Un sistema híbrido modificado de levadura-uno para estudios de interacción de ADN complejo-proteína heterotérica

Resumen

El ensayo de un híbrido de levadura modificado descrito aquí es una extensión del ensayo clásico de levadura híbrida (Y1H) para estudiar y validar la interacción heteromérica de complejo de proteína-ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio de genómica funcional.

Resumen

A lo largo de los años, el ensayo híbrido de levadura ha demostrado ser una técnica importante para la identificación y validación de interacciones físicas entre proteínas tales como factores de transcripción (TFs) y su diana de ADN. El método presentado aquí utiliza el concepto subyacente de la Y1H pero se modifica adicionalmente para estudiar y validar los complejos de proteínas que se unen a su ADN diana. Por lo tanto, se denomina el ensayo de hibridación de hongo de levadura modificado (Y1.5H). Este ensayo es rentable y puede realizarse fácilmente en un entorno de laboratorio regular. Aunque utilizando un sistema heterólogo, el método descrito podría ser una valiosa herramienta para probar y validar el complejo de proteína heteromérica que se une a su (s) diana (s) de ADN para genómica funcional en cualquier sistema de estudio, especialmente genómica de plantas.

Introducción

En general, para comprender las interacciones proteína-ADN, el ensayo Y1H es el sistema preferido utilizado con éxito en un entorno de laboratorio ¹ . El ensayo Y1H básico implica dos componentes: a) un constructo reportero con ADN de interés clonado con éxito aguas arriba de un gen que codifica una proteína reportera; Y b) un constructo de expresión que generará una proteína de fusión entre el TF de interés y un dominio de activación de transcripción de levadura (AD). El ADN de interés se conoce comúnmente como "cebo" mientras que la proteína de fusión se conoce como "presa". En años anteriores, se han desarrollado versiones múltiples d....

Protocolo

1. Construir y preparar la preparación del plásmido

1. PCR amplificar las regiones promotoras / fragmentos (preferiblemente ~ 250-500 pb) del ADN diana para ser analizados para la clonación adicional en el vector de entrada usando E. coli (TOP10).
2. Tras la confirmación de la secuenciación, subclona el clon positivo en un vector de expresión pGLacZi compatible ⁷ como se describió anteriormente ^{8 , 9 , 10 , 11} .
3. Transformar la cepa de levadura para la integración del promotor (....

Resultados

El procedimiento general de preparación de la placa para la co-transformación de regiones de ADN en las células de levadura con la proteína de interés ( Figura 2 ). La configuración de la placa puede modificarse de acuerdo con la necesidad del experimento y el número de regiones / fragmentos de ADN probados. Después del día 5 del protocolo, una placa bien crecida y positiva debe ser visible como en la Figura 3 . En nuestro estud.......

Discusión

El procedimiento estándar de Y1H existente es adecuado para identificar una presa de proteína única que se une a su cebo de ADN. Con varias modificaciones técnicas, el sistema existente ha sido aprovechado para definir las redes reguladoras transcripcionales. Sin embargo, se sabe que los TF funcionan como una parte de complejos que implican dos o más TF o proteínas, con sólo algo de TF capaz de unirse al ADN. Las proteínas o TFs que poseen sólo los dominios de unión a proteínas y carecen de la capacidad para unirse al A.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pDEST22 vector	Invitrogen	PQ1000101	Pro-Quest Two kit de sistema híbrido
pDEST32delatDBD	Invitrogen	PQ1000102	Pro-Quest Two kit de sistema híbrido; este vecor está modificado. Es pDEST32 menos la unión al ADN Dominio
pENTR/D-TOPO Kit de clonación	Invitrogen K240020
YM4271 Cepa	Clontech	K1603-1	MATCHMAKER Sistema Híbrido
Único pEXP-AD502	Invitrogen	PQ1000101	Pro-Quest Kit de sistema híbrido
Dos GATEWAY LR Clonasa II mezcla de enzimas	Invitrogen	11791020
YPDA	medios Clontech	630410
SD-Agar	Clontech	630412
SD medios mínimos	Clontech	630411
Uracilo DO	Suplemento Clontech	630416
Triptófano Do	Clontech	630413
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1
EDTA	Fisher Scientific	S311-500
LiAc	Sigma-Aldrich	L4158
Saplmon Esperma (10mg/ml)	Invitrogen	15632011
Placa de fondo redondo de 96 pocillos	Greiner bio-one	650101
PEG3350	Sigma-Aldrich	1546547
bloque de pozos de 96 pulgadas de profundidad	USA Scientific	1896-2000
Lámina sellable	USA Scientific	2923-0110
Araseal	Excel Scientific	B-100
2-mercaptoetanol	Fisher Scientific	034461-100
ONPG	Sigma-Aldrich	73660
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223484
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139
KCL	Fisher Scientific	BP366-500
MgSO4	Sigma-Aldrich	83266
HCL	Fisher Scientific	SA54-4
Baño seco	Thermo Fischer
Voretx	Thermo Fischer
	Centrífuga Eppendorf	5810R Lector de
placas	Dispositivo		SPECTRAMAX PLUS Espectrofotómetro
de microplacasIncubadora	Thermo Fisher	Modelo No. 5250- 37 grados, 6250-30 grados
Incubadora agitadora	New Brunswick
Baño de agua	Thermo Fisher	IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn	BD Falcon Falcon
	Vaso de precipitados Nalgene
Matraz	Nalgene
Petriplacas (150mm)	Greiner bio-one

molecular