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Artículo de método

Trasplante de Schwann las células dentro de conductos de PVDF-TrFE a puente tocones de médula espinal de rata seccionado para promover la regeneración del axón a través de la brecha

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DOI:

10.3791/56077

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3 de noviembre de 2017

 ,  ,  , 
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

En este artículo

Resumen

Este artículo describe una técnica para insertar un tubo hueco entre los tocones de la médula espinal después de la transección completa y se llenan de células de Schwann (SCs) y matriz inyectable la membrana del sótano para salvar y promover la regeneración del axón a través de la brecha.

Resumen

Entre los distintos modelos de lesión de la médula espinal en ratas, el modelo de la contusión se utiliza lo más a menudo porque es el tipo más común de lesión de la médula espinal humana. El modelo de transección completa, aunque no clínicamente relevantes como el modelo de contusión, es el método más riguroso para evaluar la regeneración del axón. En el modelo de contusión, es difícil distinguir de axones germinados o ahorrados debido a la presencia de remanente post lesión de tejido regenerado. En el modelo transection completo, un método de adaptación es necesario para llenar la brecha y crear continuidad de la rostral a los caudales muñones para evaluar la eficacia de los tratamientos. Una cirugía de puente confiable es esencial para poner a prueba las medidas de resultado reduciendo la variabilidad debido al método quirúrgico. Los protocolos descritos aquí se utilizan para preparar a Schwann las células (SCs) y conductos antes del trasplante, transección completa de la médula espinal a nivel torácico 8 (T8), inserte el conducto y trasplante del SCs en el conducto. Este enfoque también utiliza en situ de gelificación de una matriz de membrana del sótano inyectable con el trasplante de SC que permite el crecimiento del axón mejor a través de las interfaces rostrales y caudales con el tejido del anfitrión.

Introducción

Reparación de lesión de la médula espinal es un problema complejo y difícil que requiere una estrategia de tratamiento combinatoria que involucran, por ejemplo, el uso de células y un biomaterial para proporcionar un microambiente favorable para la función de las células trasplantadas y axon regeneración en el sitio de la lesión. Hemisección1,2,3,4,5,6,7,8,9 y transección completa10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelos se utilizan con frecuencia para evaluar los efectos de terapias puente basadas en biomateriales. La ventaja de utilizar un modelo de Hemisección es que proporciona más estabilidad para la construcción de puente en comparación con el transection completo. Sin embargo, en modelos de Hemisección, es difícil probar la regeneración del axón como un resultado del método terapéutico aplicado debido a la presencia de tejido ahorrado. El modelo del transection completo es el método más riguroso para demostrar la regeneración del axón.

Se han estudiado diversos materiales naturales y sintéticos para el uso como un gel inyectable, gel formado colocan en contusión o Hemisección modelos, o como un medio estructurado en Hemisección o completar modelos de corte transversal (detallados en los comentarios23 , 24 , 25). in situ gelificación de una mezcla de matriz/SC inyectable crea una interfaz más permisiva entre el trasplante y el cable host axon travesía26,27 comparado con implantes pregelados matriz/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelificante permite la matriz de contorno alrededor de las interfaces de host irregulares mientras que un tubo más rígido y más estructurado o un gel menos moldeable de formado no podría. Un conducto estructurado a menudo proporciona estabilidad contacto de guía y el implante en contraste con una matriz inyectable. Los protocolos aquí presentados describen un procedimiento quirúrgico que se aprovecha de una matriz inyectable la membrana del sótano (p. ej., matrigel, vea la Tabla de materiales, que se refiere como inyectable matriz aquí) y un conducto estructurado a evaluar la regeneración del axón en el más riguroso modelo de lesión de la médula espinal.

Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) se utilizan conductos huecos fibrosos alineados en nuestro abordaje experimental. PVDF-TrFE es un polímero piezoeléctrico que genera una carga transitoria cuando se deforma mecánicamente y se ha demostrado para promover la regeneración de extensión y axon neurita en vitro29,30 y vivo en 31. Electrospinning es un método común de fabricación de andamio que puede producir rápidamente andamios fibrosos confiables usando una variedad de polímeros con propiedades controlables tales como la alineación de la fibra, fibra diámetro y espesor del andamio para 33,de32,34de nervios y otras aplicaciones.

