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Artículo de método

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

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DOI:

10.3791/56171

⸱

20 de agosto de 2017

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un protocolo y eficiente derivar líneas de células madre pluripotentes de embriones de ratón de la cultura en la etapa de blastocisto.

Resumen

Derivación de células madre embrionarias (mESC) de ratón es el proceso por que pluripotentes se establecen líneas celulares de embriones de preimplantación. Estas líneas conservan la capacidad de autorrenovación o diferenciar bajo condiciones específicas. Debido a estas propiedades, mESC son una herramienta útil en la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y estudios de ingeniería de tejidos. Este artículo describe un protocolo simple para obtener líneas mESC con eficiencias de derivación alta (60-80%) por cultivo de blastocistos de cepas permisivas ratón células de alimentador en definido suplementado con factor inhibidor de leucemia. El protocolo se puede aplicar también para derivar eficazmente mESC líneas de cepas de ratón no permisiva, por la simple adición de una combinación de dos inhibidores de molécula pequeña al derivación medio (2i). Se proporcionan procedimientos detallados sobre la preparación y cultivo de células de alimentador, recolección y cultivo de embriones de ratón y derivación y cultura de mESC líneas. Este protocolo no requiere equipo especializado y puede realizarse en cualquier laboratorio con experiencia en cultivo células de mamífero básico.

Introducción

Las células madre embrionarias (ESC) son células pluripotentes derivadas de embriones preimplantación, que conservan la capacidad de autorrenovación o diferenciar bajo condiciones específicas1. Partiendo de estas propiedades, ESC se han convertido en una herramienta útil para la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y tejido ingeniería estudios2.

ESC se derivan por primera vez embriones de preimplantación ratón, origina líneas ESC (mESC) de ratón con éxito bajo3,4. Durante años, la eficacia de la derivación seguía siendo baja debido a la dificultad de mantenimiento de la pluripotencia in vitro. Además de la presencia de alimentador células5, que mejorar la eficiencia de la derivación, promover la fijación de la Colonia y mejorar estabilidad cariotípica6, varias modificaciones del protocolo conducen a una mejora en el mantenimiento de la pluripotencia. El más importantes eran la adición de Factor inhibitorio de leucemia (LIF) para mESC medio de cultivo7,8, el uso de embriones de la 129S2 fondo permisiva9 y define la cultura de la mESC con suplementado con suero, libre de potenciales factores de diferenciación10. Más recientemente, convincente evidencia ha demostrado que la adición de un cóctel de dos moduladores de molécula pequeña de vías de señalización al medio de cultivo mESC (conocido como 2i) es mejor mantener la pluripotencialidad. El 2i cóctel consiste en una combinación de inhibidor de la MEK PD0325901, que reduce las señales de diferenciación mediante la inhibición de la vía de la quinasa (MAPK) de proteína mitogen-activados, y el inhibidor de la GSK3β CHIR99021, que mejora la supervivencia de la célula a baja densidad mediante la activación de la vía Wnt del11.

En el presente artículo, se describe un protocolo simple para derivar eficazmente mESC líneas de blastocistos de ratón. Seguimos procedimientos estándar, cultivo de embriones de cepas permisivas en las células de alimentador en medio de la derivación con LIF y un recambio de suero12. Siguiendo este protocolo, mESC líneas puede derivarse con rendimientos equivalentes a las obtenidas en medio 2i. A pesar de esto, pueden agregarse 2i para evitar posibles problemas con el mantenimiento de la pluripotencia o cuando se trabaja con cepas no permisiva.

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Protocolo

el uso de los animales descritos en las secciones a continuación ha sido aprobado por el Comité de ética Animal y de la investigación humana de la Universitat Autònoma de Barcelona y por el Departamento d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca Alimentació de la Generalitat de Catalunya (protocolo #8741).

1. inactivación de células de alimentador y almacenamiento

Nota: fibroblastos de prepucio humano (HFF-1) fueron congelados previamente en 1 mL de la solución congelada que consiste en 90% suero bovino Fetal (FBS) y 10% dimetil sulfóxido ( DMSO) y almacenadas en nitrógeno líquido hasta uso.

