Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Resumen

Este artículo describe un protocolo y eficiente derivar líneas de células madre pluripotentes de embriones de ratón de la cultura en la etapa de blastocisto.

Resumen

Derivación de células madre embrionarias (mESC) de ratón es el proceso por que pluripotentes se establecen líneas celulares de embriones de preimplantación. Estas líneas conservan la capacidad de autorrenovación o diferenciar bajo condiciones específicas. Debido a estas propiedades, mESC son una herramienta útil en la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y estudios de ingeniería de tejidos. Este artículo describe un protocolo simple para obtener líneas mESC con eficiencias de derivación alta (60-80%) por cultivo de blastocistos de cepas permisivas ratón células de alimentador en definido suplementado con factor inhibidor de leucemia. El protocolo se puede aplicar también para derivar eficazmente mESC líneas de cepas de ratón no permisiva, por la simple adición de una combinación de dos inhibidores de molécula pequeña al derivación medio (2i). Se proporcionan procedimientos detallados sobre la preparación y cultivo de células de alimentador, recolección y cultivo de embriones de ratón y derivación y cultura de mESC líneas. Este protocolo no requiere equipo especializado y puede realizarse en cualquier laboratorio con experiencia en cultivo células de mamífero básico.

Introducción

Las células madre embrionarias (ESC) son células pluripotentes derivadas de embriones preimplantación, que conservan la capacidad de autorrenovación o diferenciar bajo condiciones específicas¹. Partiendo de estas propiedades, ESC se han convertido en una herramienta útil para la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y tejido ingeniería estudios².

ESC se derivan por primera vez embriones de preimplantación ratón, origina líneas ESC (mESC) de ratón con éxito bajo^3,4. Durante años, la eficacia de la derivación seguía siendo baj....

Protocolo

el uso de los animales descritos en las secciones a continuación ha sido aprobado por el Comité de ética Animal y de la investigación humana de la Universitat Autònoma de Barcelona y por el Departamento d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca Alimentació de la Generalitat de Catalunya (protocolo #8741).

1. inactivación de células de alimentador y almacenamiento

Nota: fibroblastos de prepucio humano (HFF-1) fueron congelados previamente en 1 mL de la solución congelada que consiste en 90% suero bovino Fetal (FBS) y 10% dimetil sulfóxido ( DMSO) y almacenadas en nitrógeno líquido hasta uso.

1. Descongelar u....

Resultados

Siguiendo este protocolo, debe lograrse más 95% de la formación del fruto después de la primera semana de la cultura (figura 1A). Establecimiento de líneas de la mESC luego de seis pasos es variable entre los distintos recipientes experimentales, con un éxito promedio de 60-80%. La adición de 2i no mejora significativamente los resultados cuando se trabaja con cepas de ratón permisiva, como aquellas con antecedentes de 129S2, pero es necesario cuando se traba.......

Discusión

Aunque mESC línea derivación es un procedimiento bien conocido en muchos laboratorios utilizado habitualmente, su eficiencia no siempre es tan alta como se esperaba debido a los múltiples factores que pueden perturbar el mantenimiento de la pluripotencia. En el presente artículo mostramos, paso a paso, cómo establecer líneas mESC con alta eficiencia utilizando un protocolo sencillo y fiable. Estas eficiencias son similares a los reportados en la literatura.

