Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

ECEH O157: H7 es un patógeno que causa diarrea¹, HS², HUS³y falta renal aguda incluso⁴ a través de agua o alimentos contaminados. EHEC es un patógeno Enterobacter y coloniza en el tracto gastrointestinal de los seres humanos¹. Cuando EHEC primero se adhieren al epitelio intestinal del anfitrión, inyectan los factores de colonización en las células del huésped a través del sistema de la secreción del III tipo (T3SS) que funciona como una jeringa molecular induciendo una fijación y borrar (A/E) lesión posteriormente para hacer cumplir adherencia (colonización)⁵. Estos genes involucrados en la formación de la lesión A/E son codificados por el locus de la isla de patogenicidad del enterocyte effacement (LEE)⁵.

Bioluminescence es una reacción química produzca luz, en la cual luciferase cataliza su luciferin del substrato para generar luz visible⁶. Este proceso enzimático requiere con frecuencia la presencia de oxígeno o trifosfato de adenosina (ATP)⁶. Bioluminiscencia (BLI) la proyección de imagen permite a los investigadores la visualización y cuantificación de las interacciones huésped-patógeno en animales vivos⁷. BLI puede caracterizar el ciclo de infección bacteriana en animales vivos siguiendo las bacterias bioluminiscentes que migran e invaden diferentes tejidos⁷; Esto revela una evolución dinámica de la infección. Por otra parte, la carga bacteriana en los animales se relaciona con la señal bioluminiscente⁸; por lo tanto, es un indicador conveniente para estimar las condiciones patológicas de los animales experimentales en una forma simple y directa.

El plásmido utilizado aquí contenida el operón de la luciferasa, luxCDABE, que es de la bacteria Photorhabdus luminescens que codifica su propia luciferase sustrato^7,9. Al transformar este plásmido de expresión de luciferasa en las bacterias, los procesos de colonización y la infección pueden controlarse mediante la observación de estas bacterias bioluminiscentes en animales vivos. En general, BLI y bacterias etiquetado bioluminiscencia permiten a los investigadores a monitorear los números bacterianos y ubicación, viabilidad bacteriana con tratamiento de antibióticos y la expresión génica bacteriana en infección/colonización^{6, 7}. se han reportado numerosas bacterias patógenas que expresar el operón luxCDABE para examinar su expresión de ciclo o gen de infección en infección. Estas bacterias, incluyendo uropatógenos Escherichia coli¹⁰, EHEC^8,11,12,13, enteropatógeno e. coli (EPEC)⁸, Citrobacter Rodentium^14,15, Salmonella typhimurium¹⁶, Listeria monocytogenes¹⁷, Yersinia enterocolitica^18,19, y Vibrio cholerae²⁰, han sido documentados.

Varios modelos experimentales se han desarrollado para facilitar el estudio de ECEH colonización in vitro e in vivo^21,22,23. Sin embargo, hay una falta de modelos animales adecuados para el estudio de la colonización la EHEC en vivoy, por tanto, la escasez resultante de los datos. Para facilitar el estudio de la EHEC colonización mecanismo en vivo, es valioso para construir modelos animales para observar y cuantificar la colonización de ECEH en los animales vivos en un método no invasivo.

Este manuscrito describe un modelo de colonización de EHEC de mouse que utiliza un sistema de expresión bioluminiscente para controlar la colonización de la ECEH en el tiempo de vida acoge. Ratones se inoculan intragástrica con EHEC etiquetado bioluminiscencia y se detecta la señal bioluminiscente en ratones con un no-invasivo en vivo imágenes del sistema¹³. Ratones infectan con ECEH etiquetado bioluminiscencia mostró significativas señales bioluminiscentes en su intestino después de 2 días post infección, lo que sugiere que las bacterias colonizan en el intestino del anfitrión después de 2 días post infección. Ex vivo imagen datos demostraron que esta colonización es específicamente en el ciego y el colon de los ratones. Mediante este modelo de ratón-EHEC, la colonización bioluminiscente de EHEC puede detectarse en la vida de acogida un en vivo sistema, para estudiar los mecanismos detallados de la colonización de bacterias entéricas, que puede promover la comprensión más en la proyección de imagen Inducida por la EHEC cambios fisiológicos y patológicos.

