Fondo de Autofluorescencia de las muestras biológicas a menudo complica basada en fluorescencia las técnicas de imagen, especialmente en tejidos postmitotic humanos envejecidos. Este protocolo describe cómo autofluorescence de estas muestras puede eliminarse eficazmente usando un comercialmente disponible luz de diodo electroluminoso fuente para photobleach la muestra antes de la inmunotinción.
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Artículo de método
Simple eliminación de la fluorescencia del fondo en el tejido cerebral humano fijados con formol para microscopia de la inmunofluorescencia
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Resumen
Resumen
La inmunofluorescencia es un método común utilizado para visualizar los compartimientos subcelulares y a determinar la localización de proteínas específicas en una muestra de tejido. Un gran obstáculo para la adquisición de imágenes de alta calidad inmunofluorescencia es endógeno autofluorescencia de los tejidos causado por pigmentos como la lipofucsina de envejecimiento o por procesos de preparación de muestra comunes tales como fijación de aldehído. Este protocolo describe cómo fluorescencia del fondo puede ser grandemente reducida por photobleaching utilizando fósforo blanco electroluminoso arreglos de diodos (LED) antes del tratamiento con sondas fluorescentes. La emisión del amplio-espectro de fósforo blanco LEDs permiten blanquear de fluoróforos en una gama de picos de emisión. El aparato de fotoblanqueo puede construir a partir de componentes estándares a muy bajo costo y ofrece una alternativa accesible para extintores químicos disponibles en el mercado. Un tratamiento previo de fotoblanqueo del tejido seguido manchando de la inmunofluorescencia convencional genera imágenes de Autofluorescencia de fondo. En comparación con extintores químicos que reducen la sonda así como fondo de establecer señales, photobleaching tratamiento no tuvo efecto sobre intensidad de fluorescencia de la sonda mientras que efectivamente redujo la fluorescencia de fondo y del lipofuscin. Aunque fotoblanqueo requiere más tiempo de tratamiento previo, pueden utilizarse matrices de LED de mayor intensidad para reducir el tiempo de fotoblanqueo. Potencialmente, este sencillo método puede aplicarse a una variedad de tejidos, los tejidos particularmente postmitotic que acumulan lipofuscina como el cerebro y los músculos cardíacos o esqueléticos.
Introducción
Microscopía de fluorescencia con anticuerpos contra proteínas específicas se utiliza habitualmente para visualizar proteínas de interés en cultivo de células y tejidos. Una complicación importante a la adquisición de imágenes claras y definitivas en la inmunofluorescencia es autofluorescencia, que puede ser causada endógeno en tejidos de mamíferos por la edad del pigmento lipofucsina y por proteínas como la elastina y el colágeno1, 2. Otras fuentes de Autofluorescencia pueden ser introducidos a través de pasos de preparación de la muestra como aldehído fijación3. Gránulos de lipofuscin....
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Protocolo
Nota: el trabajo presentado fue realizado en cumplimiento de las normas internacionales reconocidas, incluyendo la Conferencia Internacional sobre armonización (ICH), el Consejo para internacional organizaciones de Medical Sciences (CIOMS) y los principios de la declaración de Helsinki. Uso de tejido humano fue con la aprobación de la Junta de ética de investigación de la Universidad salud red. Se recolectaron las muestras de cerebro humano como una parte del Banco de tejido cerebral marítimo. En el momento de la recogida, se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes.
1. construcción de aparatos de fotoblanqueo y soluciones
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Resultados
El paso de tratamiento previo de fotoblanqueo puede agregarse a un protocolo de la inmunofluorescencia estándar inmediatamente antes de la recuperación de antígeno y el immunostaining (figura 1A). También se puede realizar el montaje del aparato fotoblanqueo usando varias, componentes de bajo costo, estándares (figura 1B). El espectro de emisión del fósforo blanco LED cubre una amplia gama de longitudes de onda que los hace aptos.......
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Discusión
El tratamiento previo de fotoblanqueo de tejidos que se describe en este manuscrito permite la eliminación efectiva de Autofluorescencia utilizando componentes estándares. El protocolo describe imágenes de inmunofluorescencia de los agregados de tau fosforilada en tejido formalina-fijo cerebro humano usando los anticuerpos secundarios conjugados a Alexa 488 y rojo de Texas, con DAPI como una contratinción nuclear. Para aplicar el método a otros tejidos, se recomienda realizar un tratamiento previo de fotoblanqueo de 48 h.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado en su totalidad o en parte por el Consorcio Canadiense de neurodegeneración y envejecimiento (CCNA), el Instituto canadiense de salud Research (CIHR), la sociedad de ALS de Canadá (Canadá ALS) y la sociedad de Alzheimer de Canadá (ASC). Los autores desean agradecer a Darvesh Sultan y Andrew Reid de la marítima Banco de tejido cerebral para proporcionar los tejidos del cerebro de DLFT, Ganguly de Milán desde el programa de orientación espacio-temporal y la amplificación de la respuesta de la radiación (STTARR) y sus afiliadas financiación de agencias para el tejido inclusión y corte de servicios y la avanzada óptica microscopia instalación (AOM....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Ácido clorhídrico | Caledon Productos químicos de laboratorio | 1506656 | |
| Azida de sodio | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Plato de Pitri | Sarstedt | 82.9923.422 | Todos los componentes del fotoblanqueador se pueden sustituir según la disponibilidad |
| Lámpara de escritorio LED regulable de 6 W DBPower | DS501 | Todos los componentes del fotoblanqueador se pueden sustituir según la disponibilidad | |
| Ácido cítrico | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético ( EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Hidróxido de sodio | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Baño de agua | Haake Fisons | K15 | |
| Colector de portaobjetos | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Tarro de tinción | FisherScientific | E94 | |
| Agitador orbital | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Albúmina sérica bovina | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Suero de cabra normal | Aurion | 905.002 | |
| Pluma hidrofóbica | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Anticuerpo monoclonal (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Medio de montaje | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Deslizamiento | |||
| Confocal Microscopio | Zeiss | LSM710 | |
| Software de imagen ZEN 2012 Black Edition 11.0 | El software Zeiss | LSM710 | acompaña al microscopio confocal |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Extinción químico comercial | Biotum | 23007 |
Referencias
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin . Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).....
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Reimpresiones y permisos
