Artículo de método

Una guía para la producción, cristalización y determinación de la estructura de IKK1/α humano

DOI:

10.3791/56091

⸱

2 de noviembre de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IκB cinasa 1/α (CHUK IKK1/α) es una Ser/Thr quinasa que participa en un sinnúmero de actividades celulares principalmente a través de la activación de factores de transcripción NF-κB. Aquí, describimos los principales pasos necesarios para la producción y determinación de estructura cristalina de esta proteína.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una clase de estímulos extracelulares requiere activación de IKK1/α para inducir la generación de una subunidad de NF-κB, p52, por medio del procesamiento de su precursor p100. p52 funciona como un homodímero o un heterodímero con otra subunidad de NF-κB, RelB. Estos dímeros a su vez regulan la expresión de cientos de genes implicados en la inflamación, la supervivencia de la célula y ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente asociado con IKK2/β y NEMO como un complejo ternario. Sin embargo, una pequeña piscina de la también se observa como un complex(es) de bajo peso molecular. Se desconoce si la actividad de procesamiento de la p100 es desencadenada por la activación de IKK1/α dentro del más grande o la más pequeña piscina complejo. Actividad constitutiva de IKK1/α se ha detectado en varios tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias. Para entender el mecanismo de activación de IKK1/α y permiten su uso como una diana farmacológica, expresamos IKK1/α recombinante en diferentes hosts, como e. coli, insectos y células de mamíferos. Hemos logrado expresar IKK1/α soluble en baculovirus infectan células de los insectos, obtener cantidades de mg de proteína de alta pureza, cristalización en presencia de inhibidores y determinar su estructura de cristal de rayos x. Aquí, describimos los pasos detallados para producir la proteína recombinante, su cristalización y su determinación de estructura cristalina por rayos x.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Actividades transcripcionales de la familia del NF-κB de factores de transcripción dimérico son necesarias para diversas funciones celulares que van desde la inflamación y la inmunidad a la supervivencia y muerte. Estas actividades son rigurosamente controladas en las células y una pérdida de regulación conduce a diversas condiciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunes y cáncer1,2,3. En la ausencia de un estímulo, la actividad de NF-κB se mantiene inhibida de proteínas IκB (inhibidor de - KB)4. La fosforilación de residuos de Ser específicos en proteínas IκB marca por ubiquitinación y degradación proteasomal posterior o procesamiento selectivo5. Dos quinasas Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β y IKK1/α, actúan como reguladores de la central de actividades de NF-κB por llevar a cabo estos eventos de fosforilación6,7.

Interacción entre un ligando y un receptor transmite una señal a través de una serie de mediadores que conducen a la activación de factores NF-κB. El proceso de señalización de NF-κB se puede clasificar ampliamente en dos distintas vías – canónico y no canónico (alternativa)8. La actividad de IKK2/β regula principalmente la señalización de NF-κB de la vía canónica que es esencial para la respuesta inmune inflamatoria y naturales9. Una característica distintiva de esta vía es una activación rápida y de corta duración de IKK2/β10 dentro de un complejo de IKK desacostumbrado hasta entonces bioquímicamente — se presume para ser compuesto de IKK1 IKK2, como un componente regulatorio, NEMO (modulador esencial de NF-κB )11,12,13. Entre las dos subunidades catalíticas de IKK del complejo IKK, IKK2 es sobre todo responsable14 para la fosforilación de los residuos específicos del prototipo IκBs (α, - β y γ-) unido a NF-κB y también una proteína anormal de IκB, NF-κB1/p105, que es un precursor de la de subunidad p50 de NF-κB5. La fosforilación inducida por ubiquitinación y degradación proteasomal de IκB (o procesamiento de p105) conduce a la liberación y activación de un conjunto específico de NF-κB dímeros15. Actividad de NF-κB aberrante debido a función mal regulada de IKK2 se ha observado en muchos tipos de cáncer, así como en trastornos autoinmunitarios2,3,16.