  1. Descongelar un vial criogénico de HFF-1 (1 mL) sumergiendo el frasco en un baño de agua de 37 ° C.
  2. Agregar el contenido descongelado del frasco criogénico a precalentado Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medio (DMEM) suplementado con 10% FBS para hacer un 1:10 dilución.
  3. Las células diluidas (10 mL) de semillas en un frasco de T75 y cultivo a 37 ° C y 5% CO 2.
  4. Al día siguiente, cambiar el medio para eliminar los restos de DMSO. Quite el medio y añadir 10 mL de precalentado DMEM suplementado con 10% FBS.
  5. Cultura las HFFs y cambiar el medio cada 48 h hasta que la cultura llegue a la etapa confluente. Esto puede tardar aproximadamente 7 a 10 días.
  6. Para preparar la solución de inactivación, diluir la mitomicina C en DMEM suplementado con 10% FBS a una concentración final de 10 μg/mL. Incubar las células con la solución de inactivación por 3 h a 37 ° C y 5% CO 2.
  7. Eliminar la inactivación de la solución y enjuague las células tres veces con 2 mL de Hanks balanceada sal solución (HBSS) para eliminar restos de mitomicina C.
  8. Para separar las células inactivadas, añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA precalentado e incubar 5 min a 37 ° C y 5% CO 2.
  9. Observar las células bajo un microscopio invertido para asegurar que están separadas (objetivo de 10 x 0.3 apertura numérica o NA). Si no, los incuban durante un par de minutos más a 37 ° C y 5% CO 2. Compruebe las células otra vez bajo el microscopio invertido.
  10. Pipetear la solución con una pipeta Pasteur para disociar las matas celular.
  11. Neutralizar la solución enzimática añadiendo 4 mL de DMEM suplementado con 10% FBS y resuspender.
  12. Toma una alícuota de la suspensión de células y hace una dilución 1: 100 en HBSS. Para determinar el número de células, cargar 10 μl de la dilución en un Neubauer ' cámara de s. Contar las células situadas en una de las grandes plazas de la cámara en un microscopio invertido (objetivo 20 x con un NA 0.45).
    1. Repetir el recuento en un total de cuatro cuadrados grandes. Calcular el número total de células (N) n = número promedio de células contadas x volumen total x dilución x 10 4.
  13. Centrifugar el resto de la muestra durante 5 min a 200 x g. descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con congelación de la solución en una concentración de 10 6 células / mL.
  14. Alícuota la suspensión en frascos criogénicos con 10 6 celdas (1 mL) cada uno. Coloque los frascos criogénicos en un recipiente de congelación y congelación a -80 ° C.
  15. Al día siguiente, guarde los viales criogénicos de nitrógeno líquido.

2. Cultivo de células de alimentador

  1. uno a cuatro días antes de iniciar el proceso de derivación, inactivado de descongelar un vial criogénico que contiene 1 x 10 6 células de HFF-1 en un baño de agua a 37 ° C.
  2. Hacer una dilución de 1:6 del HFF-1 descongelado en pre calentado DMEM suplementado con 10% FBS y mantenga la temperatura a 37 ° C.
  3. Llene cada pocillo de una placa de 4 pozos con 500 μl de precalentado 0.2% de gelatina de piel porcina y mantenga la placa a 37 ° C durante 10 minutos
  4. Quitar el 500 μl de la gelatina de los pozos y agregar 500 μl de la dilución de HFFs. Muévalo suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las HFFs en la parte inferior de los pozos. Evitar movimientos circulares, de lo contrario las células se concentrarán en el centro del pozo.
  5. Incubar la placa por lo menos 24 h a 37 ° C y 5% CO 2 para obtener una monocapa de HFFs inactivados en cada pozo.
  6. Al día siguiente, observar las células bajo un microscopio invertido (objetivo de 10 X con NA 0.3) y compruebe que están conectados y distribuidos homogéneamente. Cambiar el medio para eliminar los restos de DMSO. Quite el medio y agregar 500 μl de precalentado DMEM suplementado con 10% FBS.

