Method Article

Evaluación de la función Microvascular del tejido adiposo humano mediante videomicroscopía

DOI:

10.3791/56079

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine and Whitaker Cardiovascular Institute, Boston University School of Medicine

In This Article

Summary

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Sistemas de videomicroscopía se utilizan para examinar propiedades funcionales de las arteriolas aisladas de tejido adiposo en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos. Esta técnica se puede utilizar para examinar fenotipos microvasculares en dominios diferentes de tejido adiposo en humanos obesos.

Abstract

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Mientras que la obesidad está estrechamente relacionada con el desarrollo de enfermedad metabólica y cardiovascular, poco se sabe sobre los mecanismos que rigen estos procesos. Se presume que mediadores pro-aterogénico de tejido graso especialmente en asociación con adiposidad central/visceral pueden promover cambios vasculares patógenos localmente y sistémicamente, y la idea de que la enfermedad cardiovascular puede ser la consecuencia de la disfunción del tejido adiposo sigue evolucionando. Aquí, describimos un método único de videomicroscopía que involucra el análisis de las respuestas de vasodilatador y vasoconstrictor de las arteriolas humanas pequeño intactas extraídas el depósito adiposo de seres humanos vivos. Videomicroscopía se utiliza para examinar propiedades funcionales de microvasos aislado en respuesta a estímulos fisiológicos o farmacológicos utilizando un sistema de presión que imita las condiciones de en vivo . La técnica es un método útil para comprender la fisiopatología y mecanismos moleculares que contribuyen a la disfunción vascular localmente en el medio del tejido adiposo. Por otra parte, alteraciones en la microcirculación del tejido adiposo también se han relacionado con enfermedades sistémicas. Aplicamos esta técnica para examinar las respuestas vasculares específicas de depósito en sujetos obesos. Se evaluó la vasodilatación dependiente del endotelio a aumento del flujo y de la acetilcolina en las arteriolas adiposas (50-350 μm de diámetro interno, 2-3 mm de longitud) aisladas de dos diferentes depósitos adiposos durante cirugía bariátrica desde el mismo individuo. Hemos demostrado que las arteriolas de la grasa visceral exhiben deterioro vasodilatación dependiente del endotelio en comparación con los vasos aislados del depósito subcutáneo. Los resultados sugieren que el microambiente visceral se asocia con disfunción endotelial vascular que puede ser relevante para la observación clínica a mayor adiposidad visceral a los mecanismos de la enfermedad sistémica. La técnica de videomicroscopía puede utilizarse para examinar fenotipos vasculares de diferentes depósitos de grasa, así como comparar los resultados a través de individuos con diferentes grados de disfunción metabólica y obesidad. El método puede utilizarse también para examinar las respuestas vasculares longitudinalmente en respuesta a las intervenciones clínicas.

Introduction

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Videomicroscopía es una técnica útil para examinar la función vasomotora de las arteriolas pequeñas de seres humanos vivos ex vivo. Nuestro laboratorio se ha centrado en la disección de pequeños microvasos de tejido adiposo diferentes compartimentos para caracterizar los efectos de varios microambientes adiposas en la microvascularización. Una gran ventaja de esta técnica es que los vasos sanguíneos extraídos del cuerpo humano funcionales y puede ser examinados fácilmente dentro de minutos a horas después de la biopsia. Condiciones fisiológicas son mímico y constante presión transmural en el espacio intraluminal a través de cánulas micro-vidrio que recapitular muchas características en vivo . 1 , 2 además, un montaje de videomicroscopía confiable con el software de detección de borde automática permite evaluación cualitativa y cuantitativa de capacidad de vasodilatador y vasoconstrictor dependiente de endotelio - independiente y de aislados Barcos en tiempo real, que permite rápida evaluación fisiológica en respuesta a estímulos físicos y farmacológicos. 3 otras técnicas microvasculares también están disponibles como alambre miografía que tiende a ser mucho menos tiempo y medir las respuestas de tensión a varios agonistas por un transductor de fuerza.