A diferencia de IKK2/β, actividad de IKK1/α regula la señalización de NF-κB de la vía no canónica, que es esencial para el desarrollo y la inmunidad. IKK1 fosforila residuos específicos de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ, que conduce a su transformación y la generación de p52. La formación del heterodímero p52:RelB transcripcionalmente activo inicia una lenta y sostenida ante las señales del desarrollo7,17,18,19,20. Curiosamente, la generación de la central p52 de factor NF-κB de esta vía es críticamente dependiente de otro factor, cinasa de la inducción de NF-κB (NIK)21,22, pero no en IKK2 o NEMO. En las células de reclinación, el NIK sigue siendo bajo debido a su constante degradación dependiente del proteosoma23,24,25. Sobre el estímulo de las células por ligandos 'no canónico' y en ciertas células malignas, NIK se convierte estabilizado para reclutar y activar IKK1 / α. actividades quinasa de NIK y IKK1 son esenciales para la transformación eficiente de p100 en p527. IKK1 y NIK fosforilan tres serinas (Ser866, 870 y 872) de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ a su procesamiento y la generación de p52. Activación aberrante de la vía no canónica se ha implicado en muchas neoplasias como mieloma múltiple26,27,28.

Se conocen varios inhibidores altamente eficientes y específicos de IKK2/β, aunque ninguno hasta ahora han resultado para ser un fármaco efectivo. Por el contrario, los inhibidores específicos de IKK1/α son escasos. Esto puede deberse en parte a la falta de información estructural y bioquímica de IKK1/α, que limita nuestra comprensión de la base mecanicista de la activación de NF-κB por IKK1 en las células y el diseño racional de medicamentos. Las estructuras de rayos x de IKK2/β nos proporcionan penetraciones en el mecanismo de activación de IKK2/β29; sin embargo, estas estructuras no podían revelar cómo los diferentes estímulos arriba activar activación de IKK1/α o β/IKK2 regular conjuntos distintos de NF-κB actividades 30,31. Entender las bases mecanicistas subyacentes a la función de señalización distintiva de IKK1/α y para establecer una plataforma para el diseño racional de medicamentos, nos enfocamos en determinar la estructura de IKK1/α.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparación de Virus recombinante adecuado para la expresión a gran escala de IKK1/α

