Artículo de método

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

DOI:

10.3791/56113

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10 de noviembre de 2017

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1Center for Microscopy and Image Analysis, University of Zurich, 2Institute for Molecular Life Sciences, University of Zurich, 3Institute for Medical Genetics, University of Zurich

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener resultados de localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra por microscopía de superresolución la correlación y análisis de imágenes de microscopia electrónica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se presenta un método para investigar la localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra larvas combinando la microscopía de superresolución y microscopía electrónica de barrido. Las capacidades de resolución secundario-difracción límite de microscopios ópticos de super-resolución permiten mejorar la exactitud de los datos correlacionados. Brevemente, 110 nanómetros cryo-secciones de espesor se transfieren a una oblea de silicio y, después de la inmunofluorescencia que manchaba, son imágenes por microscopía de superresolución. Posteriormente, las secciones se conservan en metilcelulosa y platino sombreado antes de la proyección de imagen en un microscopio electrónico de barrido (SEM). Las imágenes de estas dos modalidades de microscopía se fusionan fácilmente usando puntos de referencia de tejido con software de código abierto. Aquí describimos el método adaptado para la retina de pez cebra larval. Sin embargo, este método también es aplicable a otros tipos de tejidos y organismos. Demostramos que la información complementaria obtenida por esta correlación es capaz de resolver la expresión de proteínas mitocondriales en relación con las membranas y cristae de mitocondrias, así como a otros compartimentos de la célula.

Introducción

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Métodos para determinar la localización subcelular de las proteínas y su relación con diferentes compartimentos de la célula son herramientas esenciales para comprender sus funciones y las interacciones posibles. Microscopía de superresolución en combinación con microscopia electrónica proporciona tal información1. Microscopia de agotamiento de estado seguida por el retorno de la molécula individual (GSDIM) es una tecnología de microscopía de superresolución compatible con una amplia gama de fluoróforos orgánicos y genéticamente codificado2 y alcanza una resolución lateral hasta 20 nm 3. la incorporación de métodos con mayor resolución que la microscopía estándar de difracción limitada mejora la precisión de la correlación4,5,6. Se recomiendan para lograr la mejor correlación de la expresión de la proteína con un compartimiento subcelular específico y reducir el volumen de incertidumbre7 el uso de la misma sección ultrafina de luz y microscopia electrónica. Entre los diferentes métodos de seccionamiento, Tokuyasu cryo-sección Protocolo no requiere deshidratación o incrustación de resina y, además, conserva la antigenicidad de muchos epítopos y proporciona buen tejido ultraestructura8. Varios métodos han demostrado la aplicabilidad de estas secciones en correlativa luz y microscopia electrónica (CLEM)4,5,9,10.

La retina de pez cebra es un modelo valioso para el estudio de desarrollo visual y los mecanismos de enfermedades humanas dados su función y estructura altamente conservado a través de vertebrados. En particular, retina fotorreceptores pantalla la misma arquitectura que los fotorreceptores mamíferos, con una sinapsis basal, un núcleo apico-base alargada, agrupamiento de las mitocondrias en el segmento interno más apical y un segmento externo compuesto de membrana discos en la posición más apical11. Localización de la proteína para los diferentes compartimentos celulares es conservado entre pez cebra y humanos, permitiendo la investigación de la función biológica de proteínas relevantes para la enfermedad humana12,13.

Aquí presentamos un protocolo para preparar pez cebra larvas muestras de retina a resolver la localización de la proteína de la membrana externa mitocondrial Tom20 correlativos resolución súper luz y microscopia electrónica. El método se basa en la recogida cryo-secciones sobre obleas de silicio y obtener contraste información topográfica producida después de la aplicación de una fina capa de platino. Estos pasos son técnicas claras mejoras en términos de facilidad de uso, la reproducibilidad y el tiempo para completar los experimentos. Recientemente hemos demostrado la aplicabilidad del método para detectar poros nucleares y proteínas mitocondriales en el tejido de ratón14.

Protocolo

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todos los experimentos fueron realizados con arreglo a la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de la visión y fueron aprobados por las autoridades locales.

