Simple eliminación de la fluorescencia del fondo en el tejido cerebral humano fijados con formol para microscopia de la inmunofluorescencia

Resumen

Fondo de Autofluorescencia de las muestras biológicas a menudo complica basada en fluorescencia las técnicas de imagen, especialmente en tejidos postmitotic humanos envejecidos. Este protocolo describe cómo autofluorescence de estas muestras puede eliminarse eficazmente usando un comercialmente disponible luz de diodo electroluminoso fuente para photobleach la muestra antes de la inmunotinción.

Resumen

La inmunofluorescencia es un método común utilizado para visualizar los compartimientos subcelulares y a determinar la localización de proteínas específicas en una muestra de tejido. Un gran obstáculo para la adquisición de imágenes de alta calidad inmunofluorescencia es endógeno autofluorescencia de los tejidos causado por pigmentos como la lipofucsina de envejecimiento o por procesos de preparación de muestra comunes tales como fijación de aldehído. Este protocolo describe cómo fluorescencia del fondo puede ser grandemente reducida por photobleaching utilizando fósforo blanco electroluminoso arreglos de diodos (LED) antes del tratamiento con sondas fluorescentes. La emisión del amplio-espectro de fósforo blanco LEDs permiten blanquear de fluoróforos en una gama de picos de emisión. El aparato de fotoblanqueo puede construir a partir de componentes estándares a muy bajo costo y ofrece una alternativa accesible para extintores químicos disponibles en el mercado. Un tratamiento previo de fotoblanqueo del tejido seguido manchando de la inmunofluorescencia convencional genera imágenes de Autofluorescencia de fondo. En comparación con extintores químicos que reducen la sonda así como fondo de establecer señales, photobleaching tratamiento no tuvo efecto sobre intensidad de fluorescencia de la sonda mientras que efectivamente redujo la fluorescencia de fondo y del lipofuscin. Aunque fotoblanqueo requiere más tiempo de tratamiento previo, pueden utilizarse matrices de LED de mayor intensidad para reducir el tiempo de fotoblanqueo. Potencialmente, este sencillo método puede aplicarse a una variedad de tejidos, los tejidos particularmente postmitotic que acumulan lipofuscina como el cerebro y los músculos cardíacos o esqueléticos.

Introducción

Microscopía de fluorescencia con anticuerpos contra proteínas específicas se utiliza habitualmente para visualizar proteínas de interés en cultivo de células y tejidos. Una complicación importante a la adquisición de imágenes claras y definitivas en la inmunofluorescencia es autofluorescencia, que puede ser causada endógeno en tejidos de mamíferos por la edad del pigmento lipofucsina y por proteínas como la elastina y el colágeno^{1, 2}. Otras fuentes de Autofluorescencia pueden ser introducidos a través de pasos de preparación de la muestra como aldehído fijación³. Gránulos de lipofuscina, compuestos principalmente de proteínas modificadas oxidativamente y residuos de la degradación de lípidos, se acumulan en las células de larga vida con aumento de la edad². Esto causa dificultades en la proyección de imagen postmitotic tejidos como el cerebro y los músculos esqueléticos o cardiacos, como el espectro de emisión de fluorescencia de lipofuscin es amplio y variable, a menudo coincidiendo con la longitud de onda de emisión de los fluoróforos común utilizado para etiquetado⁴. Estos factores hacen que la proyección de imagen del tejido de cerebro humano de casos de enfermedades neurodegenerativas de aparición tardía como degeneración lobar frontotemporal (DLFT) especialmente desafiante.