3. Colección de embriones y de la cultura

  1. cuatro días antes de la recogida de embriones, administrar 5 UI de yegua preñada ' gonadotropina del suero de s por inyección intraperitoneal a ratones hembra 6-12 semanas de edad.
    Nota: Hemos utilizado las hembras de los 129S2 o cepas de B6CFAF1, aunque las hembras de otras cepas de ratón pueden ser utilizadas. Sin embargo, cuando trabajo con hembras de cepas no-permisivas (por ejemplo, CBA), medio debería complementarse con 2i como se menciona en el paso 4.2.
  2. Después de 48 h, administrar 5 UI de gonadotropina coriónica humana por inyección intraperitoneal y aparearse las hembras con los machos, por lo menos 8 semanas de edad, en una proporción 1:1. Separar las hembras de los machos al día siguiente.
  3. El día antes de embrión, preparar un cultivo de células de 35 mm placa de Petri con varias gotas de μl 40 KSOMaag suplementado con 4 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) y llenar el plato con aceite mineral para cubrir completamente las gotas. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO 2 para equilibrar el medio.
  4. Para preparar pipetas de la manipulación del embrión, calienta la parte más delgada de un cristal con punta larga pipeta Pasteur utilizando un mechero Bunsen. Una vez suave, retirar del fuego y separe los dos extremos. Romper a la longitud deseada. El diámetro interior en la punta debe ser 100-150 μm.
  5. Eutanasia los ratones hembra por dislocación cervical 45-48 h post-coitum (p.c.).
  6. Disecar ratones para exponer la cavidad abdominal mediante la reducción de la piel con unas tijeras afiladas lisas curvadas y peritoneo con tijeras recta agudos. Agarrar un útero con pinzas, corte el oviducto utilizando unas tijeras afiladas rectas y colóquelo en CZB tamponado con Hepes medio (HCZB) 13 a 37 ° C. Repita el proceso para eliminar el otro oviducto.
  7. Descarga los oviductos con una jeringa de 1 mL cargados con HCZB sostenido por pinzas de relojero para recoger los embriones de 2 células.
    Nota: Para preparar la aguja lavado, tomar una aguja de hipodérmica 30 G, corte el extremo y una punta Roma en una piedra abrasiva de tierra.
  8. Usando el aparato de la pipeta de boca, recoger los embriones, lavar en HCZB y les cultura en la placa de cultivo de embriones previamente preparado a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta la fase de blastocisto. Hasta 50 embriones pueden ser cultivados en cada gota de 40 μl. Supervisar el desarrollo del embrión cada 24 h bajo un estereomicroscopio.
    Nota: Como alternativa, los embriones pueden recogerse en la etapa de blastocisto para acortar en vitro el cultivo de embriones. En este caso, las hembras de eutanasia en día 3.5-4.5 p.c., diseccionar el útero. y enjuague con HCZB.

4. Derivación de células madre

  1. preparación de las placas de derivación
    1. en el día de la siembra de embriones, preparar el medio de derivación complementando el medio DMEM con 100 μm 2-β-mercaptoetanol, 1 x de los aminoácidos no esenciales , el 20% de reemplazo de suero y 10 3 U/mL LIF.
    2. Si lo desea, también añadir 1 μm del inhibidor MEK PD0325901 y 3 μm del inhibidor GSK3 CHIR99021 para obtener un medio de 2i.
    3. Tomar la placa de 4 pozos con la monocapa de HFFs inactivadas (paso 2.6) de la incubadora. Quite el medio y añadir 800 μl de medio con derivación a cada pocillo. Devolver la placa a la incubadora de.
  2. Retiro de la Zona pelúcida y embrión siembra
    1. preparar un cultivo celular de 35 mm placa de Petri con gotas tres 30 μl de ácido Tyrode ' s solución 14 y gotas tres 30 μl de medio de derivación. Cubrir las gotas con aceite mineral y mantener el plato a 37 ° C.
    2. Tomar la placa de cultivo de embrión de la incubadora. Uno por uno, transfiera los blastocistos de las gotas de cultura a un ácido Tyrode ' gota de la solución de s con una pipeta de manipulación de embriones. Si es posible, seleccione sólo los blastocistos expandidos para iniciar el proceso de derivación.
    3. Monitor la zona pelúcida digestión bajo el estereomicroscopio. Tan pronto como desaparece la zona pelúcida, transferir el blastocisto a una gota media de derivación para lavar el ácido Tyrode ' solución s.
    4. Tomar la placa de 4 pozos de derivación de la incubadora y semilla de una zona libre blastocisto en el alimentador de células en cada pozo.
    5. Volver la placa de 4 pozos de derivación a la incubadora y la cultura en 37 ° C y 5% CO 2.
  3. Crecimiento de la célula de vástago de monitoreo y medio cambio
    1. vigilar los cultivos cada 24 h debajo de un microscopio invertido (objetivo 20 X con NA 0.45). Es importante observar si hay signos de diferenciación de células madre, como células refractivas inflamadas que rodea el fruto o incluso empujar el alimentador células aparte.
    2. Día, cambiar el medio de la cultura. Tomar la placa de 4 pozos de la incubadora, retire el medio de cada bien y añadir 800 μl de medio con derivación suplementado con LIF y 2i, si se utiliza. Mantener la cultura hasta crecimientos se observan (días 6-8).

