Permita que las esporas haploides individuales crezcan en colonias y pruebe su capacidad para crecer en placas SD-HIS-LEU (0,67 g de CSM-HIS-LEU, 6,7 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 20 g de glucosa y 20 g de agar por 1 L), lo que indica que albergan ambas deleciones genéticas (ssa1Δ ssa2Δ).
        14. Pruebe cada uno para el mantenimiento del estado fenotípico en el fondo deficiente de Hsp70 de manera similar a lo descrito en el paso 1.13.
          NOTA: El cruce de estas esporas con una cepa de tipo salvaje con la función Hsp70 restaurada no debería restaurar el fenotipo del prión.
  2. Pruebas de herencia no mendeliana.
    1. Cruce BY4741 MAT, una cepa haploide que alberga estados fenotípicos estables y controles ingenuos isogénicos, con una cepa ingenua isogénica del tipo de apareamiento opuesto (en este caso, BY4742 MATα).
    2. Seleccione para el crecimiento de diploides mediante el rayado a colonias individuales en el medio SD-LYS-MET de doble abandono.
    3. Recoger colonias diploides individuales y cultivar durante 24 h a 30 °C en 8 mL de medio de preesporulación.
    4. Repita los pasos 2.2.2.3-2.2.2.12, como se describe anteriormente.
    5. Permita que las esporas haploides individuales crezcan en colonias y pruebe cada una para el mantenimiento del estado fenotípico a través de la meiosis utilizando el ensayo de crecimiento, como en el paso 1.13.
      Nota: Otra característica definitoria de los priones es que pueden ser eliminados hereditariamente a través de la eliminación de la proteína casual original. Por lo tanto, el cruce análogo de una cepa de priones con una cepa que alberga una deleción genética de la proteína inducida original derogará los fenotipos de priones en las esporas que heredan la deleción. También hay que tener en cuenta que es posible que el prión se mantenga en un estado "críptico" en un mutante de este tipo si el gen delecionado es necesario para manifestar el fenotipo del prión pero no para propagar el prión en sí. Para distinguir entre estas dos posibilidades, cruza las esporas con una cepa ingenua de tipo salvaje y prueba si el fenotipo del prión resurge en un fondo genético diploide, donde se ha restaurado la función del gen.
  3. Citoducción.
    1. Genere la cepa receptora inicial de BY4742.
      1. A través de la transformación, introduce un alelo KAR defectuoso (kar1-15) que impide la fusión nuclear durante el apareamiento23.
      2. Haga que esta cepa sea "pequeña" (es decir, incompetente para la respiración mitocondrial) inoculando una sola colonia en caldo YPD con 0.25% de bromuro de etidio.
      3. Cultive el cultivo a 30 °C hasta la fase exponencial/estacionaria tardía (OD600 ~ 1).
      4. Diluir 1:1.000 en YPD fresco con bromuro de etidio al 0,25% y repetir dos veces.
      5. Una vez que el cultivo alcanza la fase exponencial tardía/estacionaria temprana (OD600 0,8-1,2), coloque la placa en colonias individuales diluyendo 1:10.000 en agua estéril y colocando 50 μL en una placa YPD. Después de cultivar durante 3 días a 30 °C, elija varias colonias y pruebe cada una de ellas para determinar la incompetencia respiratoria examinando su capacidad para convertirse en colonias visibles en placas de YP-Glycerol después de 7 días.
    2. Realice la citoducción inicial en BY4742.
      1. Mezcle células de la cepa donante BY4741 que albergan un estado fenotípico estable con células de la cepa receptora BY4742 kar1-15 ingenua en la superficie de una placa de agar YPD.
      2. Crecer durante 24 h a 30 °C y CO2 atmosférico (407,05 ppm) y transferir a un medio de caída de metionina que contenga glicerol (SGly-MET: 0,74 g de CSM-MET, 6,7 g de nitrógeno base de levadura sin aminoácidos, 20 mL de glicerol y 20 g de agar por 1 L).
        NOTA: Esto selecciona ambos marcadores nucleares BY4742, además de permitir la restauración de las mitocondrias funcionales a través del intercambio citoplasmático.
      3. Después de 3-5 días, elija varias colonias individuales y realice otra ronda de selección en SD-MET (0,74 g de CSM-MET, 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 20 g de glucosa y 20 g de agar por 1 L).
      4. Paralelamente, confirme que las colonias no son diploides mediante el paso en el medio SD-LYS-MET.
