Una guía para la producción, cristalización y determinación de la estructura de IKK1/α humano

Resumen

IκB cinasa 1/α (CHUK IKK1/α) es una Ser/Thr quinasa que participa en un sinnúmero de actividades celulares principalmente a través de la activación de factores de transcripción NF-κB. Aquí, describimos los principales pasos necesarios para la producción y determinación de estructura cristalina de esta proteína.

Resumen

Una clase de estímulos extracelulares requiere activación de IKK1/α para inducir la generación de una subunidad de NF-κB, p52, por medio del procesamiento de su precursor p100. p52 funciona como un homodímero o un heterodímero con otra subunidad de NF-κB, RelB. Estos dímeros a su vez regulan la expresión de cientos de genes implicados en la inflamación, la supervivencia de la célula y ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente asociado con IKK2/β y NEMO como un complejo ternario. Sin embargo, una pequeña piscina de la también se observa como un complex(es) de bajo peso molecular. Se desconoce si la actividad de procesamiento de la p100 es desencadenada por la activación de IKK1/α dentro del más grande o la más pequeña piscina complejo. Actividad constitutiva de IKK1/α se ha detectado en varios tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias. Para entender el mecanismo de activación de IKK1/α y permiten su uso como una diana farmacológica, expresamos IKK1/α recombinante en diferentes hosts, como e. coli, insectos y células de mamíferos. Hemos logrado expresar IKK1/α soluble en baculovirus infectan células de los insectos, obtener cantidades de mg de proteína de alta pureza, cristalización en presencia de inhibidores y determinar su estructura de cristal de rayos x. Aquí, describimos los pasos detallados para producir la proteína recombinante, su cristalización y su determinación de estructura cristalina por rayos x.

Introducción

Actividades transcripcionales de la familia del NF-κB de factores de transcripción dimérico son necesarias para diversas funciones celulares que van desde la inflamación y la inmunidad a la supervivencia y muerte. Estas actividades son rigurosamente controladas en las células y una pérdida de regulación conduce a diversas condiciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunes y cáncer^1,2,3. En la ausencia de un estímulo, la actividad de NF-κB se mantiene inhibida de proteínas IκB (inhibidor de - KB)⁴. La fosforilación de residuos de Ser específic....

Protocolo

1. preparación de Virus recombinante adecuado para la expresión a gran escala de IKK1/α

1. Preparación de virus de P1 ³²
   1. Día 1: Las células Sf9 placa (~ 6 X 10⁵) (paso número menos de 10) en 2 mL de medio de insectos celular de III Sf900 en cada pozo de una placa de 6 pozos e incubar a 27 ° C. Las células de paso al llegar a una densidad de 2 a 3 X 10⁶ células / mL en suspensión diluyendo en medio fresco con una densidad de ~ 6 X 10⁵.
   2. Día 2: Diluir 8 μl de reactivo de transfección Sf9 en 100 μl de medio de insecto Sf900 III o de gracia sin antibiótico y suero. Vortex b....

Resultados

Clonación y expresión de diferentes construcciones de IKK1/α
Longitud total que ikk1/α humana fue clonada en el pFastBacHTa de vector de expresión de baculovirus en sus sitios de restricción EcoRI y NotI para obtener un N-terminal hexa-histidina tagged IKK1. La etiqueta podría ser quitada por la digestión de proteasa TEV. Longitud total IKK1/α contiene regiones flexibles en ambos extremos, y regiones flexibles generalmente representar una proteína difícil de cristaliza.......

Discusión

Solución de producción, estructura y cristalización de dos proteínas relacionadas de IKK
Nos propusimos para determinar la estructura de cristal de rayos x de IKK1/α con la idea de que sería un ejercicio relativamente sencillo dado nuestra experiencia con la producción de proteínas, cristalización y determinación estructural de IKK2/β. Sin embargo, nos quedamos muy sorprendidos que estas dos proteínas relacionadas se comportaron muy diferentemente con respecto a la facilidad de cristalización. A pesar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cellfectin/Cellfectin II	Thermo Fisher Scientific	10362100	Cellfectin ahora está descontinuado, reemplazado por Cellfectin II
Sf900 III Medio celular de insectos	Thermo Fisher Scientific	12658-027
Células SF9	Thermo Fisher Scientific	12659017
anticuerpo anti-IKK1	Novus Biologicals	NB100-56704	Vendido anteriormente por Imgenex
anti-PentaHis anticuerpo	Qiagen	34460
membrana de PVDF	Millipore	IPVH00010	También se puede utilizar nitrocelulosa
Ni-NTA agarosa	Qiagen	30210
Bradford reactivo de ensayo	BioRad	500001
Superdex 200 columna	GE Healthcare	28989335
Concentrador Amicon	Millipore	UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compuesto A	Bayer
Calbiochem Inhibidor de IKK XII	Calbiochem	401491
Staurosporine	SIGMA	S4400
MLN120B	Millenium	Artículo de regalo
AMPPNP	SIGMA	A2647
Sulfato de dextrano	SIGMA	51227, 42867, 31404,
Sulfato de dextrano	Alfa Aesar	J62101
PEG	SIGMA	93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172	Algunos de ellos son nuevos Cat # en el catálogo de SIGMA. Lo que teníamos era originalmente de Fluka que tenía un gato # diferente.
Pantallas de cristalización:
Crystal Screen I y II (Crystal Screen HT)	Hampton Research	HR2-130
Index HT	Hampton Research	HR2-134
PEG/Ion y PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)	Hampton Research	HR2-139
PEGRX 1 y PEGRx 2 (PEGRx HT)	Hampton Research	HR2-086
SaltRx 1 y SaltRx 2 (SaltRx HT)	Hampton Research	HR2-136
Monturas de cristal	Hampton Research	HR8-188, 190, 192, 194
Sincrotrón	La fuente avanzada de fotones (APS) en el Departamento de Energía de EE. UU. s Línea	luz 19 del	La fuente avanzada de fotones (APS) en el Departamento de Energía de EE. UU. El Laboratorio Nacional Argonne proporciona haces de rayos X ultrabrillantes y de alta energía generados por anillos de almacenamiento para la investigación en casi todas las disciplinas científicas.