Para reducir la autofluorescencia, hemos ideado una técnica que nos irradian las secciones de tejidos montados en portaobjetos con una arreglo de diodos (LED) usando una lámpara de escritorio hogar⁵de emisión de luz blanca. Esta técnica simple proporciona una alternativa a las técnicas que utilizan a extintores químicos como CuSO₄ en acetato de amonio, o comercialmente disponible Temple colorantes como el Sudán negro B y eriocromo negro T⁶. También cuenta con importante ahorro de costes sobre multiespectral técnicas de fotoblanqueo de lámpara de LED y evita complicaciones y artefactos generados a partir de métodos de extracción digital autofluorescence como espectral sin mezcla de^7,8. Fósforo blanco LED tienen un amplio espectro de emisión, alta luminosidad y fabricación bajo costo, lo que es ideal como un componente estándar de fotoblanqueo diversos cromóforos^5,9.

En este protocolo, demostrar la construcción de un aparato de photobleaching con componentes accesibles y fotoblanqueo se aplican a un caso de tejido de DLFT con inclusiones tau-positivas (DLFT-T) utilizando un anticuerpo específico para tau fosforilada. Demostrar el efecto de fotoblanqueo en proyección de imagen anticuerpos marcados con fluorescencia empleando dos cromóforos habituales: Alexa 488 y rojo de Texas. El efecto de fotoblanqueo versus secciones no tratadas o tratados con un extintor químico comercial son cuantificados y comparados. Este tratamiento previo de photobleaching puede ser incorporado en cualquier protocolo de tinción de inmunofluorescencia estándar para quitar autofluorescencia en una muestra biológica.

Protocolo

Nota: el trabajo presentado fue realizado en cumplimiento de las normas internacionales reconocidas, incluyendo la Conferencia Internacional sobre armonización (ICH), el Consejo para internacional organizaciones de Medical Sciences (CIOMS) y los principios de la declaración de Helsinki. Uso de tejido humano fue con la aprobación de la Junta de ética de investigación de la Universidad salud red. Se recolectaron las muestras de cerebro humano como una parte del Banco de tejido cerebral marítimo. En el momento de la recogida, se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes.

1. construcción de aparatos de fotoblanqueo y soluciones

1. preparación de soluciones madre.
   1. Preparar 1 L de 1 x solución stock solución salina tamponada con Tris (1 x TBS) (150 mM de NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) disolviendo 8,77 g de NaCl y 6,06 g de Tris base en 800 mL de ddH ₂ O y ajustar el pH a 7.4 con HCl. lleve el volumen a 1 L y autoclave. < / li >
   2. preparar azida sódica al 10% (valores de x 200) disolviendo 1 g de azida de sodio en 10 mL de ddH ₂ O (10%, bolsa 200 x).
2. Para 1-3 diapositivas de tamaño estándar, utilizar un plato de petri individuales de 100 x 100 mm transparente, cuadrado como una cámara de diapositivas. Para la cámara de una sola diapositiva, agregar 0,25 mL de caldo de azida de sodio de x 200 a 50 mL de 1 x TBS para hacer una solución de 0.05% de azida-TBS. Pila 2-3 cámaras de slide vertical para proceso de diapositivas adicionales. Preparar un adicional 50 mL de solución de azida-TBS para cada cámara de.
3. Crear un andamio para elevar las cámaras diapositiva que puede caber la cabeza de una lámpara debajo. Cámara de diapositivas
   1. para un 100 mm x 100 mm, corte las aberturas en la parte inferior y los lados de un 100 x 100 mm x 30 mm plástico contenedor e invierta el recipiente. Las aberturas laterales sean lo suficientemente grandes para colocar una fuente de luz LED y asegurar la abertura inferior es lo suficientemente grande tal que la luz de la fuente de luz llega a la cámara de muestra sin impedimento.
   2. Aplique cinta aislante al andamio para aumentar la adherencia entre el andamio y la cámara de muestra/Banco. Utilizar materiales alternativos para construir el andamio mientras bien eleva el compartimiento portaobjetos sin obstaculizar la luz llegue a la muestra.
4. Eliminar difusores o plástico opaco de la lámpara de escritorio que puede impedir que la luz llegue directamente a la muestra (si es posible) y orientar el arsenal del LED hacia arriba. Coloque las cámaras del andamio y deslice sobre la matriz de LED. Use una lámpara con un cuello flexible para fácil manipulación.
5. Construir una cúpula reflectora tapa para aparato recubre el interior de una caja lo suficientemente grande como para cubrir la cámara de la diapositiva y andamio con papel de aluminio. Utilice una caja de punta de pipeta de 1 mL para una sola cámara o 150 mm x 150 mm x 150 mm cartón por múltiples, verticalmente apilados cámaras.

