Este protocolo proporciona instrucciones para muestras de virus de tinción negativas que pueden usarse fácilmente en laboratorios BSL-2, -3 o -4. Incluye el uso de una cápsula de procesamiento innovadora que protege la rejilla de microscopía electrónica de transmisión y proporciona al usuario un manejo más fácil en los ambientes más turbulentos dentro de la biocontención.
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Artículo de método
Utilización de cápsulas para la tinción negativa de muestras víricas en biocontención
En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se utiliza para observar la ultraestructura de virus y otros patógenos microbianos con resolución nanométrica. La mayoría de los materiales biológicos no contienen elementos densos capaces de dispersar electrones para crear una imagen; Por lo tanto, se requiere una tinción negativa, que coloca sales densas de metales pesados alrededor de la muestra. Con el fin de visualizar los virus en suspensión bajo el TEM que deben aplicarse a las pequeñas rejillas cubiertas con una superficie transparente sólo nanómetros de espesor. Debido a su pequeño tamaño y fragilidad, estas rejillas son difíciles de manejar y se mueven fácilmente por las corrientes de aire. La superficie delgada se daña fácilmente, dejando la muestra difícil o imposible de imagen. Los virus infecciosos deben ser manejados en un gabinete de bioseguridad (BSC) y algunos requieren un ambiente de laboratorio de biocontención. Tinción de virus en los niveles de bioseguridad (BSL) -3 y -4 es especialmente difícil debido a que estos entornos son más turbulentos y los técnicos se requieren tO use equipo de protección personal (PPE), lo que disminuye la destreza.
En este estudio, se evaluó un nuevo dispositivo para ayudar a la tinción negativa de virus en biocontención. El dispositivo es una cápsula que funciona como una punta de pipeta especializada. Una vez que las rejillas se cargan en la cápsula, el usuario simplemente aspira los reactivos en la cápsula para entregar el virus y las manchas a la rejilla encapsulada, eliminando así el manejo del usuario de las rejillas. Aunque esta técnica fue diseñada específicamente para su uso en el biocontenimiento BSL-3 o -4, puede facilitar la preparación de la muestra en cualquier ambiente de laboratorio permitiendo una fácil tinción negativa del virus. Este mismo método también se puede aplicar para preparar especímenes TEM negativos teñidos de nanopartículas, macromoléculas y especímenes similares.
Introducción
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es una herramienta eficaz para visualizar la morfología y la ultraestructura de especímenes biológicos que son demasiado pequeños para ser vistos con un microscopio de luz tradicional 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs disparar electrones a través de una muestra muy delgada que produce una imagen de mayor resolución como electrones tienen una longitud de onda mucho más corto que la luz. Las regiones de la muestra que doblan o bloquean electrones aparecen oscuras, mientras que las regiones que son electrón l....
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Protocolo
1. Preparación del experimento en un entorno BSL-2 antes de trabajar con las muestras de virus
- Preparar o comprar Formvar y rejillas de cobre con recubrimiento de carbón TEM, generalmente 200-400 mallas.
- Inserte las rejillas TEM revestidas en cápsulas.
- Utilice una lente ampliada para hacer este proceso fácil de realizar. Se pueden insertar una o dos rejillas en cada cápsula. Las cápsulas precargadas se pueden comprar para eliminar este paso si se desea.
- Transferir las cápsulas con rejillas recubiertas con TEM insertadas, junto con otros suministros y reactivos, a biocontención donde el virus se tiñera....
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Resultados
El método de la cápsula produce una tinción negativa de buena calidad para la obtención de imágenes TEM:
En primer lugar, se evaluó la calidad de las imágenes generadas mediante el uso del método de gotita manual y los métodos de cápsula para la tinción negativa Zaire ebolavirus. Los ebolavirus son miembros de la familia Filoviridae , junto con el virus Marburg. El ébolavirus es típicamente de 80 a 100 nm de diámetro y p.......
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Discusión
La tinción negativa es una valiosa técnica TEM para evaluar y calibrar virus, complejos proteicos y nanopartículas. La preparación de gotitas de estos especímenes mediante el movimiento manual de las rejillas desde el reactivo a las manchas negativas ha sido el protocolo clásico durante más de medio siglo. Es un proceso simple, pero requiere conocimientos adquiridos a través de la capacitación para su finalización con éxito. La excelente tinción negativa todavía se considera un conjunto de habilidades de última generaci.......
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Divulgaciones
Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones que figuran en el artículo son las de los autores y no necesariamente están respaldadas por el Ejército de los Estados Unidos o el Departamento de Defensa.
Agradecimientos
Quisiéramos agradecer al Dr. John Carra y Rowena Schokman por proporcionar Nano-VLP puros de Ebola, al Dr. Rajini Mudhasani por proveer el virus Chikungunya, y al Dr. Charles (Jason) Shoemaker por proveer Leucemia Murina VLPs que expresan glicoproteínas de Ebolavirus. También queremos agradecer a MAJ Carl Soffler por facilitar el Programa de Prácticas de Verano (SIP) y el Programa de Aprendizaje de Ciencia e Ingeniería (SEAP) y la Dra. Catherine Wilhelmsen para el entrenamiento de seguridad en el laboratorio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Rejillas TEM recubiertas de carbono | SPI | 3420C-MB | Malla 200 Cu Pk/100 |
| mPrep/g cápsulas | EMS | 85010-01 | caja |
| mPrep/f acopladores | EMS | 85010-11 | estándar 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | Solución al 50%, grado EM |
| Tetróxido de osmio | EMS | 19190 | solución |
| Acetato de uranilo | EMS | 22400 | polvo |
| Ácido fosfotúngstico de potasio | EMS | 19500 | polvo |
| papel de filtro | Whatman | 1450-090 | tamaño 50 |
| Microscopio electrónico de transmisión | JEOL | JEM-1011 | TEM |
Referencias
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H.....
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Reimpresiones y permisos