Nuestro laboratorio ha aplicado videomicroscopía para examinar la relación entre obesidad y disfunción vascular, centrándose en los efectos de los dominios diferentes de tejido adiposo en la vasculatura. Adiposidad central con acumulación de grasa visceral abdominal ha estado más estrechamente vinculada a la producción de adipocitoquinas, disfunción metabólica y riesgo cardiometabólico. Se ha postulado que la disfunción del tejido adiposo con exceso de producción de disregulación de citocinas y adipoquinas pro-aterogénico están fuertemente implicados en estos procesos, pero moléculas reguladoras específicas y los objetivos del tratamiento siguen siendo en gran parte sin descubrir. 4 por otra parte, en el nivel local del tejido adiposo, rarefacción capilar y alteración de la perfusión se han relacionado con tejido adiposo pseudohypoxia y dysregulation metabólico. La hipótesis de que la enfermedad cardiovascular puede ser la consecuencia de la disfunción del tejido adiposo está evolucionando. Pro-aterogénico mediadores liberados de la grasa, particularmente en asociación con adiposidad central/visceral, probablemente promueven la disfunción endotelial y patógenos cambios vasculares que se pueden manifiestan localmente en la vasculatura adiposa y detectan mediante la Aquí se describe la metodología. 5

La evaluación funcional de las arteriolas aisladas del tejido adiposo es un enfoque útil para comprender la fisiopatología y mecanismos moleculares que contribuyen a la disfunción vascular en la obesidad humana. Para investigar los mecanismos que contribuyen a la disfunción específicos de depósito de grasa, se han desarrollado métodos para examinar dependiente del endotelio y - independiente respuestas vasodilatadoras de la microvascularización y evaluar la expresión de diversos regulatorios candidatos en muestras pareadas de visceral y subcutáneas (SC) tejido graso obtenidos de sujetos obesos en el momento de la cirugía bariátrica.

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Protocol

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el protocolo y los ejemplos aquí descritos fueron aprobados por Boston University escuela de medicina Junta de revisión institucional (IRB, protocolo #H-25644) y se llevaron a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki. Todos los temas siempre el consentimiento informado escrito antes de la participación.

1. preparación de soluciones y cánulas Micro-vidrio

  1. Prepare la solución de 4-2-hydrosyethyl-1--1-ácido solución salina ácida (HEPES). Para 1 L, disolver 8,059 g NaCl, 0,298 g KCl, 0,296 g de MgSO 4 • 7 H 2 O, 0,235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0.16 g KH 2 PO 4, 0.01 g EDTA, 1,081 g D glucosa y 2,383 g HEPES ácido en 950 mL de desionizada agua. Enrasar a 1 L con agua desionizada. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Buffer HEPES se puede almacenar 7 días a 4 ° C.
  2. Preparar el 20 x acción tampón salino. Para 1 L, agregar 143,8 g NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g de MgSO 4 y 7.4 g CaCl 2 • 2 H 2 O en 900 mL de agua destilada. Completar volumen a 1 L con agua desionizada. Almacene la solución a 4 ° C.
  3. Preparar el 20 x existencias. Para 1 L, agregar 26,8 g NaHCO 3 y 0,2 g EDTA·2H 2 O en 900 mL de agua desionizada. Completar volumen a 1 L con agua desionizada. Almacene la solución a 4 ° C.
  4. Prepara la solución de KREBS para ser utilizado en los experimentos fisiológicos. Para 1 L, agregar 50 mL de 20 x existencias, 900 mL de agua desionizada, 50 mL de solución salina tampón, 0,99 g D-glucosa de 0.16 g KH 2 PO 4 20 x. Ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico. Para mantener el pH del buffer, revuelva constantemente y cubrir con parafina o burbuja continuamente.
    1. Cheque el pH cada 20 minutos hacer la solución de KREBS fresco diario.
  5. Hacer vidrio micro cánulas de un diámetro interior de 40-240 μm utilizando un extractor de aguja/pipeta disponible comercialmente. El tamaño de las cánulas de vidrio se determina por el tamaño del diámetro interior de los vasos sanguíneos aislados (50-350 μm). Como alternativa, comprar cristal micro cánulas del tamaño predeterminado de.

2. Preparación de reactivos

  1. preparar la acetilcolina (Ach, 10 -2 M, solución). Disolver 18,29 g en 10 mL de agua desionizada. Almacenar en alícuotas de 1 mL de solución madre (10 -2 M) a-80 ° C. En el día del experimento en serie diluir hasta obtener las siguientes concentraciones de trabajo: 10 -5 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.
  2. Preparar la papaverina (2 x 10 -2 M, solución). Disolver 0,07517 g en 10 mL de agua desionizada. Preparar 10 alícuotas de μl de la solución madre y conservar a -80 ° C. en serie diluir para obtener 10 -4 10 -5 10 -6, 10 -7, 10 -8 M en el día del experimento.
  3. Preparar la endotelina 1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, solución). Disolver 50 μg endotelina-1 en 1 mL de 1% BSA/PBS. Almacenar en alícuotas de 1 mL de solución madre (2 x 10 -5 M) a-80 ° C. En el día del experimento diluir hasta obtener una concentración de trabajo de 10 -10 M en el día del experimento.
  4. Almacenar reactivos en cualquiera de los dos-20 ° C o a-80 ° C según tipo de congelador disponible, pero no más de 6 meses.

