Artículo de método

Un nuevo uso de la ecografía tridimensional de alta frecuencia para la caracterización de embarazo temprano en el ratón

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DOI:

10.3791/56207

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24 de octubre de 2017

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1Devision of Repreoductive Endocrinology and Infertility, Department of Obstetrics and Gynecology, Baylor College of Medicine, 2Mouse Phenotyping Core, Baylor College of Medicine, 3Reproductive and Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Ratones son ampliamente utilizados para estudiar biología gestacional. Sin embargo, interrupción del embarazo se requiere para este tipo de estudios que impide investigaciones longitudinales y hace necesario el uso de grandes cantidades de animales. Por lo tanto, describimos una técnica no invasiva de la ecografía de alta frecuencia para la detección precoz y seguimiento de eventos tras la implantación en el ratón embarazado.

Resumen

Sonografía de alta frecuencia (HFUS) es un método no invasor, controlar el desarrollo en tiempo real del feto humano en el útero. El ratón se utiliza rutinariamente como un modelo en vivo para el estudio de la implantación del embrión y la progresión del embarazo. Desafortunadamente, estos estudios murinos requieren interrupción del embarazo para permitir el seguimiento análisis fenotípico. Para solucionar este problema, se utilizó la reconstrucción tridimensional (3D) de HFUS imagen de datos para la detección temprana y la caracterización de sitios de implantación de embriones murinos y su progresión en el desarrollo individual en el útero. Combinación de modelado y proyección de imagen de HFUS con reconstrucción 3-d, pudimos con precisión cuantificar número de sitio de implantación de embriones, así como monitorear la progresión del desarrollo en embarazadas ratones C57BL6J/129S de 5,5 días post coito (d.p.c.) a través de d.p.c. 9.5 con el uso de un transductor. Mediciones incluidas: número, ubicación y volumen de sitios de implantación así como espaciamiento entre implantación; se evaluó la viabilidad del embrión mediante el control de la actividad cardiaca. En el período tras el implante inmediato (5.5 a 8.5 d.p.c.), reconstrucción 3D del útero grávido en malla y recubrimiento sólido formato permitió a representación visual de los embarazos en vías de desarrollo dentro de cada cuerno uterino. Como ratones transgénicos se siguen usando para caracterizar fenotipos reproductivos femenino derivados de disfunción uterina, este método ofrece un nuevo enfoque para detectar, cuantificar y caracterizar principios implantación eventos en vivo. Este nuevo uso de la proyección de imagen de 3-d HFUS demuestra la capacidad de detectar, visualizar y caracterizar sitios de implantación del embrión durante el embarazo temprano murino de manera no invasiva con éxito. La tecnología ofrece una mejora significativa sobre los métodos actuales, que se basan en la interrupción de embarazos para tejidos brutos y Caracterización histopatológica. Aquí utilizamos un formato de vídeo y texto para describir cómo realizar con éxito los ultrasonidos del embarazo temprano murino para generar datos fiables y reproducibles con la reconstrucción de la forma uterina en malla y sólidos 3D imágenes.

Introducción

Pérdida recurrente de embarazo temprano es una de las complicaciones más frecuentes después de la concepción y afecta aproximadamente al 1% de las parejas que intentan concebir1,2. Los mecanismos subyacentes de la pérdida temprana del embarazo son muy variados: desde intrínsecas anormalidades embrionarias y comorbilidades maternas a los defectos en la receptividad endometrial1,3,4. Debido a su maleabilidad genética, modelos de ratón han sido ampliamente utilizados para las investigaciones de temprana implantación del embrión y el embarazo. Además, el poco tiempo de gestación del ratón y la capacidad para realizar estudios de gran escala han asegurado la creciente utilidad del ratón para hacer frente a preguntas claves clínicas en medicina reproductiva humana5. Dicho esto, la gran mayoría de los diseños experimentales murinos aún requiere numerosas presas para ser sacrificados en los días gestacionales secuenciales para cuantificar y analizar la ubicación del sitio de implantación, número, tamaño y patrones de separación durante el embarazo6, 7,8, lo que impide estudios longitudinales sobre el mismo animal.

En la clínica, el ultrasonido es una herramienta confiable y valiosa para monitorear la viabilidad fetal humano y desarrollo en una manera no invasiva9,10,11. Más recientemente, el ultrasonido de alta frecuencia (HFUS) ha comenzado a encontrar aplicaciones limitadas en el ratón como un método de control de viabilidad fetal y crecimiento durante el embarazo12,13,14. Los recientes avances tecnológicos en proyección de imagen de ultrasonido han permitido la aplicación de datos tridimensionales (3D) para la reconstrucción visual de los órganos animales y posterior seguimiento de patologías15,16, 17. Uso de esta avanzada tecnología de imagen ha mejorado notablemente el poder de detectar fluctuaciones de volumen más pequeño, para reducir la variabilidad entre animales y para monitorizar la progresión de una patología o la eficacia de una intervención terapéutica17. Mientras que la principal utilidad de esta tecnología ha sido monitorear la progresión de la neoplasia en el oncorratón modelos15,16, 3-d imágenes HFUS sólo recientemente se ha utilizado para cuantificar y monitorear el crecimiento activo de la implantación del embrión y desarrollo del feto en el útero de ratón18.