    3. Realizar citoducciones inversas.
      1. Mezcle las nuevas cepas donantes (esta vez, los exitosos citoductantes BY4742 kar1-15) con pequeñas células BY4741 ingenuas (generadas como se indicó anteriormente) en agar YPD.
      2. Repetir las citoducciones, como se ha descrito anteriormente (pasos 2.3.2.1-2.3.2.4), excepto la selección de marcadores nucleares receptores de BY4741 en medio de glicerol que carezca de lisina (SGly-LYS: 0,74 g de CSM-LYS, 6,7 g de nitrógeno base de levadura sin aminoácidos, 20 mL de glicerol y 20 g de agar por 1 L).
      3. Elija varios citoductores y pruebe el mantenimiento de estados fenotípicos estables utilizando el ensayo de crecimiento, como antes en el paso 1.13.
  4. Transformación de proteínas.
    1. Prepara el lisado.
      1. Cultive 50 mL de células que albergan estados fenotípicos estables en YPD durante 18 h a 30 °C.
      2. Granular los cultivos a 3.000 x g durante 4 min y luego lavar dos veces: una vez en H2O esterilizado en autoclave y luego en sorbitol 1 M.
      3. Vuelva a suspender las células en 200 mL de tampón SCE (1 M de sorbitol, 10 mM de EDTA, 10 mM de DTT, 100 mM de citrato de sodio y 1 tableta de inhibidor de proteasa sin mini-EDTA por 50 mL, pH 5.8) con 50 U/mL de enzima lítica de levadura 100T.
      4. Incubar la mezcla a 35 °C durante 30 min.
      5. Sonicar las células a 20 kHz y 20% de intensidad durante 10 s en hielo con un desmembrador sónico.
      6. Eliminar los restos de células mediante centrifugación a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C.
      7. Mover los sobrenadantes a un tubo limpio y añadir RNasa I y DNasa biotinilada con un exceso de 3 veces (determinado por unidades de actividad) e incubar a 37 °C durante 1 h.
      8. Eliminar la DNasa I añadiendo el exceso de perlas de estreptavidina-agarosa, incubar durante 5 min y peletizar por centrifugación a 10.000 x g durante 1,5 min.
      9. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
    2. Prepare el esferoplasto receptor.
      1. Cultive 5 mL de células receptoras vírgenes en YPD hasta la fase exponencial media (OD600 que oscila entre 0,5 y 1).
      2. Cosechar por centrifugación (3.000 x g durante 4 min) y lavar 4 veces: dos veces en H2O y dos veces en 1 M de sorbitol.
      3. Vuelva a suspender las células en sorbitol 1 M que contenga 200 U/mL de enzima lítica de levadura e incube durante 15 min a 35 °C para digerir las paredes celulares.
      4. Coseche los esferoplastos resultantes con una centrifugación suave a 600 x g durante 5 min y lave con 1 mL de sorbitol 1 M y luego nuevamente con 1 mL de tampón STC (1 M de sorbitol, 10 mM Tris pH 7.5 y 10 mM CaCl2).
      5. Vuelva a suspender los esferoplastos lavados en 50 μL de tampón STC.
        NOTA: Utilice unas tijeras para cortar los últimos ~0,7 cm de la punta de una pipeta; Esto creará una boca más ancha y evitará la lisis de los esferoplastos.
    3. Transforma las células ingenuas con proteínas.
      1. Transforme 50 μL de alícuotas de esferoplasto con 50 μL de lisado de donante, 20 μL de ADN de esperma de salmón (2 mg/mL) y 5 μL de un plásmido de selección marcado con URA3 (por ejemplo, pAG426-GFP)28,33.
      2. Incubar la mezcla a 25 °C durante 30 min.
      3. Centrifugar durante 5 min a 600 x g para recoger los esferoplastos y volver a suspenderlos en 150 μL de tampón SOS (1 M de sorbitol, 7 mM de CaCl2, 0,25% de extracto de levadura y 0,5% de peptona).
      4. Recupere durante 30 minutos a 30 °C.
      5. Coloque todo el cultivo en placas SD-URA.
      6. Superponga rápidamente el cultivo en placa con SD-URA caliente (~45 °C) que contenga un 0,8% de agar.
        Nota: Esto evitará que los esferoplastos exploten
      7. Incubar las placas de transformación durante 2-3 días a 30 °C.
      8. Con un palillo de dientes, recoja las células en crecimiento exitosas de la placa superpuesta y vuelva a trazarlas en colonias individuales en placas SD-URA.
      9. Elija docenas de colonias para cada una y raye en placas 5-FOA para eliminar el plásmido portador marcado con URA3.
      10. Elija las colonias que crecen en las placas 5-FOA y pruebe la transferencia de estados fenotípicos estables utilizando el ensayo de crecimiento, como antes (paso 1.13).