5. Mantenimiento y cultivo de células de vástago

asas de Kolle-como
  1. preparar y pipetas de manipulación de células madre. Siga el paso 3.4 preparar pipetas de manipulación de la célula de vástago con diámetro interno en la punta de 250-300 μm. utilizar la otra parte de la pipeta de Pasteur tirada para preparar el mango de Kolle-como. Calor y la forma hasta obtener un gancho de.
  2. Tomar la placa de cultivo de 4 pozos fuera de la incubadora y localizar la consecuencia bajo un estereomicroscopio. Use la manija para alejar las células diferenciadas y los alimentadores que rodean el fruto.
    Nota: Para evitar eventual diferenciación de la consecuencia, es importante eliminar todas las células diferenciadas del borde de la extensión.
  3. Aspire el fruto con una pipeta de la manipulación de células madre y coloque en un plato nuevo en una gota de tripsina-EDTA 50 μl.
  4. Utilizar un bisturí para cortar el fruto en varias partes para desagregación mecánica y enzimáticamente.
  5. , Transferencia de los fragmentos del fruto en una dulce gota de medio de derivación para neutralizar la acción de la tripsina.
  6. Transferencia de los fragmentos del fruto a una nueva placa de 4 pozos con una monocapa de alimentadores. Transferencia de fragmentos de hasta 10 por pozo y de la cultura con un medio de derivación a 37 ° C y 5% CO 2.
  7. Mantener las culturas de célula de vástago-como por lo menos seis semanas antes de considerar la línea mESC establecida. Cambiar el medio cada otro día y subcultura ellas una vez por semana.

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Resultados

Siguiendo este protocolo, debe lograrse más 95% de la formación del fruto después de la primera semana de la cultura (figura 1A). Establecimiento de líneas de la mESC luego de seis pasos es variable entre los distintos recipientes experimentales, con un éxito promedio de 60-80%. La adición de 2i no mejora significativamente los resultados cuando se trabaja con cepas de ratón permisiva, como aquellas con antecedentes de 129S2, pero es necesario cuando se traba...

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Discusión

Aunque mESC línea derivación es un procedimiento bien conocido en muchos laboratorios utilizado habitualmente, su eficiencia no siempre es tan alta como se esperaba debido a los múltiples factores que pueden perturbar el mantenimiento de la pluripotencia. En el presente artículo mostramos, paso a paso, cómo establecer líneas mESC con alta eficiencia utilizando un protocolo sencillo y fiable. Estas eficiencias son similares a los reportados en la literatura.