  1. Preparación de virus de P1 32
    1. Día 1: Las células Sf9 placa (~ 6 X 105) (paso número menos de 10) en 2 mL de medio de insectos celular de III Sf900 en cada pozo de una placa de 6 pozos e incubar a 27 ° C. Las células de paso al llegar a una densidad de 2 a 3 X 106 células / mL en suspensión diluyendo en medio fresco con una densidad de ~ 6 X 105.
    2. Día 2: Diluir 8 μl de reactivo de transfección Sf9 en 100 μl de medio de insecto Sf900 III o de gracia sin antibiótico y suero. Vortex brevemente.
    3. Diluir 1 μg de bacmid recombinante purificada kit (los detalles se proporcionan en 'Resultados del representante')32 en otro 100 μl del medio mismo, en un tubo separado.
    4. Combinar ADN diluido y el reactivo de transfección (μL volumen total ~ 210-220) e incube a temperatura ambiente durante 15-30 min.
    5. Retire el medio del pozo. Añadir 1 mL de medio fresco sin antibióticos y suero.
    6. Agregar la mezcla de reactivo de transfección de ADN diluida gota a gota en las células. Ajustar el tamaño de gota que Desaloje las células adherentes.
    7. Después de ~ 6 h, agregar 1,5 mL de medio fresco en la parte superior o quitarlo del medio y añadir 2,5 mL de medio fresco. Cálido medio fresco a 25-27 ° C antes de la adición.
    8. Incubar las células en 27 ° C. Compruebe los pozos periódicamente cada h ~ 12 signos de la infección viral. Llevar a cabo todos los mantenimiento Sf9 y expresión a 27 ° C.
    9. Día 5: Extraer el medio que contiene la infección de células 60-72 h post. Centrifugar durante 5 minutos a 500 x g a 4 ° C. Guarde el sobrenadante; se trata de la acción P1-virus. Congelación de pequeñas alícuotas a-80 ° C.
  2. Selección de la mejor expresión de clone de virus de P1.
    1. Células de la placa del mismo modo como se describe en el paso 1.1.
    2. Siguiente día o ~ 6 h post chapado, añadir 20 μl y 50 μl de los diferentes stocks de clon P1 virus en las células en diferentes pozos.
    3. Desalojar las células adherentes mediante pipeteo suave y cosecha la infección de las células infectadas 60-72 h post por centrifugación durante 5 min a 500 x g a 4 ° C. Guarde el sobrenadante. Se trata de la acción de virus P2. Almacenar pequeñas alícuotas del stock a-80 ° C.
    4. Añadir 100 μl de buffer de x Laemmli SDS 2 al precipitado de células cosechadas. Calor en > 95 ° C durante 10 minutos la centrifugadora (típicamente > 10.000 x g) durante 5 minutos.
    5. Ejecutar 10-15 μl de cada muestra en 8-10% SDS-PAGE en 120-160 V hasta que el frente de tinte alcanza la parte inferior del gel.
    6. Electro-transfiera las proteínas resueltas por estándar semi seco transferencia protocolo (20 V, 30 a 45 min.) sobre una membrana de nitrocelulosa/PVDF.
    7. Blot con anticuerpos anti-IKK1 (dilución ~ 1:2, 000, debe ser optimizada) o anticuerpos anti-PentaHis (dilución ~ 1:3, 000, debe ser optimizada) para la expresión.
    8. Elegir el mejor clon de virus P1 comparando la expresión de IKK1 recombinante.
  3. Preparación de la acción de virus de P3 a gran escala.
    1. Células de la placa semejantemente como se describe en el paso 1.1 en una placa de 15 cm que contiene 25-30 mL de medio de Sf900 III.
    2. ~ 6 h post chapado, añadir 150-300 μL del stock de virus P1 mejor expresión en las células.
    3. Después de 72 h post infección, aspirar el medio cuidadosamente de la placa en un tubo adecuado (estéril) y centrifugar el tubo a 500-1000 X g por 10 min a 4 ° C. Descarte el precipitado de células (si uno es formado) y guarde el sobrenadante. Se trata de acciones de virus P3.
  4. Determinar el título de virus óptima para la expresión de proteínas a gran escala
    1. Células en 2 mL de medio de Sf900 III, como se describe en 1.1, en una placa de 6 pozos en la placa.
    2. Añadir 20, 30, 40 y 50 μl de P3 stock de virus en separado pozos ~ 6 h post chapado. Incluir un control no infectado.
    3. Cosechar las células de cada infección de post bien 48-60 h.
    4. Añada 100 μl de Tampón Laemmli SDS de X 2. Calor en > 95 ° C durante 10 minutos, centrifugar (típicamente a 14.000 x g) durante 5 minutos.
    5. Resolver 10-15 μl de cada muestra en un gel de SDS-PAGE 8-10%.
    6. Transferencia de proteínas resuelta a una membrana de nitrocelulosa/PVDF como se menciona en 1.2.6.
    7. Blot con anticuerpos anti-IKK1 (dilución ~ 1: 2000, debe ser optimizada) o anticuerpos anti-PentaHis (dilución ~ 1: 3000, debe optimizarse).
    8. Usar el virus con el mejor expresar el título de expresiones de gran escala.

2. escala expresión de 6 x su etiquetado IKK1 humana29,33

  1. Llevar a cabo la expresión a gran escala en una cultura de la suspensión. Dividir celdas en 1 L de medio Sf900 III en un matraz de Erlenmeyer de 2 L con tapa de ventilación. La densidad de células debe ser ~ 5 x 105 células/mL.
  2. Crecer estas células en suspensión a ~ 100 rpm a 27 ° C en un agitador durante 2 días hasta alcanzar una densidad de 1-2 x 106/ml. Densidad celular no debe exceder 2 x 106/ml.
  3. Agregue la cantidad deseada de virus P3, evaluada en 1.4.
  4. Crecer la cultura infectada por 48-60 h a ~ 100 rpm a 27 ° C en un agitador.
  5. La cosecha de las células por centrifugación a < 1.500 x g a 4 ° C.
  6. Guarde el precipitado de células y descartar el medio.
  7. Proceder a la purificación de la proteína directamente. Flash freeze el precipitado de células en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C para su uso futuro.