PRECAUCIÓN: ECEH O157: H7 es un nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) patógeno según los centros para el Control de enfermedades y prevención de enfermedades (CDC) Instrucciones de seguridad de la biotecnología (https://www.cdc.gov/). Por lo tanto, deben realizarse todos los procedimientos experimentales que EHEC en una facilidad BSL-2. Use guantes y batas de laboratorio al realizar el experimento. Trabajo en una gabinete de la bioseguridad certificada (BSC). Desinfectar el Banco experimental antes y después del procedimiento experimental con etanol al 70%. Todos los instrumentos o equipos que EHEC contacto (o potencialmente contacto) debe ser desinfectado con etanol al 70% o blanqueador. Desechos contaminados (o potencialmente contaminados) deben ser cuidadosamente sellado y esterilizado. Use una máscara, protección ocular, guantes doble o un mono, si es necesario. Los ratones hembra de 6 semanas de edad C57BL/6 fueron comprados y mantenidos en el laboratorio Animal centro de National Cheng Kung University (NCKU). Los experimentos con animales fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de NCKU (número 104-039).

1. generación de las bacterias EHEC Bioluciferase-etiquetado

1. Mezcle 50 ng del ácido desoxirribonucléico (ADN), 1 μL de 10 μM adelante y atrás cartillas, Deoxynucleótidos 2 por μL de 2,5 mM (dNTPs), 2 μL de 10 x tampón, 0,2 μL ADN polimerasa y agua doble destilada estéril (ddH₂O) hasta un volumen final de 20 μL para amplificar la casete de la kanamicina nptII gen²⁴. La plantilla de DNA es de pBSL180²⁴, que se adquiere desde el proyecto nacional de BioResource (NBRP). Las condiciones PCR se enumeran en la tabla 1 y la secuencia de la cartilla está disponible en la tabla 2.
2. Ligan los productos PCR a un vector de clonación comercial siguiendo el kit protocolo (véase Tabla de materiales).
3. Suprimir el fragmento de gen nptII del vector de clonación NsiI y SmaI y clonar en pBBR1MCS4, que es digerida por el NsiI y ScaI de pAKlux2⁹ para crear el plásmido resistentes a kanamicina, pWF278¹³.
4. Suprimir el operón luxCDABE , de la luciferase expresando plásmido⁹, pAKlux2, por SpeI-HF y ScaI y clon SpeI-HF y SmaI digerido pWF278 para generar kanamicina resistente y luciferasa expresando su plásmido, pWF279¹³.
   Nota: Para la extracción de plásmidos y las purificaciones fragmento suprimido, utilice la extracción comercial del plásmido y el kit de extracción de gel, respectivamente. Para la digestión de la enzima, mezcle 100 ng de ADN, 1 μL 10 x tampón, 1 μL de cada enzima de restricción seleccionada y ddH estéril₂O hasta un volumen total de 10 μL e incubar a 37 ° C por 2.5-3 h.
5. Transformar el plásmido pWF279 en células competentes de e. coli EDL933 O157: H7 por electroporación con 2.500 V durante ms de 4.
6. Incube las células de las bacterias transformadas en medio Luria-Bertani (LB) de 1 mL a 37 ° C durante 1 hora.
7. Las bacterias en una placa de agar LB suplementado con 50 μg/mL de kanamicina a 37 ° C durante 16-18 h. de la placa.
8. Comprobar la señal bioluminiscente de la placa por un en vivo la proyección de imagen la máquina el día siguiente. Escoger una sola Colonia de la placa y de la cultura en 3 mL LB con kanamicina 50 de μg/mL a 37 ° C durante 16-18 h..
9. Preparar el medio de acción bacteriano diluyendo 100% glicerol estéril ddH₂O para la solución de glicerol 30%.
10. Congelar la kanamicina resistente bacteria de e. coli EDL933 O157: H7 que el plásmido de la luciferasa como una acción bacteriana en un cryovial de tapón de rosca como una proporción de 1:1 de solución de bacterias cultura y 30% de glicerol a-80 ° C. La concentración final de glicerol es 15%.

2. preparación de bacterias EHEC bioluminiscente para inoculación Oral

Nota: El diagrama de flujo de línea de tiempo de los procedimientos experimentales para la preparación de EHEC y sonda oral ratón se presenta en la figura 1 para ayudar en la preparación experimental.

