Proyección de alto rendimiento para la herencia basados en proteína en S. cerevisiae

Resumen

Este protocolo describe una metodología de alto rendimiento para funcionalmente basados en proteína herencia en S. cerevisiae.

Resumen

La codificación de la información biológica que es accesible a las generaciones futuras se obtiene generalmente mediante cambios en la secuencia de ADN. Herencia longeva codificada en proteínas conformación (en lugar de secuencia) durante mucho tiempo ha sido visto como cambio de paradigma pero rara. Los mejores ejemplos de tales elementos epigenéticos caracterizados son los priones, que poseen un comportamiento uno mismo-montaje que puede conducir la manifestación hereditaria de fenotipos nuevos. Muchos priones arquetípicos mostrar un sesgo de secuencia impactante de N/Q-rico y montan en un doblez amiloideo. Estas características inusuales han informado de más esfuerzos de investigación para identificar nuevas proteínas del prión. Sin embargo, por lo menos tres priones conocidos (incluyendo el fundador del prión, PrP^Sc) no albergan estas características bioquímicas. Por lo tanto, desarrollamos un método alternativo para probar el alcance de la herencia basados en proteínas, basada en una propiedad de la acción de masas: la sobreexpresión transitoria de las proteínas del prión aumenta la frecuencia en que adquieren una conformación de plantillas de uno mismo. Este artículo describe un método para el análisis de la capacidad de la levadura ORFeome para obtener la herencia basados en proteínas. Usando esta estrategia, hemos encontrado que > 1% de proteínas de levadura podrían impulsar la aparición de rasgos biológicos que duradero, estable y se presentó con mayor frecuencia que la mutación genética. Este enfoque puede ser empleado en alto rendimiento en todo ORFeomes o como un paradigma de proyección específica para redes genéticas específicas o estímulos ambientales. Como pantallas genéticas adelantados definen numerosas vías de señalización y de desarrollo, estas técnicas proporcionan una metodología para investigar la influencia de la herencia basados en proteína en procesos biológicos.

Introducción

Sistemas biológicos con frecuencia experimentan fluctuaciones transitorias en abundancia de la proteína. No está claro si éstos tienen un impacto duradero en la formación del fenotipo de un organismo o de las generaciones futuras. Los casos más conocidos de esta biología implican una clase rara de las proteínas, los priones, que conducen a la aparición de rasgos hereditarios sin modificación del genoma. En cambio, estos proteinaceous y enfectious las partículas transmiten fenotipos mediante cambios perpetúa a sí mismo a la conformación de la proteína^1,2. Este tipo de herencia fue descubierto como....

Protocolo

1. Sobreexpresión inicial

1. Transformar las células de levadura (en este caso, BY4741 MAT a haploides) previamente cultivadas en líquido YPD (10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona y 20 g de glucosa por 1 L) con las construcciones candidatas deseadas de la biblioteca FLEXGene ORFeome (ORF de levadura bajo el control de un promotor inducible por galactosa en la columna vertebral del plásmido centromérico marcado con URA3, pBY011²⁹).
2. Use palillos de dientes esterilizados en autoclave para elegir cuatro colonias separadas de estas transformaciones para que sirvan como réplicas biológicas. Cult....

Resultados

Se sabe que la sobreexpresión de proteínas altera drásticamente los fenotipos celulares²⁷. De hecho, mediante un enfoque de cribado inicial, se recuperaron de forma reproducible cientos de nuevos fenotipos a partir de la sobreexpresión de clones del ORFeoma de levadura utilizando solo diez agentes de estrés. Sin embargo, los ensayos descritos anteriormente permiten evaluar si las células conservan algún fenotipo estable a largo plazo tras esta sobreexpresión. Una p.......

Discusión

Los priones de levadura primeros fueron identificados por sus fenotipos inusuales y desconcertantes patrones de herencia. Las características de estos priones fueron utilizadas para construir algoritmos y herramientas computacionales para detectar proteínas priónicas adicional. El método descrito aquí, en cambio, es experimental y depende de la sobreexpresión transitoria para crear un duradero un cambio estable estado codificado en la conformación de proteínas. Sin embargo, si la eficiencia de "siembra" Asamblea del prió.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clorhidrato de guanidina	Sigma	Cat#G3272-25G	Químico
Cloruro de manganeso	Sigma	Cat#M8054-100G	Químico
Bromuro de etidio	Sigma	E1510	Químico
5-Ácido fluoroorótico	Sigma	Cat#F5013-50MG	Químico
BY4741 MATa (his3Δ 1 leu2Δ 0 LYS2 met15Δ 0 ura3 y Delta; 0)	Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998	N/A Cepa	de levadura
BY4741 MATα (his3Δ 1 leu2Δ 0 lys2 y Delta; 0 MET15 ura3Δ 0)	Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998	N/A Cepa	de levadura
Hsp70 (K69M)	Jarosz et al., 2014b	/A	Plásmido
FLEXLa biblioteca	de Gee Hu et al., 2007	N/A	Biblioteca de plásmidos
Dextrosa (glucosa)	Fisher Scientific	D16-3	Componente de medios
Rafinosa	Sigma	R0250-25G	Componente de medios
Galactosa	Fisher Scientific	BP656-500	Componente de medios
CSM	Sunrise Ciencia	1001-100	Componente multimedia
CSM-URA	Sunrise Science	1004-100
Componente multimedia CSM-LYS	Sunrise Science	1032-100	Componente
CSM-MET	Sunrise Science	1019-100	Componente multimedia
CSM-LYS-MET	Sunrise Science	1035-100	Componente multimedia
extracto de levadura	Fisher Scientific	BP1422-2	Componente de medios
peptona	Research Products International	P20240-5000	Componente de medios
bacto-peptona	BD	211677	Componente de medios
glicerol	EMD Millipore	GX0185-2	Componente de medios
base de nitrógeno sin aminoácidos	BD	291920	Componente de
medios agar	IBI Scientific IB49172		Componente mediático
Sulfato de adenina	Sigma	A3159-25G	Componente mediático
Acetato de potasio	Sigma	P1190-500G	Componente mediático
Uracil	Sigma	U0750-100G	Componente mediático
Histidine	Sigma	H8000-100G	Componente multimedia
Leucina	Sigma	L8000-25G	Componente de medios
Lisina	Sigma	L5501-25G	Componente de medios
RNasa I	Thermo Fisher Scientific	EN0601	Enzima
DNasa biotinilada	Thermo Fisher Scientific	AM1906	Enzima
zimolyase 100T (enzima lítica de levadura)	Sunrise Science	N0766555	Enzyme Lector
microplacas	BioTek	Synergy H1	Equipment
Apilador de microplacas	BioTek BioStack3
Equipment Plate llenadora	BiotTek	EL406	Equipment Robot
de manipulación de líquidos	Beckman Coulter	Biomek FX	Equipment

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