3. purificación de su IKK133

  1. El día 1, Resuspender el precipitado de células en 40 mL de tampón de lisis (25 mM Tris, pH 8.0, de 0.2% NP-40, 200 mM NaCl, imidazol de 10 mM, 10% glicerol, 5 mM β-mercaptoetanol y cóctel del inhibidor de la proteasa).
    Nota: El líquido precipitado masa no fue determinada. Por lo general, L ~ 2 de cultura fue utilizado para este paso.
  2. Lyse las células por sonicación en ciclos de trabajo de 60-70%, 5-10 pulsos de 30 duración de s en un intervalo de > 1 minuto, manteniendo la suspensión de células enfriada en hielo.
    Nota: Este paso requiere optimización con cada modelo del sonicador. No permita que la muestra caliente por encima de 10 ° C.
  3. Aclarar el lisado por centrifugación a ≥ 28.000 x g durante 45 minutos a 4 ° C.
  4. Equilibre los 4 mL de agarosa Ni-NTA resina con tampón de lisis y mezcla el clarificado lisado (sobrenadante) siguiendo el protocolo del fabricante.
  5. Permiten que la proteína atar la resina por incubar por 2 h en un mezclador rotatorio en una habitación de 4 ° C.
  6. Lave bien la resina con el tampón de lisis que contienen imidazol de 30 mM. Compruebe la concentración de proteína en la fracción de lavado periódicamente con análisis de Bradford. Lavar hasta que la concentración de proteína en la fracción de lavado llega a 0.1 mg/mL. Generalmente > 20 volumen de cama de tampón de lavado es necesaria para llegar a este punto.
  7. Eluir la proteína de su etiquetado IKK1/α bajo flujo por gravedad, utilizando 20 mL de tampón de elución (el tampón de lisis que contienen imidazol de 250 mM). Recoger fracciones de 1-1.5 mL.
  8. Compruebe la pureza de proteínas eluídas en un gel de SDS PAGE 8 o 10% por la carga de 5-10 μL de muestra de todas aquellas fracciones mezclados con Tampón Laemmli.
  9. Piscina fracciones de pico (concentración ≥ 2mg/mL) y medir la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford.
  10. Digestión con TEV (1:30-50 (TEV proteasa: IKK1)) proteasa durante la noche (≥12 h) a 4 ° C.
    Nota: Optimizar la cantidad de proteasa TEV necesario para completar la digestión (≥ 95%) del tag X su 6 a priori. Proteasa TEV fue purificada en casa.
  11. En la mañana del día 2, incubar la proteína, con 1 mM ATP en presencia de 20 mM de MgCl2, glicerofosfato-β de 20 mM, 10 mM NaF y 1 mM ortovanadato de sodio por 1 h a 27 ° C.
  12. Filtrar la solución de la proteína a través de un filtro de 0.45 o 0.22 μm.
  13. Carga de 6 mL de la muestra en una columna preparativa de exclusión de tamaño ~ 120 mL conectada a un sistema automatizado de la cromatografía líquida. Equilibrar la columna con tampón A (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% glicerol), previo a la aplicación de la muestra de proteína.
    Nota: Podría utilizarse una columna más pequeña dependiendo de la producción de la proteína después del paso de purificación Ni-NTA afinidad. Ajuste/calcular el volumen de la carga para ser el 5% de volumen de columna).
  14. Ejecutar la cromatografía por exclusión de tamaño en un caudal de 1 mL/min y monitorear la elución a 280 y 254 nm. Recoger fracciones de tamaño de 2 mL.
  15. Compruebe la pureza de las fracciones de pico (típicamente alrededor de ~ 60-70 mL) en un gel de SDS-PAGE 8-10%.
  16. Piscina las fracciones puras (pureza ≥ 95% con una concentración de ≥0.5 mg/mL) y se concentran en un kDa 10 o 30 kDa peso molecular de corte proteína centrífugos concentrador de oxígeno siguiendo las instrucciones del fabricante.
  17. Periódicamente Compruebe la concentración de proteína del concentrado por el método de Bradford y concentrar la muestra hasta 8-12 mg/mL.
  18. Dispensar 25 alícuotas μL y flash congelación en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras congeladas flashes en el congelador de-80 ° C.