1. preparación de secciones ultrafinas sobre obleas de silicio

fijación de la muestra de
    1. preparar la solución fijadora que contiene 0.1% de glutaraldehído, formaldehído al 4% en buffer de cacodilato 0.1m.
      Nota: atención! Tenga cuidado al trabajar con glutaraldehído, el formaldehído y el cacodilato buffer, usar equipo de protección personal y trabajar en una campana de humos.
    2. Eutanasia 5 días post fertilización (5 PD) larvas de pez cebra con Metanosulfonato (Metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato, 0.4% p/v en PBS (tampón fosfato salino, pH 7)) como se describió anteriormente 15.
    3. Fijar las larvas por inmersión en solución de fijación previamente enfriado en hielo. Quitar la cabeza e incubar durante una noche a 4 ° C con oscilación suave.
    4. Diseccionar los ojos por recortar el tejido alrededor del ojo con finas pinzas y un bisturí de microdisección (debajo de un binocular) en solución fijadora enfriada en una placa de agarosa-camas de 1%. Transfiera los ojos a un tubo con fijador previamente refrigerado fresco.
    5. Lavar dos veces en PBS (tampón fosfato salino, pH 7.4) durante 5 minutos cada lavado a temperatura ambiente (RT).
  2. Infiltración de gelatina y montaje
    1. Warm up 15 mL comida local marca gelatina 12% w/v en PB (tampón fosfato, 0.1 M pH 7,4) a 40 ° C. retirar el PBS y añadir solución de gelatina en los tubos que contienen los ojos. Golpee el tubo suavemente para asegurar el gelatina infiltra la muestra e incubar por 10-30 min a 40 ° C en un termobloque con agitación suave o en baño de agua.
    2. Llenar 12 mm x 5 mm x 3 mm de silicona o polietileno plana empotrar moldes con gelatina caliente en un baño de agua de 40 ° C. Agregar dos ojos molde usando una pipeta, alinearlos correctamente bajo un binocular utilizando una aguja de disección y dejar que la gelatina enfríe a temperatura ambiente durante 1 min y endurecen a 4 ° C durante 20 min
    3. Volver a recortar el bloque de gelatina bajo los binoculares para caber un ojo por bloque, utilizando una cuchilla de afeitar.
    4. Transferir los ojos de gelatina encajado a 2,3 M de sacarosa en PB en el hielo. Incubar a 4 ° C durante la noche.
    5. Intercambio de nueva solución de sacarosa de 2,3 M y almacenar a 4 ° C o -20 ° C; después de este paso, las muestras están listas para seccionamiento o pueden almacenarse a-20 ° C durante varias semanas a meses.
    6. Volver a recortar el bloque de gelatina a casi del tamaño del ojo antes de transferir a un crio-pin. Congelación en nitrógeno líquido y la transferencia a un crio-ultramicrotomía.
  3. Cryosectioning
    1. corte 110 nm de espesor-secciones a-120 ° C con un cuchillo de diamante en el cryo-ultramicrotomía.
    2. Escoge las secciones con un lazo de conexión que contienen una gota de metilcelulosa al 2% (en agua) y solución de sacarosa de 2,3 M (1:1). Transferencia de secciones a una oblea de silicio de 7 x 7 mm. Almacenar las secciones de 4 ° C hasta el procesamiento más.

2. Immunolabelling

  1. obleas de lavado con PBS a 0 ° C por 20 min en cuatro gotas colocando boca abajo las obleas en las gotas. Lavado en PBS 2 x 2 min a temperatura ambiente.
  2. Incubar 3 veces en el 0,15% de glicina en PBS, durante 1 minuto. Lavar 3 veces durante 1 min/lavado con PBS. Pre-incubate con PBG (PBS con BSA albúmina de suero bovino de 0.5% y 0.2% gelatina tipo B) por 5 min
  3. Incubar con conejo anti-Tom20 (véase la Tabla de materiales) en PBG (4 μg/mL) durante 30 min a temperatura ambiente.
  4. Lave 6 x para 1 min/lavado en el PBG. Pre-incubate con PBG durante 5 minutos a RT. incubar con anti-conejo Alexa 647 F(ab') 2 (véase la Tabla de materiales) en PBG (7,5 μg/mL) durante 30 minutos
  5. Lave 6 x para 1 min/lavado en el PBG. Lavado 3 x 2 minutos en PBS. Incubar con DAPI (4 μg/mL) en PBS durante 10 s. lavado 2 x 2 minutos en PBS.