3. Tejido adiposo y vasos preparación

  1. recluta hombres obesos y las mujeres (índice de masa corporal (IMC) ≥ 35 kg/m², edad ≥ 18 años) inscritos en el programa de cirugía bariátrica en el Boston Medical Center (BMC). Un total de 40 sujetos participaron en estos experimentos.
  2. Recoger muestras de tejido adiposo subcutáneo y visceral durante cirugías bariátricas planeadas por el cirujano realice la operación en.
    1. Cosecha el subcutánea adiposo tejidos de la pared abdominal inferior y visceral de grasa de mayor epiplón, respectivamente. Tamaño de la muestra de tejido adiposo típico varía de 3 a 10 mg de tejido.
    2. Lugar los tejidos inmediatamente frío HEPES buffer solución con un pH de 7.4 y almacenar a 4 ° C por 24 h.
      Nota: Además, adiposas arteriolas pueden obtenerse individuos lean durante otros tipos de cirugías tales como reparaciones de hernia o cirugía plástica y también puede ser hecho una biopsia del depósito subcutáneo mediante biopsia de la almohadilla de grasa abdominal trans cutánea < sup clase = "xref" > 6.
  3. Cuidadosamente usando un microscopio de disección de tejido, micro tijeras y pinzas de micro, quitar grasa y tejido conectivo circundantes de las pequeñas arteriolas adiposas (50-350 μm de diámetro intraluminal, 2-3 mm de longitud).
  4. Tie off todas las ramas de las arteriolas utilizando nylon pequeña o suturas de seda antes de canular en las pipetas capilares de vidrio. Disecar cuidadosamente las arteriolas ya incluso menor daño de la pared de la arteriola provoca cambios funcionales significativos.
    1. Minimice la exposición de recipiente a la luz y el calor ya que puede causar vasodilatación. Puesto que puede ser a veces difícil distinguir arteriolas vénulas, identificar el tono tamaño y músculo liso de los vasos por pellizcar las puntas de los vasos. Las arteriolas son generalmente más pequeñas y demostrar mayor tono en comparación con los venules.
  5. Preparar la cámara de órgano. Llene lentamente las pipetas capilares de vidrio y tubo de goma con solución de KREBS utilizando una jeringa de 10 mL.
  6. Una vez que se llena el tubo de goma y vidrio pipetas capilares están sumergidas en solución de KREBS dentro de la cámara de órgano, canule las arteriolas sobre las pipetas aseguradas y atar ambos extremos de la arteriola con nylon o nudos de sutura de seda cuidadosamente.
  7. Llenar la cámara de órgano con solución de KREBS hasta 2 mL.
  8. Garantizar la cámara de órgano a un escenario con el microscopio invertido (objetivo magnificación 10 X / 0.25) y cámara de video.
  9. Encender el software de detección de borde que se transmiten en tiempo real a una tasa de muestreo de 1 kHz (1 frame/s).
  10. Conectar un lado de la tubería a presión a la solución de KREBS presión llenado depósitos libre de burbujas, como las burbujas pueden introducir error experimental. Conecte el otro extremo de la tubería a presión a la cámara de órgano.
  11. Conectar los depósitos de presión de solución llenada de KREBS con el transductor de presión con un tubo limpio.
  12. Control de flujo intra-luminal mediante la regulación de la altura de estos dos embalses; así, cuando depósitos son colocados a la misma altura, no hay flujo intra-luminal ocurrirá.
  13. Una vez todos estos procesos, encender calefacción programa bloque y software para mantener la temperatura a 37 ° C. continuamente inundar el recipiente con solución de KREBS y airear con una mezcla de gas de 5% CO 2, 21% O 2 y 74% N 2 7 , 8 a lo largo de todo el procedimiento experimental.
  14. Para lograr la presión deseada inside la luz de los vasos aislados aumentar gradualmente la presión intraluminal (5 mmHg, cada 5 min) a través de la unidad de control de presión en el panel de interfaz mio, hacerlo a un ritmo lento para evitar el daño de la capa endotelial.
    Nota: Una vez que la presión alcance 60 mm Hg, un período de 20-30 min equilibrado es necesaria para estabilizar la nave. Se realizan todos los estudios de la función vascular en 60 mmHg y 37 ° C a pH 7,4. 7