Numerosos estudios de SCs trasplantados en sitios de lesión de médula espinal de rata han demostrado tratamiento eficacia5,9,18,19,20,21 ,26. Estos trasplantes son neuroprotectores para el tejido que rodea la lesión, reducir el tamaño de la cavidad de lesión y promueve la regeneración del axón en el sitio de trasplante de lesión y la mielinización de los axones regenerados. SCs humanos pueden trasplantarse autologously, una ventaja en comparación con otras neuronales relacionadas con las células24. Después de una biopsia de nervio periférico, SCs pueden ser aislados y purificados y se proliferan a la cantidad deseada para el trasplante en seres humanos. Trasplante autólogo de SC para pacientes lesionados medulares ha demostrado para ser seguro en Irán35,36,37,38, China39,40y el Estados Unidos41,42. SCs se conocen secretan numerosos factores neurotróficos y matriz extracelular proteínas importantes para el crecimiento del axón y juegan un papel esencial en la regeneración del axón después de lesión de nervio periférico. Nuestro objetivo aquí es describir los métodos que pueden investigar diseños de conducto para mejorar los resultados del trasplante de la SC en un modelo de corte transversal de médula espinal de ratas completa.

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Protocolo

ratas Fischer adulto (peso 180-200 g) se encuentran directrices NIH y del USDA. El Animal cuidado institucional y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Miami aprobaron todos los procedimientos animales.