3. Microscopia de la estupendo-resolución

  1. incubar la oblea brevemente (10 s) colocando en una gota de una solución de 1:1 de glicerol (80%) y proyección de imagen tampón que contiene un oxígeno limpieza sistema (200 mM de tampón fosfato que contiene glucosa 10%, 0, 5 mg/mL glucoseoxidase, 40 la catalasa μg/mL, clorhidrato de beta-mercaptoethylamine de 15 mM (MEA HCL), pH 8.0).
  2. Transferir las obleas (sección hacia abajo) a un plato de Petri de vidrio inferior (grueso 170 ± 5 μm) en una dulce gota de la mezcla 1:1 de glicerol (80%) y buffer (como en el paso 3.1) la proyección de imagen.
  3. Eliminar de todos lados, con una pipeta, la mayor parte del líquido por debajo de la oblea. Utilizar bandas de silicona para fijar la oblea en el fondo de la caja Petri.
    Nota: Rayas de silicona están hechos de silicona-pegamento de dos componentes (3 x 12 mm).
    4. Secciones de
  4. de imagen en un microscopio invertido con una alta apertura numérica (por ejemplo 160 X / NA 1.43; véase la Tabla de materiales) objetivo dedicado de super resolución de inmersión de aceite. Antes de la proyección de imagen, que las muestras alcancen la temperatura de microscopio con el fin de minimizar/reducir la deriva lateral y axial.
  5. Centro de la zona de interés y adquirir imágenes de referencia de epifluorescencia widefield primera. Cambiar el modo de operación de super resolución. Ajustar el tiempo de exposición de la cámara a 15 ms y fijar el electrón multiplicando la ganancia (EM) a un máximo de 300.
  6. Muestra se iluminan con la 642 nm láser de onda continua a máxima energía (correspondiente a ~2.8 kW/cm 2) en el modo de epifluorescencia. Tan pronto como la molécula solo parpadea están bien separadas en cada fotograma, por lo que la probabilidad es baja, que las señales individuales se superponen, la potencia del láser a ~0.7 kW/cm 2. Grabar la imagen raw en modo de epifluorescencia mediante la adquisición de un mínimo de 30.000 marcos.
    Nota: Todos estos parámetros pueden variar dependiendo de diferentes muestras y etiquetado densidad.
  7. De los datos sin procesar, generar una lista de eventos de reconstrucción (localizaciones de cada molécula solo parpadeo en la imagen raw) con un umbral de detección de 30 fotones (tiene que ser ajustado según la muestra) haciendo clic en " evaluar " en la ' serie t Análisis de ' en ' herramientas de '.
  8. Visualizar la imagen de super resolución por ajuste gaussiano 16 aplicar un tamaño de píxel de representación de 4 nm haciendo clic en " crear imagen " en el ' panel de elaboración de lista de eventos ' en ' Tools. '
    Nota: Las herramientas de software integrado del sistema utilizado en este estudio fueron empleadas para generar la imagen super resuelta. Sin embargo, la proyección de imagen de resolución super descrito podría realizarse en cualquier otro sistema de localización basado en la sola molécula, y podrían ser procesados los datos con herramientas de software de código abierto como tormenta 17.

4. Sombra de platino

  1. quitar rayas de silicio y añada una gota de PBS cerca de los bordes de la oblea a levante de la caja Petri. Lave la oblea min 2 x 2 en PBS, luego post arreglarlo con glutaraldehído 0.1% en PBS por 5 minutos Lave 2 x por 2 min/lavado en PBS.
  2. Incubar la oblea dos veces durante 5 min/incubación en 1 gota de metilcelulosa al 2% en agua con hielo. Inserte la oblea en un tubo de centrífuga y centrifugar a 14.100 g x 90 s. montaje en un trozo de aluminio de SEM con realización de cemento carbono.
  3. Añadir una capa de 2 a 10 nm de platino/carbón en la muestra de sombreado rotatorio en 8° con un electrón viga ajustes de dispositivo de evaporación: 1.55 kV, 55 mA, a 0,3 nm/s y un ángulo de 8°, nivel de rotación 4.

5. Microscopía electrónica de barrido

  1. las secciones de la imagen con un barrido electrón microscope 1,5 kV, 2 mm trabajando a distancia y con un lente detector de electrones secundarios.

