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Artículo de método

Trasplante de Schwann las células dentro de conductos de PVDF-TrFE a puente tocones de médula espinal de rata seccionado para promover la regeneración del axón a través de la brecha

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DOI:

10.3791/56077

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3 de noviembre de 2017

En este artículo

Resumen

Este artículo describe una técnica para insertar un tubo hueco entre los tocones de la médula espinal después de la transección completa y se llenan de células de Schwann (SCs) y matriz inyectable la membrana del sótano para salvar y promover la regeneración del axón a través de la brecha.

Resumen

Entre los distintos modelos de lesión de la médula espinal en ratas, el modelo de la contusión se utiliza lo más a menudo porque es el tipo más común de lesión de la médula espinal humana. El modelo de transección completa, aunque no clínicamente relevantes como el modelo de contusión, es el método más riguroso para evaluar la regeneración del axón. En el modelo de contusión, es difícil distinguir de axones germinados o ahorrados debido a la presencia de remanente post lesión de tejido regenerado. En el modelo transection completo, un método de adaptación es necesario para llenar la brecha y crear continuidad de la rostral a los caudales muñones para evaluar la eficacia de los tratamientos. Una cirugía de puente confiable es esencial para poner a prueba las medidas de resultado reduciendo la variabilidad debido al método quirúrgico. Los protocolos descritos aquí se utilizan para preparar a Schwann las células (SCs) y conductos antes del trasplante, transección completa de la médula espinal a nivel torácico 8 (T8), inserte el conducto y trasplante del SCs en el conducto. Este enfoque también utiliza en situ de gelificación de una matriz de membrana del sótano inyectable con el trasplante de SC que permite el crecimiento del axón mejor a través de las interfaces rostrales y caudales con el tejido del anfitrión.

Introducción

Reparación de lesión de la médula espinal es un problema complejo y difícil que requiere una estrategia de tratamiento combinatoria que involucran, por ejemplo, el uso de células y un biomaterial para proporcionar un microambiente favorable para la función de las células trasplantadas y axon regeneración en el sitio de la lesión. Hemisección1,2,3,4,5,6,7,8,9 y transecci....

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Protocolo

ratas Fischer adulto (peso 180-200 g) se encuentran directrices NIH y del USDA. El Animal cuidado institucional y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Miami aprobaron todos los procedimientos animales.

1. preparación de pre-trasplante

  1. preparación de conducto.
    1. Corta el conducto a 5 mm de longitud con una cuchilla #10 con un microscopio de disección.
      Nota: El diámetro interno del conducto está entre 2.4-2.7 m; el diámetro exterior es de entre 2.5-2.8 mm.
    2. Pliegue el conducto suavemente a lo largo del lado longitudinal ( figura 1A). Corte cuatro pequeña....

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Resultados

El objetivo de la utilización de esta técnica quirúrgica es evaluar el uso de un tubo estructurado y matriz inyectable que maximiza la función SC después del trasplante en cuerdas de espinal transected terminados. Tres semanas después del trasplante, los animales son perfundidos con paraformaldehído al 4% y las columnas vertebral son groseramente disecadas y fijo en el mismo fijador por otro 24 h. Luego se diseca la médula espinal y las muestras para las secciones sagitales criostato se c.......

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Discusión

El paso más crítico en la creación de un modelo de corte transversal eficaz es cortar la médula espinal en uno o dos cortes. Un 2-2.5 mm de espacio entre los tocones rostral y caudal de la médula espinal debe estar presente en el sitio de transección. Las tres razones más probables para tal espacio no aparece son (1) las raíces dorsal/ventral no se limpiaron adecuadamente, (2) la dura ventral no se elimina adecuadamente, o (3) el animal no fue colocado correctamente sobre el rodillo colocado debajo de ella.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias al Vector Viral y núcleos de animales en el proyecto Miami para curar parálisis para producir el lenti-GFP-virus y proporcionar cuidado animal, respectivamente y la histología y núcleos de proyección de imagen para el uso del criostato, microscopio confocal, y microscopio de fluorescencia con el investigador estéreo. La financiación fue proporcionada por NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) y NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge es el Christine E Lynn distinguido profesor de Neurociencias.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Viales criogénicosThermoFisher Scientific5000-0020
10 cm Placa de PetriVWR25382-428
Medio de Eagle modificado de Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12ThermoFisher Scientific11039-021"DMEM/F12" en protocolo.
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher Scientific15140-122"Pluma/Estreptococo" en protcol.
Suero fetal bovinoHycloneSH300-70-03"FBS" en protocolo.
Extracto de hipófisisBiomedical TechnologiesBT-215
ForskolinSigma-AldrichF6886
HeregulinR& D Systems396-HB/CF
Poly L-lisinaSigma-AldrichP2636"PLL" en protocolo.
Dulbecco's modificado Eagle mediumThermoFisher Scientific11965-092"DMEM" en protocolo.
Solución salina equilibrada de HankThermoFisher Scientific14170-112"HBSS" en protocolo.
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
Rata Fischer hembra (160-180g)Tijera Envigo
Vannas, rectaFST15018-10
KetaminaVedco Inc5098976106100 mg/ml
XilacinaLloyd IncAnaSed20 mg/ml
GentamicinaAPP Productos farmacéuticosNDC 63323-010-02Puede ser cualquier marca de elección.
Micro EspátulaFST10089-11Puede ser de cualquier marca de elección.
Las tijeras curvas con extremo romoFST14017-18pueden ser de cualquier marca de elección.
Pinzas romasFST11006-12Puede ser de cualquier marca de elección.
rongeurFST16121-14Puede ser cualquier marca de elección.
Tijeras de resorte en ánguloFST15006-09Puede ser de cualquier marca de elección.
Triángulos de absorciónFST18105-03Puede ser de cualquier marca de elección.
GelfoamHenry Schein9083300"Espuma comprimida" en protocolo.
#10 cuchillasSklar06-3010Puede ser de cualquier marca de elección.
MatrigelCorning354234"Matriz inyectable" en protocolo.
Anticuerpo antiproteína fluorescenteMillipore AB16901
ratón RT97 anticuerpo de hibridomaDSHBRT97
Anticuerpo anti-neurofilamento de conejoEncor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Conejo policlonal anticuerpo de proteína ácida fibrilar antiglialDakoZ033401
Alexa Fluor 488 cabra anti-pollo IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11039
Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11035
Alexa Fluor 647 cabra anti-conejo IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21244
Alexa Fluor 647 cabra anti-ratón IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21236
Microscopía ConfocalNikonclsi
verde

Referencias

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y.

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Reimpresiones y permisos

Etiquetas

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