4. pantalla para la condición de la cristalización de IKK1

  1. Calcular la cantidad total (en volumen) de la proteína necesaria para la pantalla de cristales siguiendo los métodos descritos a continuación.
  2. Probar diferentes inhibidores (inhibidores de la cinasa genérico: AMPPNP y estaurosporina; IKK-specific inhibidores: MLN120B, compuesto A y XII IKK-inhibidor) para realizar la proyección para la cristalización. Hacer soluciones de estos compuestos siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que la máxima concentración del compuesto en la solución no exceda de 20 μM.
  3. Preparar el IKK:inhibitor complejo para la pantalla de la cristalización de mezcla 100 μM de IKK1 con inhibidor μM 200 e incubar a 18-20 ° C por 30-40 min centrifugar esta mezcla en > 15.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Guarde el sobrenadante para pantalla de cristalización.
  4. Utilice las pantallas de cristalización comercialmente disponibles (véase la Tabla de materiales).
  5. Pipetee 80-100 μL de cada reactivo de la cristalización (soluciones de depósito), utilizando una pipeta multicanal o un robot, en el depósito de una placa de 96 pocillos. La placa está lista para configurar gotas. Asegúrese de que la placa contiene cristalización de 2 a 3 gotas para que inhibidores de 2 a 3 pueden ser examinados en una sola placa.
  6. Usando un robot de cristalización, dispensar y mezclar 0,2 – 0,25 μL de IKK1:inhibitor complejo con el mismo volumen de solución de reserva.
    Nota: Proyección puede realizarse manualmente con volúmenes de gota más grandes (0.5-1.0 μL de IKK1:inhibitor complejo con el mismo volumen de solución de depósito). Sin embargo, el uso de un robot ayudaría a ahorrar reactivos valiosos.
  7. Sellar las placas inmediatamente después de fijar las gotas con películas ópticamente transparente para evitar la evaporación. Sellar correctamente con aplicador apropiado. Hacer placas de réplica para cada conjunto de inhibidor. Incubar una placa en 18 ° C y el otro en la cámara fría (temperatura ~ 4 – 6 ° C). Asegúrese de que las incubadoras no son afectadas por vibraciones.
  8. Utilice un estereomicroscopio con un polarizador para verificar la aparición de cristales en cada gota cada día durante los primeros siete días y luego en intervalos más largos. Sistemáticamente en cuenta y anotar estas observaciones.
    Nota: Use un estereomicroscopio con un polarizador para que puedan evaluarse visualmente los defectos de crecimiento de cristales. Aquí, cristales aparecieron en una condición donde la solución de depósito contenía 3% w/v Dextran sulfato sódico sal Mr 5.000, 0.1 M pH BICINA 8.5, 15% p/v polietilenglicol 20.000. Cristales de IKK1 creció solamente en presencia de inhibidor de la IKK XII.

5. cristal crecimiento optimización29,33

  1. Preparación de soluciones madre.
    1. Preparar 30% w/v soluciones de sulfato de dextrán de diferente peso molecular (promedio MW 5.000, 8.000, 15.000, 40.000 Da) desionizada H2solución O. filtro 0,22 μm filtros.
    2. Preparar las acciones 1 M y 0,5 M de buffers diferentes en el rango de pH de 6.5 a 9. Filtro de 0,22 micras filtros soluciones.
    3. Preparar 25% o 50% (w/v) soluciones de PEG de diferente peso molecular (promedio MW:1000, 1.500, 3.350, 4.000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, 20.000 Da). Filtro de 0,22 micras filtros soluciones.
    4. Realizar una pantalla de la rejilla variando sistemáticamente pH, buffer tipo, concentración y tipo de clavija y sulfato de dextrano.
  2. Optimizar la proyección a 18 ° C tanto en la cámara fría (temperatura ~ 4-6 ° C).
  3. Mezclar una cantidad igual de la IKK1:Inhibitor complejo con solución bien e incubar en la solución bien en un ambiente sellado. Este paso puede realizarse manualmente o usando un robot de dispensación.
    Nota: Aquí, los cristales más grandes y bien definidos (según lo determinado por el color uniforme bajo el polarizador que indica un crecimiento uniforme) se obtuvieron las siguientes condiciones: 100 mM BisTris pH 7.0, 2.8-3.5% de sulfato de dextrano (promedio MW 15 kDa), 8.5-10% PEG 20 kDa en la cámara fría.