2. Fotoblanqueo pre-tratamiento de las secciones de tejido

Nota: preparación de la sección de tejido puede variar dependiendo de la fuente de tejidos y fijación y embebido de los métodos utilizados. Aquí, el tejido cerebral (orbitofrontal convoluciones del cerebro) de un caso de DLFT-T se fijó para ~ 2 días en formalina, correr a través de un gradiente de sacarosa, incrustado en OCT y corte para secciones gruesas de 10 μm con un criostato.

1. Frío de º c en un 4 habitación, gabinete fría o refrigerador, Oriente la lámpara bajo el andamio y coloque la cámara muestra en el andamio. Verter 50 mL de solución de azida-TBS en la cámara de muestras.
2. Sumerja los cortes de tejidos montan en portaobjetos de vidrio estándar en la cámara de la diapositiva que contiene azida-TBS con unas pinzas limpias. Para varias diapositivas, asegúrese de que las diapositivas se colocan en la cámara en una sola capa.
3. Cubra el aparato con la cúpula de reflexivo, encender la lámpara del LED e incubar 48 h a 4 º c.

3. La inmunofluorescencia

1. teñir el tejido para tau fosforilada con contratinción DAPI y Alexa 488 y anticuerpos secundarios conjugados con rojo Texas, primero preparar soluciones para recuperación de antígeno, permeabilización, bloqueo y primaria Unión de anticuerpos.
   1. Preparar 500 mL de recuperación de antígeno buffer (10 mM cítrico, ácido etilendiaminotetracético de 2 mM, de 0.05% Tween 20, pH 6.2) por 0,92 g de ácido cítrico y 0,37 g de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en 500 mL de ddH ₂ O. ajustar el pH de la disolución 6.2 con NaOH y agregar 0,25 mL de Tween 20.
   2. Preparar 500 mL de 0.025% Tritón X-100 en la solución TBS (TBS-Triton) añadiendo 0,125 mL de Triton X-100 y 500 mL 1 x cucharada
   3. Prepare una solución de 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en TBS (BSA-TBS tampón) disolviendo 0,1 g de BSA en 10 mL de TBS.
   4. Preparar una solución de bloqueo mediante la adición de 0,2 mL de suero normal de cabra a 1.8 mL de 1% BSA/cucharada
   5. Para cada diapositiva, preparar 150 μL de solución de anticuerpo primario (dilución 1: 100) por pipeteo 1,5 μl de anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) anticuerpos en 148,5 μL 1% BSA-TBS tampón y dejar en hielo.
2. Para realizar recuperación de antígeno, sumergir los portaobjetos photobleached verticalmente en un colector de diapositiva 25 ml de tampón de recuperación de antígeno. Asegure el colector con cinta o cadenas de tal manera que el colector no cae en el baño de agua. El colector en un baño de agua a 90 º c por 30 min de calor y permitir que el colector se enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de retirar los portaobjetos. Hacer no quite las diapositivas inmediatamente ya que hará que las secciones a.
3. Transferir las diapositivas desde el colector de la recuperación de antígeno en una jarra de tinción llenada con 30 mL de TBS-Tritón y las secciones de 5 min en un agitador orbital con agitación suave. Repita el lavado una vez con fresco TBS-Tritón. Mecha lejos exceso de tampón con una pelusa y el contorno del tejido con un lápiz hidrofóbico. Tenga cuidado de no para dejar el portaobjetos secar.