1. preparación de pre-trasplante

  1. preparación de conducto.
    1. Corta el conducto a 5 mm de longitud con una cuchilla #10 con un microscopio de disección.
      Nota: El diámetro interno del conducto está entre 2.4-2.7 m; el diámetro exterior es de entre 2.5-2.8 mm.
    2. Pliegue el conducto suavemente a lo largo del lado longitudinal ( figura 1A). Corte cuatro pequeñas incisiones sobre 0,4 mm de largo y 1 mm, como mínimo, de las aberturas del conducto y cerca de 1 milímetro aparte utilizando el canto recto tijeras de Vannas ( figura 1B).
      1. Desplegar el conducto ( figura 1) y cortar entre dos incisiones a lo largo del mismo lado, creando dos ventanas lado por lado ( figura 1). Asegúrese de que el windows puede abrir y cerrar correctamente a lo largo de la parte sin cortar.
    3. Esterilizar los conductos en etanol al 75% durante 25 minutos en un plato de Petri de 10 cm. Enjuague los conductos una vez durante 4 minutos con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y los conductos de transferencia con pinzas estériles una nueva placa de Petri de 10 cm. Enjuague las conductas dos veces con PBS 1 x durante 25 minutos.
    4. Almacenar los conductos en PBS 1 x hasta cirugía.
      Nota: Muchos conductos se pueden esterilizar a la vez. Almacenar los conductos en tubos de centrífuga estériles separadas 1,5 mL para mantenerlos estériles.
  2. Verde proteína fluorescente (GFP)-preparación de la célula de Schwann (SC)
    1. preparar purificadas culturas SC de los nervios tibiales de Fischer hembra adulta ratas como se describió anteriormente 43. Una vez terminado este paso, la placa del SCs en poly-L-lisina (PLL)-cubierto de Petri de 10 cm y mantener en medio de la D10 / 3M; Estos CS se definen como paso 0.
      Nota: D10 / 3M medio se compone de los siguientes: 10% suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (pen/strep), 20 pituitaria μg/mL del extracto, 2 μm forskoline, 2,5 nM heregulin en Dulbecco ' s modificado Eagle ' medio s (DMEM).
    2. Reponer con medio fresco de D10 / 3M (7 mL/10 cm plato de Petri) cada 3 a 4 días.
    3. Cultura de Split SC una vez que alcanza el 70-80% de confluencia.
      1. Medio de Quite y enjuague dos veces con Hank ' s equilibrada solución de sal (HBSS) sin calcio ni magnesio.
      2. Añadir 5 mL de 0.25% tripsina/EDTA a cada plato de Petri de 10 cm e incubar 5 min a temperatura ambiente (RT).
      3. Añadir 5 mL de medio de D10 (10% FBS y 1% pluma/strep en DMEM) en un tubo de centrífuga de 50 mL para neutralizar la tripsina.
      4. Suavemente la pipeta la tripsina/EDTA solución en el Petri plato varias veces para separar SCs. quitar la suspensión de la célula del plato y lo coloca en el tubo de centrífuga preparado en el paso anterior. Enjuagar el plato con 5 mL de medio de D10 y colóquelo en el tubo de la centrífuga para maximizar la cosecha celular.
      5. Centrifugar las células a 370 x g durante 5 minutos a 4 o C. Retire el sobrenadante y resuspender las células en medio de D10/3 M de 4 mL por cada caja de Petri dividida.
      6. Dispense 1 mL de la suspensión de la SC y 6 mL de medio de D10 / 3M en un plato de Petri de 10 cm, cada plato de Petri dividida resultará en 4 placas de Petri. Estos CS se definición como el paso 1.
      7. Replenish con medio fresco de D10 / 3M el día después de placas y cada 3-4 días después de la galjanoplastia.
      8. Una vez el SCs alcanzar 70-80% de confluencia, repita los pasos 1.2.3.1 a 1.2.3.6. El SCs están ahora en el paso 2.
    4. Transduce el SCs una vez llegando a la confluencia del 50%, con un vector lentivirales codificación GFP en D10 / 3M mediano durante la noche en una multiplicidad de infección de 30 como describió anteriormente 44 , 45 .
    5. Reponer con medio fresco de D10 / 3M al día siguiente y cada 3-4 días después de la galjanoplastia.
    6. Una vez que la GFP-SCs alcanzar 70-80% de confluencia, repita los pasos 1.2.3.1 a 1.2.3.5 pero Resuspender el GFP-SCs en 6 mL de medio de D10 en su lugar. Dispensar 15 μl de la suspensión de la GFP-SC en un tubo de centrífuga de 1.5 mL y añadir 15 μl de solución de azul de tripano 0.4%. Mueva suavemente el tubo de centrífuga y dispensar 10 μl de la mezcla en una cámara del portaobjetos de conteo de células.
      1. Coloque el portaobjetos en un contador de células automatizado y determinar la densidad celular.
    7. Centrifugar las células a 370 x g durante 5 minutos a 4 o C. Retire el sobrenadante, resuspender con 1,5 mL de medio de congelación para cada 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispense 1,5 mL de GFP-SC suspensión en un vial criogénico y congelar a -80 o C por al menos 24 h antes de pasar a nitrógeno líquido para el almacenamiento de.
      Nota: Medio de congelación: 25% FBS y 8% Dimetil sulfóxido en DMEM.
    8. SCs de GFP descongelar una semana antes de la cirugía.
      1. Medio de añadir 10 mL D10 en un tubo de centrífuga de 50 mL.
      2. Deshielo frascos de congelados GFP-SCs en baño de agua a 37 o C hasta descongelado parcialmente.
      3. Quitar la suspensión de la GFP-SC del frasco criogénico y colóquelo en el tubo de centrífuga de 50 mL en 1.2.8.1. Pipetee suavemente la solución arriba y abajo varias veces.
      4. Centrifugar las células a 370 x g durante 5 minutos a 4 o C. Retire el sobrenadante y resuspender las células en medio de D10/3 M 4 mL de cada vial descongelado.
      5. Añada 2 mL de la suspensión de la GFP-SC y 5 mL de medio de D10 / 3M en un plato de Petri de 10 cm, cada frasco debe resultar en 2 placas de Petri. El GFP-SCs se definen como el paso 3.
        Nota: Un plato de Petri de 10 cm generalmente produce alrededor de 8 x 10 6 GFP-SCs después de una semana.
    9. En el día de la cirugía, repita el paso 1.2.6. Uso de la densidad celular se calcula en el paso 1.2.10.
    10. Dispensar alícuotas de 3 x 10 6 GFP-SCs en centrífuga de 1,5 mL estéril tubos basados en la densidad celular se calculan de paso 1.2.9. Centrifugue las alícuotas de GFP-SC 370 x g durante 5 min a 4 o C y eliminar el sobrenadante. Añadir 1 mL de medio DMEM/F12 para cada alícuota y centrifugar a x 370 g.
      Nota: Cada animal recibe 3 x 10 6 GFP-SCs. medio con suero se utiliza con GFP-SCs hasta este paso.
    11. Mantener GFP-SCs en hielo hasta el momento del trasplante.