6. crecimiento de cristales en grandes cantidades

  1. Preparar las siguientes soluciones stock y filtrar a través de 0.22 μm filtro.
    1. Preparar BisTris de 0,5 M pH 7.0 y BisTris propano pH 7.0 y 7.5.
    2. Preparar el 30% (p/v) sulfato de dextrán (promedio MW ~ 15 kDa). Almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar 50% PEG (promedio MW ~ 12 kDa).
  2. Uso bien de 24 placas de gota colgantes.
  3. Aplique grasa sellante en los anillos de levantado de cada pozo.
  4. Preparar la solución bien como sigue (concentración final): 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2.8 – 3.5% sulfato de dextrán ~ 15 kDa, 8,5 – 10% PEG ~ 12 kDa. Preparar 1 mL de solución bien en tubos de 1,5 mL.
    Nota: Se observó una menor variación en condiciones de cristalización dependiendo de la cantidad de proteína, o sulfato de dextrano, así un ensayo de un margen estrecho es recomendable. BisTris y BisTris búferes de propano de la misma gama de pH producción de solos cristales.
  5. Mantener las soluciones bien y placas engrasadas en la cámara fría durante al menos 1 h.
  6. Preparar IKK1:Inhibitor complejo como se describe en 4.3. Transferir las soluciones bien de tubos de 1,5 mL a los pozos individuales de la placa de la pozo 24.
  7. Limpia siliconado (comercial o interno (siliconization/silanización)) vidrio cubreobjetos usando trapos libres de pelusa y aplicar chorros de aire de alta presión localizada con plumero aerosol disponibles en el mercado.
  8. Coloque 1 – 1,5 μL de solución bien en un cubreobjetos limpio. Pipeta un volumen igual de complejo de IKK1:inhibitor, mezcle suavemente mediante pipeteo arriba y abajo 3 - 4 veces. Gire el vidrio cubreobjetos y colocar en el respectivo bien con pinzas y sellar el pozo presionando en la grasa.
  9. Después de configurar todas las gotas de una placa de 24 pocillos, Incube la placa en la cámara fría en la oscuridad. Verifique ocasionalmente las gotas bajo un microscopio para el aspecto y crecimiento de cristales.
    Nota: no se ha sido probado si incubar las placas de cristal a la luz cambiaría el resultado. Sin embargo, es fundamental que las placas se incuban en un medio ambiente con la vibración mínima/no.

7. crio protección de cristales

  1. Preparación de soluciones de cryo.
    1. Preparar A Cryo (~ 2% Dextran Sulfato, ~ 10% PEG 12000, BisTris propano (del mismo pH la solución bien previsto), de 60 mM 5 mM Tris, pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 2.5% glicerol).
    2. Preparar B Cryo (~0.3% sulfato de dextrán, ~ 10% PEG 12000, BisTris propano (del mismo pH la solución bien previsto), de 60 mM 5 mM Tris, pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 20 o 25% glicerol o 20 o 25% glicol de etileno).
      Nota: Pruebe diferentes cryo-protectores además de glicerina y glicol de etileno (por ejemplo, PEG 400, PEG 200, PEG 1000, PEG MME 550).
  2. Suavemente Retire los cubreobjetos de vidrio que contiene el cristal y coloque sobre una superficie sólida con la gota de cristal hacia arriba. Suavemente agregar 10 μL de solución de Cryo A encima de la gota y suavemente mezclar mediante pipeteo para que no se toca el cristal.
    Nota: Esto limpia la superficie de cristal de escombros y ayudar a equilibrar el cristal con el buffer inicial crio. Evitar el estrés mecánico y térmico del cristal. Realice todos los pasos subsiguientes bajo el microscopio para evitar daños en el cristal.
  3. Lentamente retire un poco de líquido de cristal y mantener sobre 5-8 μL de la solución. Evitar la deshidratación del cristal. Tenga mucho cuidado para evitar estrés mecánico y deshidratación del cristal en todos los pasos posteriores.
  4. Suavemente agregar 2.5 – 4 μL de la solución de Cryo B sobre la gota, suavemente mezclar mediante pipeteo. Cubrir con una pequeña placa de Petri para evitar corrientes de aire sobre el cristal. Espere 5 minutos siempre asegúrese de que el cristal no sufre rápidos cambios de presión osmótica o la deshidratación.
  5. Repita el paso 7.4 cuatro veces para aclimatarse lentamente el cristal en la solución de cryo.
  6. Mantener 10-20 μL de la solución de crio en esta etapa (es decir, permitir que el cristal a ser bañado en un 20-25% solución con crio-protector). Remoje durante diferentes periodos de tiempo (5 min a 1 h) en el cryo-la solución final.
  7. Congelación de múltiples cristales en diferentes puntos del tiempo.
  8. Cuidadosamente escoge un solo cristal de la gota en un crio-bucle adecuado montado sobre una base adecuada y congelación de inmersión en líquido N2. Realizar este paso sin problemas y rápidamente para evitar la formación de hielo en el cristal.
    Nota: Escoger el cristal con un diámetro de lazo ligeramente más grande que el eje mayor del cristal por lo que puede ser montado en el goniómetro robótico utilizado en avanzada del fotón fuente, laboratorio nacional de Argonne.
  9. Almacenar el cristal que contiene bucles de crio en discos sumergidos en líquido N2. Guardar estos discos en líquido N2 matraz Dewar hasta que estén listos para su envío por difracción de rayos x en el sincrotrón. Proceder a la recogida de datos de difracción de rayos x y procesamiento (secciones 8 y 9).
    Nota: Datos de difracción de cristales IKK1 de casa fuentes de rayos x no fueron de resolución lo suficientemente alta para ensayos de determinación de estructura, aunque se indica la calidad de los cristales para ser proyectada en el sincrotrón. Todos los datos de difracción se recolectaron en diferentes líneas (principalmente 19ID) del avance del fotón fuente, laboratorio nacional de Argonne, Estados Unidos.