4. Evaluación de la función Microvascular adiposo

Nota: en general, se puede produce vasodilatación endotelial dependiente de arteriola adiposo en respuesta a la fisiológica (fluir-inducido) y estímulos farmacológicos (inducida por Ach).

    1. La vasodilatación dependiente del endotelio, mediada por flujo después de presurización, registrar el diámetro de la arteriola grasa en reposo (Di). Esto se conoce como el diámetro basal reposo.
    2. Pre-constrict los vasos sanguíneos a ~ 55% del diámetro basal reposo (Dp) mediante la adición de 1 μl de endotelina-1 (ET-1, 10 − 10 M) directamente al baño y espere 5 minutos para el efecto. Repita este proceso hasta alcanzar el deseado ~ 55% previamente limitado estado.
    3. Después de la constricción, inducir flujo continuo en el espacio intraluminal de las arteriolas de tejido adiposo, en igualdad y direcciones opuestas de modo que una diferencia de presión puede ser desarrollada a través de la nave sin alterar la presión intraluminal media de 60 mm Hg.
      Nota: por ejemplo, si un depósito se mueve hacia arriba por 10 cm de altura, otro debe mover hacia abajo 10 cm para modificar los gradientes de presión y así cambiar flujo intramural. Si se desean más precisas mediciones de tasa de flujo, un sistema medidor de flujo cuantitativo se puede aplicar al montaje experimental.
    4. Medir la dilatación mediada por flujo de 3-5 min después de la iniciación de la inducción de flujo. Los niveles de flujo intramural (gradientes de presión) pueden ser en el rango de 0 - 100 cmH 2 O. aumentar cada incremento de gradiente de presión Δ10 cmH 2 O cada 5-6 min., hasta un máximo de 100 cmH 2 O.
      Nota: Para inducir el flujo laminar estable en el lumen, ambos tamaños de punta de cánula de vidrio tienen que estar muy cerca de diámetro interno de las arteriolas; de lo contrario, se produce flujo turbulento dentro del lumen e inducir errores de medición.
    5. Tras la evaluación del flujo-mediada por dilatación, devolver depósitos de presión a la misma altura (60 mmHg).
    6. Luego, arteriola y cámara de lavado quitando inmediatamente la solución de la cámara y reemplazar con la nueva solución de KREBS. Esto se hace con cuidado para no perturbar la arteriola suspendida dentro de la cámara de.
    7. Repetir este proceso 3 - 4 veces durante 20-30 minutos, o hasta que el buque aislado devuelve al diámetro basal reposo.
  2. Vasodilatación mediada por acetilcolina, dependiente de endotelio,
    1. cuando la arteriola adiposa ha vuelto al reclinación diámetro basal, la constricción vasos ~ 55% mediante la administración de endotelina-1 (ET-1, 10 − 10 M) directamente a la bañera, como se describe anteriormente en la sección 4.1.2.
    2. Después de la constricción, secuencialmente administrar dosis crecientes (2 μL) de la acetilcolina que es un receptor-medió, óxido nítrico agonista (Ach 10 -9 a 10 -5 M) directamente a la bañera. Registrar el cambio en el diámetro arteriolar 5 min después de la administración de cada dosis.
    3. Una vez que el buque ha llegado a una meseta después de la administración de la dosis final de Ach, lave el vaso 3 - 4 veces con solución de KREBS. Permitir que 20-30 min para el recipiente recuperar y devolver al diámetro basal de reposo. Para ayudar a mantener el pH en la comba de órgano, cambiar solución de KREBS cada 15 minutos
  3. Incubar la arteriola con N w - nitro - l-éster metílico de arginina (L-NAME, 10 -4 M), un inhibidor de la óxido nítrico sintasa por 30 min y luego repetir 4.2.1 y 4.2.2 caracterizar la contribución relativa de el óxido nítrico a la vasodilatación mediada por Ach.
  4. Evaluar la vasodilatación independiente del endotelio (función del músculo liso vascular) y la viabilidad de buque por una administración secuencial de dosis creciente de la papaverina (10 -8 a 10 -4 M) directamente a la bañera. Si el diámetro del vaso no volver a, o exceden el diámetro inicial (Di) descanso en respuesta a la papaverina (es decir, vasodilatación apropiada), considerar que el buque no viables y descartar los puntos de datos.