Aquí, demostramos cómo realizar HFUS para producir datos 2-D y 3-d la proyección de imagen para generar reconstrucciones del útero de ratón embarazadas temprano. Demostramos la utilidad de este novedoso método para detectar estos eventos tempranos de la implantación embrionaria sin necesidad de interrupción del embarazo, permitiendo a los investigadores recolectar datos de manera no invasiva.

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Protocolo

estos estudios se llevaron a cabo con arreglo a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicados por los institutos nacionales de salud y protocolos animal aprobados por la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Baylor College of Medicine en protocolo número AN-4203.

1. preparación de la embarazada para ultrasonido

  1. tiempo de apareamiento
    1. lugar la presa con un macho fértil probada principio noche de ratón después de 1700. Separar presa y el hombre por las 0700 horas (horas), independientemente si existe tapón vaginal, para fechar exacto de embarazo.
      Nota: La mañana después de aparearse se considera 0,5 día post coitum (d.p.c.).
  2. Preparación de ultrasonido
    1. Coloque el ratón embarazado en un contenedor de inducción anestesia sellado.
    2. Calmante con anestésico isoflurano (2%) se inhala y oxígeno (1 L/min) hasta que el animal pierde el reflejo de adrizamiento (aproximadamente 1-2 min dependiendo del tamaño del ratón) y no se observan movimientos espontáneos (además de la respiración).
    3. Lugar sedada del ratón en la posición supina en el cono de nariz con isoflurano (2%) inhala anestesia y oxígeno (1 L/min). Aplique ungüento oftálmico al animal ' ojos s.
    4. Con un algodón, aplicar Crema depilatoria a todo abdomen, esternón a la vagina y lateral a los costados.
    5. Permite crema para permanecer por un máximo de 3 minutos y luego retire la crema y el pelo con el tejido. Asegurar que se elimina todo el pelo, como cualquier resto del cabello disminuirá la calidad de la imagen.

2. Preparación de la etapa de ultrasonido

  1. encienda el transductor de.
  2. Conectar etapa motor 3D motor etapa al transductor. Motor
    1. enchufe en 3D mediante la conexión del cable del motor 3D para el conector del motor 3D en el panel trasero. Conectar el sistema de motor 3D para el sistema de montaje mediante el post de liberación rápida en la parte superior para conectar a la estación de proyección de imagen y la liberación rápida de montaje en la parte inferior para fijar la pinza transductor.
  3. Conecte la sonda a la pinza transductor.

3. Comience el ratón embarazadas la proyección de imagen

  1. ratón de lugar supina en la plataforma de monitoreo. El ratón continuamente recibe isoflurane anestésico (entre 1.5-2.5%) y oxígeno (1 L/min) a través del cono de nariz. Suavemente la cinta todas las patas a las almohadillas en la plataforma de control del ritmo cardiaco.
    1. Aplique 1-2 mL de gel de transmisión del ultrasonido en el abdomen.
  2. Con la etapa de motor manual, coloque la sonda del ultrasonido sobre el abdomen.
    1. Localizar la vejiga, que debe aparecer como un círculo oscuro lleno de líquido sólo cefálica a la abertura vaginal.
    2. Una vez que la vejiga se encuentra, mueva la sonda lentamente cefálica para visualizar útero durante el embarazo, que debe aparecer como una forma cilíndrica con áreas redondas en sitios de embarazo. Esto puede ser descrito como mirando como perlas de una cadena.
    3. Una vez que el útero embarazado ha sido identificado, comienza la proyección de imagen 2-D.

4. La proyección de imagen del ultrasonido de 2-D (Figura 1)

  1. una vez que se ha identificado el útero durante el embarazo, comienzan en el sitio de embarazo más cercano a la vejiga y lentamente y secuencialmente hacia cefálica determinar número y localización de sitios de embarazo.
  2. Si se visualiza el riñón, el bazo o el hígado, recolocar la sonda más caudal (más cerca de la vejiga) como el usuario ha ido demasiado lejos cephalad.
  3. El cuerno uterino contralateral de la imagen de la misma manera.
  4. Congelar la imagen cuando el marco de la ecografía está en el centro del sitio de implantación, embarazo a guardar para su posterior análisis y medidas de.
    Nota: Tarda menos de un segundo para que la imagen de ser congelados y guardados para su posterior análisis.
  5. Medida de distancia de implantación mediante la reacción de decidualization hyperechoic como marcador manualmente haciendo clic en la " medida " de la herramienta primero y luego haciendo clic en la ubicación de un sitio de implantación. A continuación, arrastre el cursor al próximo sitio de implantación y haga clic en para dibujar una línea que el equipo informará automáticamente su distancia. El software informará entonces qué es la medición manual. Este paso no es automatizado, pero depende del usuario para marcar la distancia entre sitios decidualized dibujando una línea entre los sitios decidualized, que el programa proporcionará una información de medición
  6. Medir tamaño de implantación, tamaño del saco gestacional y poste fetal tamaño.