   1. Para cada diapositiva, bloquear el tejido por pipetear 200 μL de bloquear la solución en el tejido y colocar el portaobjetos en una cámara humidificada. Construcción de la cámara mediante la colocación de una parrilla dentro de una caja de punta de la pipeta que contiene una toalla de papel húmeda. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h en una superficie nivelada. Asegurar que la solución de bloqueo cubre completamente el tejido.
4. Retire la solución de bloqueo por la aspiración y Pipetear 100-150 μL de solución de anticuerpo primario sobre el tejido. Garantizar un volumen suficiente de anticuerpos está presente y que la sección es sobre una superficie nivelada para evitar la puesta en común de solución de anticuerpo a un lado. Incubar a 4 º c durante la noche en una cámara humidificada.
5. Preparar la mezcla del anticuerpo secundario y la contratinción nuclear DAPI.
   1. Para cada diapositiva, preparar 150 μL de mezcla de anticuerpo secundario (diluciones 1: 100) mediante la adición de 1,5 μl de cabra anti-ratón Alexa 488 y 1,5 μl de cabra anti-ratón Texas Red a 147 μl de BSA-TBS y dejar en hielo.
   2. Preparar 0.1 μg/mL DAPI contratinción por dilución seriada. Homogeneizar la solución y diluir a 1 μl de DAPI en 999 de TBS para hacer 1 mL de solución de 5 μg/mL de stock 5 mg/mL. Para cada diapositiva, diluir 3 μL de solución de 5 μg/mL con 147 μl de TBS a una concentración final de 0.1 μg/mL.
      PRECAUCIÓN: DAPI es un mutágeno conocido y deben ser manejado con cuidado.
6. Quitar el anticuerpo primario por aspiración. Sumerja los portaobjetos en un vaso de tinción frasco con 30 mL de TBS-Triton y lavado durante 5 minutos con suaves se mezclan en un agitador orbital. Repita el paso de lavado con TBS-Triton fresco. TBS-Triton exceso ausente del fieltro y pipeta de 100 a 150 μL de mezcla de anticuerpos secundarios a cada diapositiva.
   1. Asegúrese de que el tejido está totalmente cubierto por la mezcla de anticuerpos. Incubar por 2 h a temperatura ambiente en la cámara humidificada en la oscuridad.
7. Retire la mezcla del anticuerpo secundario por aspiración y transferencia de la diapositiva en un vaso de tinción frasco con 30 mL de TBS (ningún Tritón). Lavar durante 5 minutos con suaves se mezclan en un agitador orbital. Repetir la etapa de lavado con TBS. fresco aplicar 100 a 150 μL de 0,1 contratinción DAPI de μg/mL a cada diapositiva e incubar 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
8. Transfiera los portaobjetos a un vaso jarra conteniendo TBS de tinción y lavar 3 veces con mezcla suave de 5 minutos cada uno, con TBS fresca para cada lavado. Tampón sobrante lejos mecha.
9. 3 aplicar gotas de medio de montaje acuoso al tejido. Con unas pinzas, Baje suavemente un cubreobjetos de vidrio limpio sobre el tejido, a partir de un borde y bajar lentamente el otro borde para evitar atrapar burbujas de aire. Tenga cuidado de no para desalojar el cubreobjetos si imágenes inmediatamente. De lo contrario, permitir que el medio de montaje secar antes de guardar a 4 º c en la oscuridad.