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Results

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Se sabe que la sobreexpresión de proteínas altera drásticamente los fenotipos celulares27. De hecho, con un enfoque de cribado inicial, se recuperaron de forma reproducible cientos de nuevos fenotipos a partir de la sobreexpresión de clones de la levadura ORFeome utilizando sólo diez factores estresantes. Sin embargo, los ensayos descritos anteriormente permiten evaluar si las células conservan fenotipos estables a largo plazo después de esta sobreexpresión. Una pr...

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Discussion

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Los priones de levadura primeros fueron identificados por sus fenotipos inusuales y desconcertantes patrones de herencia. Las características de estos priones fueron utilizadas para construir algoritmos y herramientas computacionales para detectar proteínas priónicas adicional. El método descrito aquí, en cambio, es experimental y depende de la sobreexpresión transitoria para crear un duradero un cambio estable estado codificado en la conformación de proteínas. Sin embargo, si la eficiencia de "siembra" Asamblea del prió...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Agradecemos a Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She y Susan Lindquist por su asistencia en el desarrollo de los ensayos utilizados en este documento, así como los revisores por sus comentarios reflexivos.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Clorhidrato de guanidinaSigmaCat#G3272-25GQuímico
Cloruro de manganesoSigmaCat#M8054-100GQuímico
Bromuro de etidioSigmaE1510Químico
5-Ácido fluorooróticoSigmaCat#F5013-50MGQuímico
BY4741 MATa (his3Δ 1 leu2Δ 0 LYS2 met15Δ 0 ura3 y Delta; 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/A Cepade levadura
BY4741 MATα (his3Δ 1 leu2Δ 0 lys2 y Delta; 0 MET15 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/A Cepade levadura
Hsp70 (K69M) Jarosz et al., 2014b/APlásmido
FLEXLa bibliotecade Gee Hu et al., 2007N/ABiblioteca de plásmidos
Dextrosa (glucosa)Fisher ScientificD16-3Componente de medios
RafinosaSigmaR0250-25GComponente de medios
GalactosaFisher ScientificBP656-500Componente de medios
CSMSunrise Ciencia1001-100Componente multimedia
CSM-URASunrise Science1004-100
Componente multimedia CSM-LYSSunrise Science1032-100Componente
CSM-METSunrise Science1019-100Componente multimedia
CSM-LYS-METSunrise Science1035-100Componente multimedia
extracto de levaduraFisher ScientificBP1422-2Componente de medios
peptonaResearch Products InternationalP20240-5000Componente de medios
bacto-peptonaBD211677Componente de medios
glicerolEMD MilliporeGX0185-2Componente de medios
base de nitrógeno sin aminoácidosBD291920Componente de
medios agarIBI Scientific IB49172Componente mediático
Sulfato de adeninaSigmaA3159-25GComponente mediático
Acetato de potasioSigmaP1190-500GComponente mediático
UracilSigmaU0750-100GComponente mediático
HistidineSigmaH8000-100GComponente multimedia
LeucinaSigmaL8000-25GComponente de medios
LisinaSigmaL5501-25GComponente de medios
RNasa I Thermo Fisher ScientificEN0601Enzima
DNasa biotiniladaThermo Fisher ScientificAM1906Enzima
zimolyase 100T (enzima lítica de levadura)Sunrise ScienceN0766555Enzyme Lector
microplacasBioTekSynergy H1Equipment
Apilador de microplacasBioTek BioStack3
Equipment Plate llenadoraBiotTekEL406Equipment Robot
de manipulación de líquidosBeckman CoulterBiomek FXEquipment
Nmultimedia levadura de

References

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Protein based InheritanceYeast ORFeome ScreeningHigh throughput PhenotypingPrion Protein DetectionManganese Chloride StressorHSP104 DisaggregasePSP1 Open Reading FrameNon mendelian InheritanceYeast Prion FieldEpigenetic Screening

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