5. Análisis de datos y cálculo

  1. calcular la reactividad vascular. Uso de vasodilatación por ciento para la expresión de datos representan diferencias basales diámetro del vaso y calcular mediante la siguiente ecuación:
    % vasodilatación = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
    donde DT es el diámetro registrado en un momento determinado (máximo diámetro), Dp es el diámetro registrado después de la adición del agente de vasoconstricción (es decir. ET-1 inducida por el diámetro de la constricción), y Di es el diámetro inmediatamente antes de la adición del agente de vasoconstricción (descanso diámetro basal). 9
  2. definir sensibilidad de vasodilatación y vasoconstricción (dosis-respuesta) a un agonista como la concentración de Ach, papaverina o ET-1 que provoca el 50% de la máxima respuesta (CE 50) que puede ser definido por un parámetro sigmoidal y trazada, como se describió anteriormente. 10
    Nota: los estudios de reproducibilidad interobservador de la vasodilatación de microvessels del adiposa tiene un coeficiente de correlación alto (CC) de 0,99 (n = 10 experimentos de buque) en nuestro laboratorio.

6. Análisis estadístico

  1. Express continua mediciones como la media ± SEM. Estos tienden a distribuirse normalmente. Analizar la reactividad vascular en arteriolas adiposas por medidas repetidas ANOVA dos vías.
  2. Por otra parte, comparar el área bajo la curva (AUC) de la parcela para vasodilatación acumulativa dosis-respuesta entre grupos de tratamiento. En todos los casos, considerar P < 0.05 estadísticamente significativa.

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Results

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Nuestro laboratorio ha utilizado videomicroscopía examinar dependiente del endotelio y - vasodilatación independiente, así como función vasoconstrictoras de tejido adiposo arteriolas aisladas de grasa subcutánea y visceral de los seres humanos obesos. El montaje experimental característica se muestra en la figura 1A. Tejido adiposo arteriolas están suspendidas entre dos pipetas capilares de vidrio y aseguradas en su lugar con suturas dentro de la cámara de ór...

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Discussion

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La disección y aislamiento de las arteriolas adiposas de los tejidos circundantes pueden ser un proceso desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva con atención al detalle y protocolo técnico. El procedimiento de microdisección requiere habilidades meticulosas y utensilios especializados la disección para evitar posibles daños en el músculo liso o endotelial celular capas de la microvascularización. Incluso pequeñas punciones accidentales en la pared arteriolar pueden prevenir presión intraluminal y resultados en u...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autores no tienen revelaciones o conflictos de interés al informe.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a los voluntarios por su participación en estos estudios y el personal quirúrgico en el Boston Medical Center para proporcionar las biopsias de tejido adiposo. Dr. Gokce es apoyado por los institutos nacionales de subvenciones de salud (NIH) HL081587, HL114675 y HL126141. Dr. Farb es apoyado por los NIH grant HL135394 K23.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nombre químico
AcetilcolinaSigma AldrichA6625
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma Aldrich223506
D-(+)-GlucosaSigma AldrichG5767
Endotelina-1Sigma AldrichE7764
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA)Sigma AldrichE3889
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma AldrichE9884
HEPESSigma AldrichH3784
Nw-nito-L-arginina clorhidrato de éster metílico SigmaAldrichN5751
Sulfato de magnesio (MgSO4)Sigma AldrichM7506
Cloruro de potasio (KCL)Sigma AldrichP3911
Fosfato de potasio (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
PapaverineSigma AldrichP3510
Bicarbonato de sodio (NaHCO 3 )Sigma AldrichS6014
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma AldrichS7653
Fosfato de sodio monobásico monohidratado (NaH2Po4)Sigma AldrichS9638
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipment
agujas/pipetasDavid Kopf Instruments720
Especialidades quirúrgicasA7756N
TijerasFinescience tools150000-08
Cámara de vasosDMT VASv.2.1
Forceps Finescience tools 15000-08 Microscopio invertido Zeiss Achromat Tubo de laboratorio Euro-Pharm 250100306F999 Extractor de Sutura de nailon monofilamento oftálmico

References

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