8. rayos x recolección de datos

  1. Recopilar datos de difracción de rayos x en la línea ID19 de la fuente del sincrotrón APS, con datos remotos colección software34.
    Nota: Más de 100 cristales fueron probados por sus propiedades de difracción. Los cristales difractada rutinariamente a una resolución de 7-11 Å, solamente raramente cristales difractada a más allá de 5 Å fueron observado y sólo un gran cristal difractado más allá de 4.5 Å. Puesto que los cristales decayeron rápidamente durante la recolección de datos, se recolectaron datos en diferentes partes del mismo cristal. Esto fue posible ya que los cristales eran grandes (mayor a 400 μm), y el diámetro de la viga utilizado fue 100 μm.

9. radiografía de procesamiento de datos

  1. Combinar los conjuntos de datos recogidos en diferentes partes del mismo cristal34.
    Nota: siete conjuntos de datos fueron combinadas de cristal mejor y los datos resultantes fueron 93% completado. El general fue de σ ~ 6.8) y Rmerge fue de 89% en el compartimiento de resolución más alta (4.5 5.4 Å).
  2. Conjuntos de datos de proceso con HKL200034 grupo espacio, dimensiones de la celda unidad, contenido solvente y plausible composición de la unidad asimétrica.

10. estructura solución

  1. Preparación de modelos de búsqueda
    1. Basado en modelos estructurales de hIKK2 (pdb id 4E3C y 4KIK35), genera una serie de dímeros con diferentes orientaciones del KD del N-terminal (que representa una apertura de 30 y 62 Å, entre P578 de dos KD en el dímero). Ninguno de estos modelos trae una solución de búsqueda de reemplazo molecular después de pruebas extensivas.
    2. Generar un mapa de IKK1 de la solo-partícula cryo-EM datos33.
    3. Generar un modelo de IKK1 humano de la más alta estructura de resolución de IKK2 (pdb id 4KIK).
    4. Muelle los dominios individuales del modelo humano de IKK1 en el crio EM mapa de densidad de IKK1 humano con FOCHA36. Esto gira la orientación de KD aproximadamente 24 grados y había modificado el N-terminal de apertura a ~ 58 Å.
    5. La orientación de KD del modelo cryo-EM equipada (monómero) se aplican a todos los dímeros en 10.1.1.
  2. Reemplazo molecular
    1. Uso de dímeros de 10.1.1 y 10.1.5 como modelos de búsqueda en programas PHASER37, MOLREP38 y39,de CNS40.
      Nota: Aquí, utilizando uno de los dímeros de 10.1.5 (52 apertura de Å) como un modelo de búsqueda, seis dímeros (dos hexamers) fueron situados en la unidad asimétrica utilizando MOLREP. El 52 Å en el modelo de búsqueda es similar a la apertura de Å de 49-50 de dímeros (todos seis dímeros) en la estructura refinada.