5. La frecuencia cardíaca fetal

Nota: en 9,5 d.p.c., los latidos del corazón fetal deben visualizarse claramente.

  1. Manteniendo la sonda muy todavía, encienda la onda de pulso Doppler y coloque éste sobre el latido visible.
  2. Registro el cardiaco corazón latía pulsaciones.
    Nota: Aparte del corazón, este procedimiento también puede grabar pulsaciones en el cordón umbilical.

6. adquisición de ultrasonido 3-d

  1. después de que el útero embarazado ha sido visualizado en proyección de imagen 2-D, coloque la sonda en un área que está en el punto medio aproximado de la imagen 3D deseado. Por ejemplo, si uno imagen una manzana en 3-d, la sonda debe inicialmente colocarse donde el núcleo apple predice que encuentra (es decir, en medio del objeto).
  2. Con la sonda en una posición en el centro de la imagen deseada, obtener una adquisición 3D. La etapa de motor 3D viajará esta distancia a través del útero en una serie de pasos o marcos, con la intención de captar en totalidad lo que el investigador desea.
  3. Confirmar que las estructuras previstas son capturadas completamente en la exploración 3D antes de completar la porción de ultrasonido en tiempo real. Guarde esta información 3D para procesamiento posterior en un momento posterior. El tiempo total para la adquisición de la ecografía 2-D y 3-d es aproximadamente 10-20 minutos cuando es realizada por un usuario experimentado de.

7. 3D procesamiento posterior reconstitución (Figura 2)

  1. carga los datos deseados para el procesamiento de imágenes 3-d.
  2. Elegir " métodos paralelos y rotación ", que cargará todos los cuadros de imagen 3D en 3-un d " caja de " que el usuario será entonces trazar el objeto deseado, fotograma por fotograma. Seleccione paso tamaño 0,08 mL. Comience en un extremo del bloque de la imagen y desplazarse para que se familiarice con las imágenes que han sido capturadas dentro del espacio.
    1. Comience en un extremo de la imagen y manualmente traza el contorno del objeto.
    2. Desplácese hasta la siguiente rebanada de imagen 2-D o " marco " y manualmente trazar el contorno del objeto.
    3. Continúe este proceso hasta que todos los marcos han sido anotado/remontado manualmente por el usuario.
    4. Haga clic en " final " para obtener la imagen 3D y cálculos de volumen total.
  3. Escoger entre la malla y recubrimiento sólido, que es una flecha en la esquina superior izquierda.
  4. Optar por mantener o eliminar la información de imagen de ultrasonido circundante para mayor claridad. Cada reconstrucción 3-d puede tomar entre 10 y 20 minutos

8. Cuidado posterior al procedimiento

  1. cuando el ultrasonido es completado, apague el gas de la anestesia, quitar el ratón de la plataforma y frotar con cuidado y lavar cualquier gel de ultrasonido del animal.
  2. Volver a colocar el ratón en la jaula en una posición prona en una zona acolchada. Seguimiento hasta que el animal está despierto y en movimiento espontáneamente.

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Resultados

Como se muestra en la figura 1, el ultrasonido de alta frecuencia puede detectar la implantación sitio desarrollo comienza ya en el punto 5.5 del tiempo d.p.c. Usando el encendedor hyperechoic decidualized endometrio como marcador de sitios de implantación en 6.5 d.p.c permite al número de sitios de implantación y el espaciamiento de estos sitios para ser cuantificada. Como el embarazo progresa a 7.5 d.p.c., más oscuro saco gestacional hypoechoic y poste feta...

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Discusión

Este nuevo uso de la proyección de imagen de 3-d HFUS demuestra la capacidad de detectar, visualizar y caracterizar sitios de implantación del embrión durante el embarazo temprano murino de manera no invasiva con éxito. La tecnología ofrece una mejora significativa sobre los métodos actuales, que se basan en la interrupción de embarazos para tejidos brutos y Caracterización histopatológica. Sin embargo cabe señalar que los métodos histológicos aún se consideraría más óptima cuando se desee caracterización de forma más am...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Apreciamos mucho la asistencia de Rong Zhao, Li Jie y Yan Ying.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
VisualSonics Vevo 2100 Plataforma/Máquina de Imágenes de UltrasonidoVisualSonics, inc.VS-11945
Estación de imágenes VevoVisualSonics, inc.SA-11982
Aquasonic 100 Gel de Transmisión de UltrasonidoParker#SKU PLI 01-08
Isoflurano (IsoThesia) botella de 100mLHenry Shein#29404
PuraLubenPomada Oftálmica AnimalDechra#12920060

Referencias

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