1. Bacteria de raya e. coli EDL933 O157: H7 que plásmidos de luciferasa en un agar-LB con kanamicina 50 de μg/mL del stock de-80 ° C. Crecer las bacterias durante 16-18 horas a 37 ° C.
2. Escoge una sola Colonia de la placa durante la noche y la cultura en medio de 3 mL LB con kanamicina 50 de μg/mL durante 16-18 h. en una incubadora de 37 ° C a 220 rpm.
3. Subcultura las bacterias (dilución 1: 100) en kanamicina (50 μg/mL) que contiene caldo LB por 2.5-3 h en una incubadora de 37 ° C a 200 rpm. (Por ejemplo, agregar 2 mL cultivados durante la noche las bacterias 200 mL LB suplementado con kanamicina (50 μg/mL)).
4. Incubar las bacterias por 2.5-3 h y medir el valor de densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) hasta el valor es entre 0.9 a 1. El número de la célula bacteriana es a una densidad de cerca de 10⁸ unidades formadoras de colonias (UFC) / mL.
5. Centrifugue las bacterias cultivadas a 8.000 x g por 30 min, 4 ° C.
6. Descartar el sobrenadante sin agitar el sedimento de bacterias y lave el precipitado con 100 mL 0,9% solución salina estéril normal por agitación suave.
7. Repita los pasos del 2.5 y 2.6 una vez.
8. Después del lavado, centrifugar el cultivo bacteriano a 8.000 x g por 30 min, 4 ° C y descarte el sobrenadante con cuidado.
9. Condensado el pellet en 100-fold con 0,9% solución salina estéril normal. Por ejemplo, si las bacterias 200 mL se centrifugaron, Agregar solución salina normal 2 mL para suspender el sedimento.
10. Las bacterias concentradas a través de una dilución seriada 10 veces²⁵de la galjanoplastia para confirmar las bacterias UFC (debe ser aproximadamente 10⁹ UFC/100 μL después de la condensación en solución salina normal).

3. ratón Oral por sonda nasogástrica de EHEC

1. Tratamiento de 6 semanas de edad hembra C57BL/6 ratones con agua de estreptomicina (5 g/L) durante 24 h.
2. Después de 24 h, interruptor para regular el agua potable por otro 24 h antes por sonda nasogástrica. Después de tratar con agua corriente durante 24 horas, los ratones están listos para oral por sonda nasogástrica de EHEC.
3. Llene la jeringa con las bacterias EHEC de 100 μL tirando hacia atrás del émbolo. No sean burbujas de aire en la jeringa. Quite las burbujas por ajustar la jeringa con los dedos.
4. Levantar al animal suavemente y colóquelo en la parte superior de la jaula con cuidado.
5. Tome el ratón por la cola con cuidado, y el animal se agarre la parte superior de la jaula y tratar de alejar.
6. Frenar suavemente el ratón agarrando la piel floja del cuello y la parte posterior del animal con dedos pulgar e índice para evitar que se mueva la cabeza del ratón.
7. Mantenga el ratón en una posición vertical para insertar la aguja de la sonda nasogástrica y asegurar que la cabeza del ratón es inmovilizado y vertical.
8. Inserte la aguja de la sonda en la boca del ratón tras el techo de la boca y mover hacia abajo en el esófago y hacia el estómago.
9. Cuando la aguja insertada es la mitad o dos tercios longitud en el ratón, inyectar la bacteria EHEC 100 μL, que contiene aproximadamente 10⁹ UFC las células.