Para asegurar la máxima eficiencia, ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Jonatan Lucas por su asistencia técnica en cultivo de células de alimentador, Servei Estabulari de la UAB para el cuidado de los animales y Domènec Martín para grabar el video. Este trabajo ha sido apoyado por el Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R y la Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC es beneficiario de una beca de PIF-UAB.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 mL de jeringaBD 
2-β-mercaptoetanolLife Technologies31350-010
Placa de 4 pocillosThermo Scientific Nunc176740
Solución de Tyrode Ácido Hecho enVer receta en Nagy et al, 2003. Para el almacenamiento a corto plazo (hasta 1 mes) manténgalo a 4 °C. Alternativamente, para el almacenamiento a largo plazo, manténgalo a -20 °C. Si la eficacia de la solución disminuye, debe acidificarse mediante la adición de una pequeña gota de HCl 1M.
BSASigmaA3311
Pollo anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488Sondas Moleculares - InvitrogenA-21200dilución 1:500. Anticuerpo secundario para anticuerpos de ratón Oct4, Tuj1, αSMA y AFP. 
CHIR990212Axon Medchem 1386Reconstituir con 2,15 ml de DMSO por cada mg de polvo, para obtener una solución madre de 1 mM. Alícuota al volumen deseado y almacene a -20ºC. Evite los ciclos de congelación y descongelación. 
CryoTubeThermo Scientific Nunc3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810Inactívelo antes de usarlo calentándolo durante 30 minutos a 56ºC. Aliquot y guárdelo a -20º C
Aguja de lavadoBD 304000Cortar el extremo de la aguja y moler hasta obtener una punta roma sobre una piedra abrasiva
Gelatina de piel de cerdoFluka48724Diluir al 0,2% en agua destilada y esterilizarla en autoclave. Cada dilución se puede utilizar durante un mes.
IgG anti-Conejo de Cabra, Alexa Fluor 594Sondas Moleculares - InvitrogenA-11037dilución 1:500. Anticuerpo secundario para el anticuerpo de conejo Sox2.
HBSSBioWestL0611
CZB Hechoen casa Ver composición en Chatot et al, 1989
Gonadotropina coriónica humanaDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UIDiluir en NaCl 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotar en 1 ml y almacenar a -20º C durante un máximo de dos meses. Una vez descongelado, no vuelva a congelar.
Fibroblastos del prepucio humanoATCCATCCSCRC-1041Para el almacenamiento a largo plazo se recomienda almacenarlos en nitrógeno líquido.
KnockOut Serum Replacement LifeTechnologies  10828-028Fotosensible. Se recomienda alícuota en pequeños volúmenes como 10 ml y almacenarlo a -20º C (comprobar la fecha de caducidad). Evite los ciclos de congelación y descongelación.    
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050Suplemento con 4 mg/ml de BSA. Equilibrio a 37º C y 5% de CO2 al día antes de su uso.
Factor inhibidor de la leucemiaMerk MilliporeESG1106
ratones Charles River/HarlanSe recomienda utilizar ratones de una cepa permisiva en términos de derivación de mESC (como 129S2 o C57BL). Sin embargo, las cepas endogámicas son menos eficientes en la producción de embriones. Por lo tanto, se recomienda utilizar una cepa híbrida, como 129S2 x C57BL o B6CBAF1 para aprovechar el vigor híbrido.
Aceite mineralSigmaM8410Embrión testado. Fotosensible. 
Mitomicina CServa2980501Reconstituir el polvo con agua MilliQ a 0,5 mg/ml. Almacenar a 4º C protegido de la luz. Atención, es dañino y se sospecha que causa cáncer.
Anti-tubulina y beta para ratones; III (Tuj1)BiolegendMMS-435PDilución 1:500
Monoclonal de ratón anti-&alfa;SMASigma A5228Dilución 1:200
Monoclonal de ratón anti-AFPR& D SystemsMAB1368dilución 1:50
anti monoclonal de ratón Oct3/4 Santa cruzSc-5279dilución 1:50
Aminoácidos no esenciales LifeTechnologies11140-035
PD0325901Axon Medchem 1408Reconstituir con 2,08 ml de DMSO por cada mg de polvo, para obtener una solución madre de 1 mM. Alícuota al volumen deseado y almacene a -20ºC. Evite los ciclos de congelación y descongelación.
Placa de Petri (35 mm)Thermo Scientific Nunc153066
Placa de Petri (60 mm)Thermo Scientific Nunc150288
Gonadotropina sérica de yegua preñadaFoligonFoligon-1000 UIDiluir en NaCl al 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotar en 1 ml y almacenar a -20º C durante un máximo de dos meses. Una vez descongelado, no vuelva a congelar.
Conejo policlonal anti-Sox2Merck MilliporeAB5603dilución 1:200
T75 halcónThermo Scientific130190
Trypsin-EDTA 10xBioWestX0930Diluir 1:10 en HBSS para obtener una solución 1x
309628 casa

Referencias

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