6. Alineación de la luz y la microscopia electrónica imágenes

  1. abrir ambos tipos de imágenes con Fiji 18 haciendo clic en " archivo | Abierto ". Ajustar el tamaño del lienzo haciendo clic en " imagen | Ajustar | Tamaño de la lona " y ambas imágenes una pila haciendo clic en " imagen | Pilas | Imágenes de pila ". Guarde la pila como tipo de archivo tiff.
  2. En Fiji, abra una nueva interfaz de 19 TrackEM2 haciendo clic en " archivo | nuevo | TrackEM2 (nuevo) ". Importar la pila con dos imágenes haciendo clic derecho sobre la ventana negra y seleccionando " pila de importación ".
    3. Imagen de microscopía de
  3. luz Alinee a microscopia electrónica imagen manualmente con puntos de referencia utilizando un clic derecho del ratón sobre la imagen y seleccionando " Alinee | Alinear capas manualmente con puntos de referencia ". Herramienta de
    1. pick la selección (la flecha negra) para agregar puntos de interés. Utilice la forma de núcleos como referencia para seleccionar los bordes de la misma en las dos imágenes (figura 1 complementaria). Agregar varios puntos (mínimos tres puntos tienen que ser seleccionados). Aplique alineación con un modelo afín por derecho del ratón hacer clic y seleccionar " aplicar transformación | Modelo afín ".
  4. Cambiar la transparencia de la capa (ver figura 1 complementaria) para evaluar la calidad de la alineación.

Resultados

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La expresión de la proteína Tom20, una subunidad de la membrana externa mitocondrial complejo20de translocasa, determinó, en secciones finas de la retina de pez cebra larvas, por microscopía de superresolución (figura 1) y esta información fue complementada con la señal topográfica obtenida por microscopía electrónica de barrido después de platino el remedo de las mismas secciones. Estos datos correlativos confirman la localización de una proteína en asociación con un compartimiento especial, la membrana mitocondrial externa y, además, proporcionar información sobre la relación de la proteína con otros organelos de la célula.

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Figura 1: CLEM en la retina del pez cebra. A. imagen de campo amplio Ampliación baja de una 5 dpf pez cebra sección retina, núcleos teñidos con DAPI (cian). B. microscopía electrónica de la misma zona. C. mayor imagen de campo amplio aumento de marco en B. núcleos teñidos con DAPI (cyan) y Tom20 mitocondrial coloración aparece en rojo. D. imagen de campo amplio de misma sección al aumento mayor. El patrón de expresión de Tom20 es en los clusters de las mitocondrias. E. expresión de Tom20 (puntos rojos) detectados por microscopía GSDIM. Núcleos teñidos con DAPI (cian). F. sección mismo como E combinando correlativo súper resolución y microscopía electrónica de barrido. Tom20 manchas (puntos rojos) aparece en el clúster mitocondrial (M) en las membranas externas de mitocondrias. Señal de DAPI de fluorescencia en los núcleos (N) se corresponde con la topografía de la imagen de SEM. G. imagen de alta magnificación de marco f el. La imagen de microscopía electrónica barrido proporciona contexto para la imagen GSDIM (puntos rojos). Cristae mitocondriales es claramente visibles y la tinción de Tom20 está localizada en las membranas externas de mitocondrias. Las membranas del segmento externo de los fotorreceptores (OS) son claramente resueltos. Imagen pixel tamaño 5 nm. Barras de escala: A, B y C: 10 μm; D: 2 μm; E y F: 1 μm y G: 0.2 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 1: alineación de las imágenes de luz y microscopia electrónica. A. captura de pantalla de la interfaz TrackEM2 con imagen de SEM e hitos numerados (amarillos) a lo largo de diferentes núcleos. B. captura de pantalla de la interfaz TrackEM2 con imagen de fluorescencia e hitos numerados (amarillo) a lo largo de diferentes DAPI tinción de núcleos. Para cambiar la transparencia de la capa se pueden utilizar los controles deslizantes en la parte superior izquierda del menú. Barra de escala: 1 μm. haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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Este método combina localización de proteína Super resuelto con información de contexto para determinar la posición exacta de las proteínas en un organelo. Aquí demostramos la realización del experimento para visualizar la expresión de Tom20 en la membrana externa de las mitocondrias y su relación con otros orgánulos como el núcleo o segmentos externos de los fotorreceptores en la retina de pez cebra larval.