Para asegurar la máxima eficiencia, .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL de jeringa	BD
2-β-mercaptoetanol	Life Technologies	31350-010
Placa de 4 pocillos	Thermo Scientific Nunc	176740
Solución de Tyrode Ácido	Hecho en		Ver receta en Nagy et al, 2003. Para el almacenamiento a corto plazo (hasta 1 mes) manténgalo a 4 °C. Alternativamente, para el almacenamiento a largo plazo, manténgalo a -20 °C. Si la eficacia de la solución disminuye, debe acidificarse mediante la adición de una pequeña gota de HCl 1M.
BSA	Sigma	A3311
Pollo anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488	Sondas Moleculares - Invitrogen	A-21200	dilución 1:500. Anticuerpo secundario para anticuerpos de ratón Oct4, Tuj1, αSMA y AFP.
CHIR990212	Axon Medchem	1386	Reconstituir con 2,15 ml de DMSO por cada mg de polvo, para obtener una solución madre de 1 mM. Alícuota al volumen deseado y almacene a -20ºC. Evite los ciclos de congelación y descongelación.
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	Inactívelo antes de usarlo calentándolo durante 30 minutos a 56ºC. Aliquot y guárdelo a -20º C
Aguja de lavado	BD	304000	Cortar el extremo de la aguja y moler hasta obtener una punta roma sobre una piedra abrasiva
Gelatina de piel de cerdo	Fluka	48724	Diluir al 0,2% en agua destilada y esterilizarla en autoclave. Cada dilución se puede utilizar durante un mes.
IgG anti-Conejo de Cabra, Alexa Fluor 594	Sondas Moleculares - Invitrogen	A-11037	dilución 1:500. Anticuerpo secundario para el anticuerpo de conejo Sox2.
HBSS	BioWest	L0611
CZB	Hecho		en casa Ver composición en Chatot et al, 1989
Gonadotropina coriónica humana	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	Diluir en NaCl 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotar en 1 ml y almacenar a -20º C durante un máximo de dos meses. Una vez descongelado, no vuelva a congelar.
Fibroblastos del prepucio humano	ATCC	ATCCSCRC-1041	Para el almacenamiento a largo plazo se recomienda almacenarlos en nitrógeno líquido.
KnockOut Serum Replacement Life	Technologies	10828-028	Fotosensible. Se recomienda alícuota en pequeños volúmenes como 10 ml y almacenarlo a -20º C (comprobar la fecha de caducidad). Evite los ciclos de congelación y descongelación.
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	Suplemento con 4 mg/ml de BSA. Equilibrio a 37º C y 5% de CO2 al día antes de su uso.
Factor inhibidor de la leucemia	Merk Millipore	ESG1106
ratones	Charles River/Harlan		Se recomienda utilizar ratones de una cepa permisiva en términos de derivación de mESC (como 129S2 o C57BL). Sin embargo, las cepas endogámicas son menos eficientes en la producción de embriones. Por lo tanto, se recomienda utilizar una cepa híbrida, como 129S2 x C57BL o B6CBAF1 para aprovechar el vigor híbrido.
Aceite mineral	Sigma	M8410	Embrión testado. Fotosensible.
Mitomicina C	Serva	2980501	Reconstituir el polvo con agua MilliQ a 0,5 mg/ml. Almacenar a 4º C protegido de la luz. Atención, es dañino y se sospecha que causa cáncer.
Anti-tubulina y beta para ratones; III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	Dilución 1:500
Monoclonal de ratón anti-&alfa;SMA		Sigma A5228	Dilución 1:200
Monoclonal de ratón anti-AFP	R& D Systems	MAB1368	dilución 1:50
anti monoclonal de ratón Oct3/4	Santa cruz	Sc-5279	dilución 1:50
Aminoácidos no esenciales Life	Technologies	11140-035
PD0325901	Axon Medchem	1408	Reconstituir con 2,08 ml de DMSO por cada mg de polvo, para obtener una solución madre de 1 mM. Alícuota al volumen deseado y almacene a -20ºC. Evite los ciclos de congelación y descongelación.
Placa de Petri (35 mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
Placa de Petri (60 mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
Gonadotropina sérica de yegua preñada	Foligon	Foligon-1000 UI	Diluir en NaCl al 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotar en 1 ml y almacenar a -20º C durante un máximo de dos meses. Una vez descongelado, no vuelva a congelar.
Conejo policlonal anti-Sox2	Merck Millipore	AB5603	dilución 1:200
T75 halcón	Thermo Scientific	130190
Trypsin-EDTA 10x	BioWest	X0930	Diluir 1:10 en HBSS para obtener una solución 1x

309628 casa