Se presenta un protocolo detallado de un modelo de ratón para enterohemorrágica e. coli (EHEC) colonización utilizando bacterias etiquetado bioluminiscencia. La detección de estas bacterias bioluminiscentes por un no-invasivo en vivo sistema de animales vivos de imagen puede avanzar nuestra comprensión actual de la colonización de EHEC.
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Artículo de método
Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia
En este artículo
Resumen
Resumen
Enterohemorrágica e. coli (EHEC) O157: H7, que es un patógeno de transmisión alimentaria que causesdiarrhea, colitis hemorrágica (HS), y síndrome urémico hemolítico (SUH), colonizar en el tracto intestinal de los seres humanos. Para estudiar el mecanismo detallado de la colonización de EHEC en vivo, es imprescindible disponer de modelos animales para controlar y cuantificar la colonización de EHEC. Se demuestra aquí un modelo de colonización de ratón-EHEC transformando el plásmido expresando bioluminiscente a EHEC para monitorear y cuantificar la colonización de EHEC en anfitriones de vida. Animales inoculados con ECEH etiquetado bioluminiscencia muestran intensas señales bioluminiscentes en ratones por la detección con un no-invasivo en vivo sistema de imagen. Después de 1 y 2 días post infección, señales bioluminiscentes todavía se podían detectar en los animales infectados, lo cual sugiere que EHEC colonizan en anfitriones de al menos 2 días. También demostramos que estos EHEC bioluminiscente localizar al intestino de ratón, específicamente en el ciego y el colon, de imágenes de ex vivo . Este modelo de colonización de ratón-EHEC puede servir como una herramienta para avanzar en el conocimiento actual del mecanismo de colonización de EHEC.
Introducción
ECEH O157: H7 es un patógeno que causa diarrea1, HS2, HUS3y falta renal aguda incluso4 a través de agua o alimentos contaminados. EHEC es un patógeno Enterobacter y coloniza en el tracto gastrointestinal de los seres humanos1. Cuando EHEC primero se adhieren al epitelio intestinal del anfitrión, inyectan los factores de colonización en las células del huésped a través del sistema de la secreción del III tipo (T3SS) que funciona como una jeringa molecular induciendo una fijación y borrar (A/E) lesión posteriormente para hacer cumplir adherencia (colon....
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Protocolo
PRECAUCIÓN: ECEH O157: H7 es un nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) patógeno según los centros para el Control de enfermedades y prevención de enfermedades (CDC) Instrucciones de seguridad de la biotecnología (https://www.cdc.gov/). Por lo tanto, deben realizarse todos los procedimientos experimentales que EHEC en una facilidad BSL-2. Use guantes y batas de laboratorio al realizar el experimento. Trabajo en una gabinete de la bioseguridad certificada (BSC). Desinfectar el Banco experimental antes y después del procedimiento experimental con etanol al 70%. Todos los instrumentos o equipos que EHEC contacto (o potencialmente contacto) debe ser desinfectado con etanol al 70%....
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Resultados
Administramos la bioluminiscencia etiquetado EHEC (~ 109 células bacterianas) a 6 - semanas de edad hembra C57BL/6 ratones por sonda oral. Después de la inoculación oral de EHEC para ratones dentro de 1 h, los animales fueron examinados para bioluminiscente de la señal por el sistema generador de imágenes en vivo como se muestra en la figura 7. Los resultados mostraron una fuerte señal bioluminiscente en ratones por sonda nasogástrica con .......
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Discusión
Se ha divulgado que EHEC transformada con el plásmido de la luciferasa se ha utilizado para examinar su localización en hosts o expresión de gen en vivo8,11,12. El modelo murino demostrado aquí también se ha divulgado para detectar el momento de EHEC colonizado y localización en anfitrión murino8. Sin embargo, nos ofrecen el protocolo de detalle de cómo administrar la inoculación a ratones EHEC i.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos a Chi-Chung Chen del Departamento de investigación médica, centro médico de Chi Mei (Tainan, Taiwan) la ayuda del ratón para la infección y el apoyo del centro de animales de laboratorio de la Universidad Nacional Cheng Kung. Este trabajo es apoyado por el Ministro de ciencia y tecnología (MOST) subvenciones (más 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 de and106-2321-B-006) a CC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Incubadora agitadora | YIH DER | LM-570R incubación de | bacterias |
| Incubadora de agitación orbital | FIRSTEK | S300 | incubación de bacterias |
| pBSL180 | fuente del gen nptII | ||
| pAKlux2 | fuente del operón luxCDABE | ||
| T& Un kit de clonación | Yeastern Biotech | FYC001-20P | uso para la clonación de TA |
| Nsi I | NEB | R0127S | uso para la clonación de plásmidos |
| Sca I | NEB | R0122S | uso para la clonación de plásmidos |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | uso para la clonación de plásmidos |
| Sma I | Uso de NEB | R0141S | para la clonación de plásmidos |
| Uso de la ligasa | T4 NEB | M0202S | para la clonación de plásmidos |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | uso para amplificación de PCR |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | uso para amplificación de PCR |
| Mezcla dNTP | TaKaRa | RR001A | uso para amplificación de PCR |
| PCR | máquina de PCR aplicado Biosistema | 2720 termociclador | para amplificación por PCR |
| Glicerol | SIGMA | G5516-1L | uso para solución de almacenamiento de bacterias |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | químico para hacer medio LB, 10 g/L |
| Triptona | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | producto químico para hacer medio LB, 10 g/L |
| Extracto de levadura en polvo | Affymetrix | 23547-1 KG | químico para hacer medio LB, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | químico para la fabricación de agar LB |
| kanamicina | Antibióticos Sigma | K4000-5G | , uso para la estreptomicina seleciton |
| Sigma | S6501-100G | antibióticos, eliminan la microbiota en ratones | |
| EDL933 célula competente El | casero | está en documento complementario | |
| Electroporador | MicroPulser | para electroporación | |
| Cubetas de electroporación | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | para electroporación |
| Centrífuga de alta velocidad | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | uso para centrifugar bacterias |
| Rotor de ángulo fijo | Beckman Coulter | JA25.5 | uso para centrifugar bacterias |
| Rotor de ángulo fijo | Beckman Coulter | JLA10.5 | uso para centrifugar bacterias |
| botellas de centrífuga | Beckman Coulter | REF357003 | uso para centrifugar bacterias |
| botellas de centrífuga | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | uso para centrifugar bacterias |
| Biofotómetro Eppendorf Plus | eppendorf | AG 22331 hamburgo | para medir el valor OD600 de bacterias |
| C57BL/6 ratones | Bata de laboratorio del Centro de Animales de Laboratorio de NCKU | ||
| , guantes | para la protección del personal | ||
| isoflurano | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | para anestesia de ratones, |
| jeringa de 1 ml de grado farmacéutico | uso para sonda oral de ratones | ||
| alimentación reutilizable con punta de bola de 22 G | φ 0,9 mm X L 50 mm | uso para sonda oral de ratones | |
| quirúrgico tijeras | uso para experimentos con ratones | ||
| Sistema de imágenes Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | IVIS | uso del espectro para la captura de imágenes bioluminiscentes |
| Living Image Software | Perkin Elmer | versión 4.1 | uso para cuantificar los datos de la imagen |
Referencias
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gord....
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Reimpresiones y permisos