4. visualización

1. Después la sonda oral, detectar las señales bioluminiscentes en los días 1 y 2.
2. Antes de examinar las señales bioluminiscentes de los animales, anestesiar, poniendo en una cámara de 2,5% isoflurano con oxígeno de 1.5 L/min.
3. Espere 2-5 minutos hasta que todos los ratones se convierten en inconsciente y tope móvil. Los animales están listos para en vivo detección de bioluminiscencia.
4. Detectar y señales bioluminiscentes de los animales de la imagen de un en vivo sistema de imagen. Consulte Sección 5 "Adquisición de datos" para la operación del software. Durante el proceso de proyección de imagen, todos los animales están bajo un continuo suministro de 2,5% isoflurano con oxígeno de 1.5 L/min.
   1. Haga clic en archivo > vivo y manualmente se centran en el ratón.
   2. Seleccione la intensidad de la exposición tiempo y láser.
   3. Haga clic en adquirir > capturar.
5. Imagen ex vivo , eutanasia a los ratones por dislocación cervical y retire el intestino entero de ratones infectados. Coloque los intestinos en un plato de Petri de 9 cm e imagen del en vivo sistema de imagen. El ajuste es el mismo que el en vivo la proyección de imagen excepto el campo de visión se define como A/B. Para detalles, véase sección 5 "Adquisición de datos".
   Nota: Método de la dislocación cervical: frenar los ratones en la parte superior de la jaula agarrando la cola con una mano para que los animales agarrar la jaula. Coloque un rotulador o el pulgar y primer dedo de la otra mano contra la parte posterior del cuello en la base del cráneo. Empuje hacia adelante con la mano o algún objeto mientras la cabeza y tirar hacia atrás con la mano que sujeta la cola rápidamente.
   Cheque a confirmar detención respiratoria y no hay latidos del corazón.

5. adquisición de datos

Nota: El software utilizado para la adquisición de datos se muestra en la Tabla de materiales.

1. Para la adquisición de la imagen, abra el Panel de Control de la adquisición del software (figura 2).
2. Seleccione "Luminiscente", "fotografía" y "Superposición".
3. Tiempo de exposición determinado como "Auto." Establecer Binning como "Medio."
4. Establecer ƒ/parada 1 luminiscente y 8 para la fotografía. Ƒ/stop controles la cantidad de luz recibida por el detector del CCD.
5. Establecer el campo de visión basado en el campo de las imágenes que son de interés para adquirir. Opción "D" puede caber cinco ratones de 6 semanas de edad e imagen un momento. "C" puede imagen tres ratones de 6 semanas de edad en un campo.
6. Una vez que las muestras de ratones están preparadas para la proyección de imagen, haga clic en "Adquirir" para la adquisición de la imagen.
7. Abrir los datos de imagen que fue adquiridos.
8. Abra el panel de la paleta de herramientas (figura 3).
9. Seleccione Herramientas ROI. Recomendamos el círculo (uno izquierdo) para variar la zona bioluminiscente en imágenes (figura 4).
10. Haga clic en "Medida de ROIs" (icono de lápiz) para medir la intensidad bioluminiscente superficial (figura 3). El panel de medición de retorno de la inversión y los valores de cuantificación aparecen (figura 5).
11. Use la medida de configurar en la esquina izquierda del panel de mediciones de ROI para seleccionar la valores e información necesaria (figura 6), de lo contrario, haga clic en "Exportar" para exportar esta tabla de datos y guardar como archivo .csv (figura 5).
12. Utilice los valores de la columna "Total flujo (p/s)" como la cuantificación de la intensidad bioluminiscente en el archivo CSV.

Administramos la bioluminiscencia etiquetado EHEC (~ 109 células bacterianas) a 6 - semanas de edad hembra C57BL/6 ratones por sonda oral. Después de la inoculación oral de EHEC para ratones dentro de 1 h, los animales fueron examinados para bioluminiscente de la señal por el sistema generador de imágenes en vivo como se muestra en la figura 7. Los resultados mostraron una fuerte señal bioluminiscente en ratones por sonda nasogástrica con EHEC etiquetado bioluminiscencia. Examinamos las señales en 2 días post infección. Como se muestra en la figura 8A, los ratones inoculan con etiquetado bioluminiscencia tipo EHEC EDL933 mostró señales bioluminiscentes intenso incluso después de 2 días post infección, que sugirió que EHEC colonizados en los anfitriones por 2 días. Nosotros también intragástricamente infectados etiquetado bioluminiscencia EDL933ΔrfaD (ΔrfaD) a los ratones (figura 8A). Este mutante, desertó en lipopolisacárido (LPS), se ha demostrado para reducir la colonización en el host en nuestro estudio anterior. Como se muestra en la figura 8A, no hay ninguna señal bioluminiscente en ΔrfaD-ratones infectados, lo que sugiere que hay bacterias no o menos células colonizaron en los ratones. Cuantificación de la señal fluorescente se muestra en la figura 8B. A continuación, se determinó la ubicación de estas bacterias etiquetado bioluminiscencia. Los ratones infectados fueron sacrificados humanitariamente y quitado su intestino entero. Los intestinos de ratones 2 días post infección se colocaron en platos de Petri de 9 cm y reflejada ex vivo (Figura 9A). Los tejidos intestinales de ratones infectados EDL933 etiquetado bioluminiscencia revelaron un aumento significativo de señales bioluminiscentes en el ciego y el colon, que sugieren que estos EHEC bioluminiscente colonizados en el ciego y el colon de ratones infectados por 2 días en menos. En contraste, ratones infectados con etiquetado bioluminiscencia ΔrfaD (Figura 9A), reveló disminución de señal bioluminiscente en su tejido intestinal, lo cual es consistente con la imagen en vivo (figura 8A ). Cuantificación de la señal fluorescente se muestra en la figura 9B.