4. Microscopía de fluorescencia

1. a su vez en la lámpara de fluorescencia, el microscopio y el equipo y deje que la lámpara de calentamiento 15 min lugar el tejido manchado los portaobjetos en la platina del microscopio de fluorescencia. Utilizar la imagen de campo claro para localizar el tejido con 10 aumentos.
2. Aplique una gota de ddH ₂ O a la superficie del cubreobjetos y utilizar una lente de objetivo de inmersión de agua de 20 x (NA = 1.0). Seleccione el plano promedio 4 líneas analizar ajuste. Establezca el tamaño del agujero de alfiler en 1 unidad luminosa que le da un corte óptico de ~ 3 micras. Seleccione las excitación y emisión de longitudes de onda láser para cada fluoróforo en pistas independientes para mejor señal.
   Nota: Alexa 488: λ _ex = 488 nm (láser de argón) λ _em = 493-570 nm; Texas Red: λ _ex = 561 nm (laser de DPSS 561 nm), λ _em = 601-635 nm; DAPI: λ _ex = 405 nm (laser de diodo 405), λ _em = 410 507 nm.
   1. Ajustar la potencia del láser y obtener la configuración para optimizar la intensidad de la señal para cada pista. La imagen compuesta de recoger y guardar. Utilizar la misma configuración de láser para comparar intensidades de fluorescencia en un portaobjetos diferentes.
3. Para la visualización de la intensidad de fluorescencia en cada canal, instalar la macro de herramientas de perfil RGB de ImageJ ¹⁰. Guarde la macro de la página web como un archivo de texto (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). En el menú de ImageJ, seleccione Plugins - > Macros - > instalar; Seleccione el archivo de texto para instalar la herramienta de perfiles RGB.
   1. Abra el archivo de imagen confocal en ImageJ y convertir las imágenes compuestas de las 3 pilas a RGB mediante la realización de las siguientes: imagen - > Color - > herramienta de canal. Seleccione " compuesto " desde el menú desplegable y comprobar tres canales. A continuación, seleccione imagen - > tipo - > de color RGB.
   2. Seleccione el icono de herramientas de perfil RGB y trace una línea a través de la sección de la imagen a ser perfilados. Guardar los datos de intensidad como una hoja de cálculo para el trazado de.

Resultados

El paso de tratamiento previo de fotoblanqueo puede agregarse a un protocolo de la inmunofluorescencia estándar inmediatamente antes de la recuperación de antígeno y el immunostaining (figura 1A). También se puede realizar el montaje del aparato fotoblanqueo usando varias, componentes de bajo costo, estándares (figura 1B). El espectro de emisión del fósforo blanco LED cubre una amplia gama de longitudes de onda que los hace aptos...

Discusión

El tratamiento previo de fotoblanqueo de tejidos que se describe en este manuscrito permite la eliminación efectiva de Autofluorescencia utilizando componentes estándares. El protocolo describe imágenes de inmunofluorescencia de los agregados de tau fosforilada en tejido formalina-fijo cerebro humano usando los anticuerpos secundarios conjugados a Alexa 488 y rojo de Texas, con DAPI como una contratinción nuclear. Para aplicar el método a otros tejidos, se recomienda realizar un tratamiento previo de fotoblanqueo de 48 h...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653
Ácido clorhídrico	Caledon Productos químicos de laboratorio	1506656
Azida de sodio	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Plato de Pitri	Sarstedt	82.9923.422	Todos los componentes del fotoblanqueador se pueden sustituir según la disponibilidad
Lámpara de escritorio LED regulable de 6 W DBPower		DS501	Todos los componentes del fotoblanqueador se pueden sustituir según la disponibilidad
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	C-2404
Ácido etilendiaminotetraacético ( EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Hidróxido de sodio	BioShop Canada	SHY700.1
Baño de agua	Haake Fisons	K15
Colector de portaobjetos	FisherScientific	12-587-17B
Tarro de tinción	FisherScientific	E94
Agitador orbital	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Albúmina sérica bovina	FisherScientific	BP1600-1
Suero de cabra normal	Aurion	905.002
Pluma hidrofóbica	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Anticuerpo monoclonal (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Medio de montaje	ThermoScientific	28-600-42
Deslizamiento
Confocal Microscopio	Zeiss	LSM710
Software de imagen ZEN 2012 Black Edition 11.0	El software Zeiss	LSM710	acompaña al microscopio confocal
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Extinción químico comercial	Biotum	23007