11. refinamiento de la estructura

  1. Procedimiento de refinamiento de estructura
    1. Fijar la orientación y posición de este modelo inicial por refinamiento de cuerpo rígido en el CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Refinar la estructura más lejos usando minimización y recocido simulado con una función de objetivo de máxima verosimilitud y rectificación plana a granel-solvente el CNS sistema39,40.
    3. Construir el modelo basado en 2FO-FC y Fo-Fc mapas usando Xtalview41.
      Nota: Se aplican DEN-asistida refinamiento42 y NCS restringir durante los refinamientos para mayor precisión del modelo. De hecho, refinamiento DEN mejoró dramáticamente geometrías y R-factores de la estructura y el factor R fue del 22.2% y factor R libre fue de 27,8% para el modelo final. La mejora dramática de la R libre debe ser debido al modelo de alta precisión de IKK1 dominios que se generaron a partir del modelo de IKK2 (4KIK).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clonación y expresión de diferentes construcciones de IKK1/α
Longitud total que ikk1/α humana fue clonada en el pFastBacHTa de vector de expresión de baculovirus en sus sitios de restricción EcoRI y NotI para obtener un N-terminal hexa-histidina tagged IKK1. La etiqueta podría ser quitada por la digestión de proteasa TEV. Longitud total IKK1/α contiene regiones flexibles en ambos extremos, y regiones flexibles generalmente representar una proteína difícil de cristaliza...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solución de producción, estructura y cristalización de dos proteínas relacionadas de IKK
Nos propusimos para determinar la estructura de cristal de rayos x de IKK1/α con la idea de que sería un ejercicio relativamente sencillo dado nuestra experiencia con la producción de proteínas, cristalización y determinación estructural de IKK2/β. Sin embargo, nos quedamos muy sorprendidos que estas dos proteínas relacionadas se comportaron muy diferentemente con respecto a la facilidad de cristalización. A pesar...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no intereses financieros que compiten u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al personal de las líneas 19ID, 24ID y 13ID en avanzada fuente de fotones, Lemont, Illinois, para apoyo en la recopilación de datos sobre varios cristales. Agradecemos a Dmitry Lyumkis, Salk Institute para nosotros obtener el mapa de cryo-EM de baja resolución en las primeras etapas del EM mapa/modelo del edificio, que fue utilizado para construir el modelo inicial de búsqueda de recambio molecular de IKK1. La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación de subvenciones de NIH AI064326, CA141722 y GM071862 a GG. SP es actualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin ahora está descontinuado, reemplazado por Cellfectin II
Sf900 III Medio celular de insectosThermo Fisher Scientific12658-027
Células SF9Thermo Fisher Scientific12659017
anticuerpo anti-IKK1Novus BiologicalsNB100-56704Vendido anteriormente por Imgenex
anti-PentaHis anticuerpoQiagen34460
membrana de PVDFMilliporeIPVH00010También se puede utilizar nitrocelulosa
Ni-NTA agarosaQiagen30210
Bradford reactivo de ensayoBioRad500001
Superdex 200 columnaGE Healthcare28989335
Concentrador AmiconMilliporeUFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compuesto ABayer
Calbiochem Inhibidor de IKK XIICalbiochem401491
StaurosporineSIGMAS4400
MLN120BMilleniumArtículo de regalo
AMPPNPSIGMAA2647
Sulfato de dextranoSIGMA51227, 42867, 31404,
Sulfato de dextranoAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172Algunos de ellos son nuevos Cat # en el catálogo de SIGMA. Lo que teníamos era originalmente de Fluka que tenía un gato # diferente.
Pantallas de cristalización:
Crystal Screen I y II (Crystal Screen HT)Hampton ResearchHR2-130
Index HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion y PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 y PEGRx 2 (PEGRx HT)Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 y SaltRx 2 (SaltRx HT)Hampton ResearchHR2-136
Monturas de cristalHampton ResearchHR8-188, 190, 192, 194
SincrotrónLa fuente avanzada de fotones (APS) en el Departamento de Energía de EE. UU. s Línealuz 19 delLa fuente avanzada de fotones (APS) en el Departamento de Energía de EE. UU. El Laboratorio Nacional Argonne proporciona haces de rayos X ultrabrillantes y de alta energía generados por anillos de almacenamiento para la investigación en casi todas las disciplinas científicas.
de Laboratorio Nacional Argonne ID

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

IKK1 AlphaProtein ExpressionInsect CellsBaculovirus SystemProtein PurificationSize Exclusion ChromatographyProtein CrystallizationX ray CrystallographyMolecular ReplacementStructure Determination

Artículos relacionados