Figura 1 : Línea de tiempo del diagrama de flujo preparación experimental.
Resumen de la sincronización necesaria para preparar bacterias bioluminiscentes de EHEC y trate de ratones con estreptomicina. (A) ECEH preparación. (B) preparación de ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : En vivo panel de control sistema adquisición de imágenes.
Antes las muestras de la proyección de imagen, abra el Panel de Control de adquisición de IVIS. Seleccione "Luminiscente", "fotografía" y "Superposición". Tiempo de exposición determinado como "Auto." Establecer Binning como "Medio." Establecer ƒ/parada 1 luminiscente y 8 para la fotografía. Ƒ/stop controles la cantidad de luz recibida por el detector del CCD. Una vez que las muestras están listas para la proyección de imagen, haga clic en "Adquirir" para adquirir imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Panel de paleta de herramientas.
Después de la adquisición de la imagen, utilice el panel de la paleta de herramientas para cuantificar la intensidad bioluminiscente. Abra el panel de la paleta de herramientas y los datos de la imagen. ¡Elegir una de las herramientas de ROI para las señales bioluminiscentes en imágenes de la gama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Señal bioluminiscente de muestra para la cuantificación.
Zona bioluminiscente señal en las imágenes rodeado por herramientas de ROI. Todas las señales bioluminiscentes que se muestra aquí son en el círculo rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Las mediciones de ROI.
Después de circundar las señales bioluminiscentes y haciendo clic en "ROIs de medida" en el panel de la paleta de herramientas, se presentan los valores como se muestra. Los valores de la columna de flujo Total (p/s) se utilizan para la cuantificación de la intensidad bioluminiscente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Añadir información de cuantificación diferentes.
Haciendo clic en la medida de configurar en la esquina izquierda del panel de mediciones de ROI, puede seleccionar otros valores de cuantificación deseada e información. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Imagen representativa de los ratones después de inoculados con ECEH bioluminiscente.
Imagen representativa de los ratones inoculados con ECEH bioluminiscente por sonda oral dentro de 1 h. La escala de color representa la radiancia (/sr p/s/cm2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8 : Imágenes de ratones inocularon con ECEH etiquetado bioluminiscencia después de 2 días.
(A) representan imagen de ratones inoculados con salvaje-tipo bioluminiscente EDL933 EHEC y EDL933:ΔrfaD por sonda oral después de 2 días post infección. (B) cuantificación de la intensidad de la bioluminiscencia de ratones infectados con ECEH. Barras de error indican la desviación estándar. Se muestran imágenes representativas. Todos los experimentos se llevaron a cabo independientemente tres veces con 2-3 animales cada vez, y barras de error indican la desviación estándar. Los valores de P indican los resultados del análisis estadístico por t-test. La escala de color representa la radiancia (/sr p/s/cm2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9 : Imágenes de los tejidos intestinales de ratones infectados con ECEH etiquetado bioluminiscencia.
(A) 2 días después de la inoculación con bioluminiscencia-etiquetado EHEC, los ratones fueron sacrificados y tejidos todo intestinales fueron quitados y reflejada ex vivo. Se muestran imágenes representativas. (B) cuantificación de la intensidad de la bioluminiscencia de los tejidos intestinales de ratones infectados con ECEH. Todos los experimentos se llevaron a cabo independientemente tres veces con 2-3 animales cada vez, y barras de error indican la desviación estándar. Los valores de P indican los resultados del análisis estadístico por t-test. La escala de color representa la radiancia (/sr p/s/cm2). Barra de escala representa 1 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Condiciones de reacción en cadena (PCR) de polimerasa

Tabla 2: secuencias de la cartilla utilizadas para amplificar nptII

Los autores no tienen nada que revelar.