2. Completar la transección a nivel torácico 8 (T8)

  1. Animal preparación para la cirugía
    1. Anesthetize Fischer hembra rata (180-200 g) con una inyección intraperitoneal de ketamina (60 mg/kg de peso corporal) y xilacina (5 mg/kg de peso corporal). Controlar la profundidad de la anestesia antes de proceder al siguiente paso marcando dedos pellizcando y ojo parpadeantes respuestas.
    2. Afeitar la parte posterior de la rata con una maquinilla eléctrica y limpie la piel con etanol al 70%. Aplicar lubricante oftálmico en ambos ojos. Traslado del animal a la mesa de cirugía en un cojín de calefacción para mantener la temperatura corporal en unos 37 o C. lugar el animal en un rollo así las vértebras son fáciles de acceso.
      Nota: Es posible el rollo de toalla de papel o 2 en x2 en una gasa que puede ser esterilizada. Rollos más grandes se recomiendan T7-T9 tiene que colocarse plana sobre el rollo de.
  2. T7 a T9 laminectomía
    1. localizar el punto de referencia para los procesos espinosos de T9-T11.
      Nota: Las diferencias entre T9, T10 y T11 son pequeños en comparación con otros segmentosn la región. Después de colocar la rata en el rodillo, apófisis espinosas T9-T11 se sentirá como una pequeña protuberancia triangular a través de la piel.
    2. Hacer una incisión de línea media de 4 a 5 cm de la piel con una cuchilla #10 de T4 a T11. Hacer una pequeña incisión en la capa grasa superficial con tijeras curvas con extremos embotados para disecar la grasa.
      Nota: Otros tipos de instrumentos se pueden utilizar para separar la grasa pero tijeras curvadas con extremos embotados habilitar el método más eficaz y menos invasivo para la separación de grasa.
    3. Localizar la T7 a T9 apófisis mediante la parte posterior de la cuchilla #10. Mantener el músculo en sobre T4 con fórceps romos y hacer una incisión en el músculo a lo largo de cada lado de las vértebras desde T6-T10. Hacer el corte cerca de las vértebras para hacer una apertura limpia y causar lesión mínima a los animales.
    4. Aislar cada individuo apófisis de T7 a T9 cortando los músculos y ligamentos entre T6 y T7, T7, T8, T8, T9 y T9 y T10 con una cuchilla #10.
    5. Utilizar una pinza para quitar cualquier músculo y los ligamentos en las láminas de T7 a T9. Quitar los músculos y ligamentos lateralmente como sea posible hasta que las diferencias entre los procesos transversales de T7 a T9 visibles.
    6. Quitar el T9 del proceso espinoso con una gubia. Mantener el proceso espinoso de T8 con fórceps romos y levantar suavemente para elevar la lámina de T9 a la pequeña abertura entre los procesos T9 y T10.
    7. Quitar la lámina a partir de la apertura y hacia rostral con una gubia en T9. Retire la lámina lateralmente tanto como sea posible; las raíces dorsales deben ser visibles después de la laminectomía.
    8. Una vez retirada la lámina, repita el proceso para T8 y T7.
      Nota: Durante la laminectomía, utilizar lanzas de absorción para eliminar sangre mientras continúa con la laminectomía. Si se presenta un exceso de sangrado, coloque una esponja comprimida en el sitio de sangrado y añada solución salina para ayudar a la coagulación de la sangre.
  3. Corte transversal de T8
    1. colocar el retractor alrededor de T7 a T9. Una vez que las láminas se retiran, asegúrese de que las brechas entre las apófisis transversas son visibles, especialmente en T8. También examinar los huesos a lo largo de la longitud en ambos lados entre T7 a T9 para no hay ningún fragmento de hueso que sobresale hacia el exterior.
      Nota: Esta brecha en T8 es importante para realizar la transección completa. Deben eliminarse las vértebras a lo largo de la longitud para facilitar la inserción conducto.
    2. Cortar el dorsal y raíces ventrales por encima y por debajo de T8 utilizando tijeras de primavera en ángulo. Añada solución salina a la médula espinal y esperar a que la sangre al coágulo.
      Nota: este paso es importante para la inserción del conducto apropiado.
    3. Colocar las tijeras del resorte angular por encima de la médula espinal en el espacio entre las apófisis transversas en T8 y hacer un corte para separar completamente la médula espinal. Coloque un pedazo pequeño de espuma comprimida en el espacio de 2-2.5 mm resultante y agregar inmediatamente solución salina a la zona.