Tokuyasu crio-seccionado requiere cierto entrenamiento para adquirir las secciones bien conservadas. Sin embargo, este es un método utilizado en muchos laboratorios con éxito demostrado21. Transferencia de las secciones a la oblea de silicio es muy simple y no hay consideraciones especiales son necesarias. El uso de glicerol en el buffer de imagen es un paso muy importante para evitar el secado de las secciones. Para la proyección de imagen de súper-resolución los mejores resultados se obtienen cuando la oblea está muy cerca de la parte inferior de cristal de la placa de Petri. Las bandas de silicona ayudan a mantener la oblea en esta posición. Especial cuidado debe tomarse mientras se retira la banda para evitar daños en las secciones.

El espesor de las secciones de cryo, alrededor de 100 nm, más delgado que la resolución óptica en la dimensión Z, además facilita la precisión de este método correlativo como la señal de la microscopía de superresolución proviene sólo de esta capa delgada y la microscopio electrónico de barrido de señal muestra la topografía de la muestra. Este método podría también combinarse con imágenes multicolor. Sin embargo, debe tenerse especial cuidado que la muestra puede ser reflejada en mismas condiciones (por ejemplo proyección de imagen tampón) y charla de la Cruz debe ser prevenido.

Una limitación del método es sus dos dimensiones acercarse, ya que sólo un número limitado de secciones seriadas (de 3 a 7 por oblea) puede ser recogido. Así, proyectos con análisis de volumen no sería ideal. Sin embargo, es un método que puede aplicarse para detectar la expresión de la proteína en cualquier tipo de tejido por simple corte de la muestra. Ofrecemos un método sin el uso de agentes de contraste clásico como el acetato de uranilo, citrato plomo. El contraste por sombreado platino proporciona contraste topográfico muy informativo, pero en algunos casos las membranas son difíciles de resolver. Esto puede plantear problemas para los proyectos que necesitan, por ejemplo, para determinar la expresión de proteínas en pequeñas vesículas.

Nuestro protocolo, basado en Tokuyasu cryo-secciones, utiliza equipo estándar para obtener resultados correlativos de super-resolución y microscopios electrónicos de barrido. La colección de secciones sobre obleas de silicio y el uso de platino para contraste son pasos para proporcionar estabilidad y reproducibilidad para la preparación de la muestra.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Financiación de ION y RGB: suizo ciencia Fundación Ambizione-puntaje nacional concede PZ00P3 142404/1 y PZ00P3 163979.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ParaformaldehídoSigma-Aldrich#158127
Glutaraldehído EM GradoEMS, EE. UU.#16220
CacodilatoMerck#8.20670
TricaínaSigma-Aldrich#886-86-2
Agarosa, peqGOLD UniversalVWR International GmbH35-1020
Moldesde incrustación planosBEEM Flat
Gelatina de marca de alimentos localesDr.OetkerExtra Gold
SacarosaMerck#1.07687
MetilcelulosaSigma#M-6385
GlycineSigma#G-7126
Gelatina tipo BSigma#G-6650
BSAApplichem#A6588.0050
Oblea de silicioSi-Mat Tipo de materiales: P / Boro; Orientación < 111> EN; Método de crecimiento: CZ; Resistividad: 1-30 ohm/cm; Superficie: pulida; Corte láser a 7 x7 mm
Cryo-pin PreparaciónBáltico#16701950
Bucle cableado "Perfect loop"
Rayas de siliconaPicodentTwinsil 22
GlucosaSigma-Aldrich#G8270
glucosaoxidasaSigma-Aldrich#G7141
catalasaSigma-Aldrich
clorhidrato de beta-MercaptoetilaminaSigma-Aldrich#M6500
anti-Tom20Santa Cruz Biotechnology#sc - 11415
AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragmento burro anti conejo IgGJackson Immuno-Research#711-606-152
DAPIROCHE, Suiza#10236276001
Glicerol soluciónSigma-Aldrich#49782
Placa de Petri con fondo de vidrioIbidi, AlemaniaPlaca en U de 35 mm, fondo de vidrio alto, #81158
Trozo de aluminio SEMAgar Scientific#G301F
Cemento de carbono conductor Leit-CPlano, AlemaniaAG3300
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Instruments
Diamond Knife (Cryo Immuno)DiatomeDCIMM3520
Cryo-ultramicrotomoLeica Microsystems Leica EMFCS
Microscopio Widefield-TIRF GSD Leica SR GSD 3DLeica Microsystems
Objetivo 160x 1.43 TIRFLeica Microsystems 11523048
SEM - Zeiss Supra 50 VPZeissSupra 50 VP
FIB-SEM - Zeiss Auriga 40ZeissAuriga 40
de silicio#C40

Referencias

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