3. Inserción del conducto

  1. espera de los tocones de cable cortado alcanzar la hemostasia, sacar un conducto de 1 x PBS. Trocear los triángulos de absorción fino largo y colóquelas en el conducto para eliminar el exceso PBS. Compruebe que las ventanas cortadas abiertas.
  2. Eliminar la solución salina y con finas piezas largas de triángulos de absorción de la sangre. Levante los dos tocones de médula espinal usando un microspatula para asegurar buena separación. Suavemente Levante la cepa rostral con el microspatula y deslice el conducto sobre el tocón con las ventanas frente a sí mismo. Garantizar que se introduce el muñón todo y no hay sangrado excesivo en el conducto.
  3. Suavemente el muñón caudal de Levante y deslice el otro extremo del conducto sobre el tocón. Asegúrese de que la cepa entera se inserta y las ventanas están en la superficie dorsal ( figura 2A).

4. Célula de Schwann / matriz inyectable (véase tabla de materiales) preparación e inyección

  1. esperando el cable cortado alcanzar la hemostasia, quitarlo del medio por encima de la pelotilla de GFP-SC (preparado en el paso 1.2). Resuspender el GFP-SCs en 10 μl de DMEM/F12 frío. Añadir 10 μl de frío gel inyectable a la suspensión de células y mezclar bien repite el pipeteo. Mantener la mezcla de matriz de GFP-SC DMEM/F12/inyectable en hielo hasta que se termine la inserción del conducto.
  2. Después de asegurarse que las ventanas en la superficie dorsal son abiertos ( figura 2A), inyectar 20 μl de la mezcla de matriz de GFP-SC DMEM/F12/inyectable en el conducto a través de uno de los windows corta 46 usando un inmunoblot carga de punta y una micropipeta. Si la mezcla de matriz SC DMEM/F12/inyectable debe sobrellenar el conducto, retirar el exceso con triángulos de absorción. Cerrar las ventanas después de la inyección; la sutura no es necesaria ( figura 2B).

5. Cierre y cuidados postoperatorios de la herida

  1. sutura del músculo capas y las capas de grasa superficiales. Limpiar la piel con etanol al 70% y luego grapa (por ejemplo, usando los clips de la herida) cierre de la piel. Mantener los animales en una incubadora térmicamente regulada hasta que recupere la conciencia. Transferencia de los animales en las jaulas. Suministrar agua con un tubo de alimentación a largo y colocar bolitas de comida en la ropa de cama para fácil acceso.
  2. Administrar buprenorfina (0.1 mg/kg de peso corporal) dos veces al día durante 3 días por vía subcutánea a partir inmediatamente después de la cirugía para reducir el dolor. Inyecte gentamicina (5 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea una vez al día por 7 días inmediatamente después de la cirugía para prevenir y reducir la infección. Inyectar 10 mL de solución de timbres entibiada por vía subcutánea dos veces al día por 7 días de hidratación.
  3. Vacío vejigas manualmente dos veces al día hasta vejiga función devuelve. Si se produce infección de la vejiga, luego administrar solución salina 10 mL por vía subcutánea hasta que la orina se vuelve claro. Si no mejora en dos días, inyecte gentamicina (5 mg/kg de peso corporal, una vez al día) por vía subcutánea hasta que la orina se vuelve clara.

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Resultados

El objetivo de la utilización de esta técnica quirúrgica es evaluar el uso de un tubo estructurado y matriz inyectable que maximiza la función SC después del trasplante en cuerdas de espinal transected terminados. Tres semanas después del trasplante, los animales son perfundidos con paraformaldehído al 4% y las columnas vertebral son groseramente disecadas y fijo en el mismo fijador por otro 24 h. Luego se diseca la médula espinal y las muestras para las secciones sagitales criostato se c...

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Discusión

El paso más crítico en la creación de un modelo de corte transversal eficaz es cortar la médula espinal en uno o dos cortes. Un 2-2.5 mm de espacio entre los tocones rostral y caudal de la médula espinal debe estar presente en el sitio de transección. Las tres razones más probables para tal espacio no aparece son (1) las raíces dorsal/ventral no se limpiaron adecuadamente, (2) la dura ventral no se elimina adecuadamente, o (3) el animal no fue colocado correctamente sobre el rodillo colocado debajo de ella.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias al Vector Viral y núcleos de animales en el proyecto Miami para curar parálisis para producir el lenti-GFP-virus y proporcionar cuidado animal, respectivamente y la histología y núcleos de proyección de imagen para el uso del criostato, microscopio confocal, y microscopio de fluorescencia con el investigador estéreo. La financiación fue proporcionada por NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) y NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge es el Christine E Lynn distinguido profesor de Neurociencias.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Viales criogénicosThermoFisher Scientific5000-0020
10 cm Placa de PetriVWR25382-428
Medio de Eagle modificado de Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12ThermoFisher Scientific11039-021"DMEM/F12" en protocolo.
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher Scientific15140-122"Pluma/Estreptococo" en protcol.
Suero fetal bovinoHycloneSH300-70-03"FBS" en protocolo.
Extracto de hipófisisBiomedical TechnologiesBT-215
ForskolinSigma-AldrichF6886
HeregulinR& D Systems396-HB/CF
Poly L-lisinaSigma-AldrichP2636"PLL" en protocolo.
Dulbecco's modificado Eagle mediumThermoFisher Scientific11965-092"DMEM" en protocolo.
Solución salina equilibrada de HankThermoFisher Scientific14170-112"HBSS" en protocolo.
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
Rata Fischer hembra (160-180g)Tijera Envigo
Vannas, rectaFST15018-10
KetaminaVedco Inc5098976106100 mg/ml
XilacinaLloyd IncAnaSed20 mg/ml
GentamicinaAPP Productos farmacéuticosNDC 63323-010-02Puede ser cualquier marca de elección.
Micro EspátulaFST10089-11Puede ser de cualquier marca de elección.
Las tijeras curvas con extremo romoFST14017-18pueden ser de cualquier marca de elección.
Pinzas romasFST11006-12Puede ser de cualquier marca de elección.
rongeurFST16121-14Puede ser cualquier marca de elección.
Tijeras de resorte en ánguloFST15006-09Puede ser de cualquier marca de elección.
Triángulos de absorciónFST18105-03Puede ser de cualquier marca de elección.
GelfoamHenry Schein9083300"Espuma comprimida" en protocolo.
#10 cuchillasSklar06-3010Puede ser de cualquier marca de elección.
MatrigelCorning354234"Matriz inyectable" en protocolo.
Anticuerpo antiproteína fluorescenteMillipore AB16901
ratón RT97 anticuerpo de hibridomaDSHBRT97
Anticuerpo anti-neurofilamento de conejoEncor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Conejo policlonal anticuerpo de proteína ácida fibrilar antiglialDakoZ033401
Alexa Fluor 488 cabra anti-pollo IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11039
Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11035
Alexa Fluor 647 cabra anti-conejo IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21244
Alexa Fluor 647 cabra anti-ratón IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21236
Microscopía ConfocalNikonclsi
verde

Referencias

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