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Artículo de método

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

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DOI:

10.3791/56213

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31 de enero de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Resumen

Daño de la DNA induce respuestas concretas de reparación y señalización de la célula, que es fundamental para la protección de la integridad del genoma. Microirradiation laser se convirtió en una valiosa herramienta experimental para investigar el ADN daños respuesta (DDR) en vivo. Permite análisis unicelular alta resolución en tiempo real de la dinámica macromolecular en respuesta a daño inducido por el láser confinado a una región Submicrométrica en el núcleo celular. Sin embargo, varias condiciones de láser han sido utilizadas sin apreciación de las diferencias en los tipos de daño inducido. Como resultado, la naturaleza de los daños es a menudo no bien caracterizado o controlado, provocando inconsistencias evidentes en los perfiles de contratación o modificación. Hemos demostrado que las condiciones de irradiación diferentes (es decir, diferentes longitudes de onda así como diferentes potencias de entrada (cultivos) de un láser de femtosegundo (fs) y de infrarrojo cercano (NIR)) inducida por distintos conjuntos de proteínas DDR y reparación. Esto refleja el tipo de daño en el ADN producido. Este protocolo describe cómo titulación laser de potencia de entrada permite la inducción de diferentes cantidades y la complejidad del daño de la DNA, que pueden controlarse fácilmente por la detección de daño base y reticulación, diferencial poli (ADP-ribosa) (PAR) de señalización, y Asambleas de factor de reparación específica de la vía en sitios de daño. Una vez determinadas las condiciones de daño, es posible investigar los efectos de daños diferente complejidad y daño diferencial de señalización, así como agotamiento de factor aguas arriba de cualquier factor de interés.

Introducción

En Vivo Señalización de daño de ADN no es haber entendido bien
In vivo, el ADN es acomplejado con histonas y otros factores para formar fibras de cromatina. Regulación de la estructura de la cromatina es de suma importancia para el metabolismo del ADN. Por ejemplo, la variante de la histona H2AX es fosforilada por la ataxia-telangiectasia mutado (ATM) y otras cinasas siguiente doble cadena rompe inducción (DSB) y es importante para la amplificación de la señal de OSD daños así como proporcionar un sitio para otro factores. Difusión de elección de vía de señalización y reparación de daños parecen ser críticamente influenciado por la estructura de la cromatina locales en sitios de daño1. Un número de remodelación factores, histona chaperonas y enzimas modificadoras de histonas de la cromatina son reclutados en efecto dañar sitios y son importante para la reparación del ADN eficiente, destacando la importancia de la regulación de la cromatina en la DDR y reparar2 , 3 , 4. Además, se observó sitio daño clustering o reposicionamiento en levadura y drosophila5,6,7,8, de relocalización de loci de genes en el compartimiento subnuclear asociado con genes regulación9,10. Recientes estudios en ratón y células humanas también revelaron movilización sitios web DSB, que influencias reparación fidelidad y vía elección11,12. Esto plantea la posibilidad que DDR y reparación puede también ser íntimamente arquitectura nuclear, organización de orden superior cromatina y cromosoma dinámica en el núcleo celular. Por lo tanto, es fundamental para desarrollar métodos de alta resolución para estudiar DDR y reparar procesos en el contexto del ambiente endógeno nuclear en una célula viva para entender las consecuencias a corto y largo plazo de daño en el ADN.

Papel crítico de PAR polimerasa (PARP) en medir el grado y tipo de daño y regula el ensamblaje de la proteína en el sitio de daño
PARP1 es un sensor de DNA nick rápidamente activado por daño en el ADN que desempeña un papel crítico en la reparación de ADN13. PARP1 originalmente fue pensado para funcionar junto con rayos x reparar Cruz complementando 1 (XRCC1) para facilitar la reparación de la supresión de base (BER), pero estudios recientes revelan su papel en otras vías de reparación del ADN, incluyendo reparación DSB14. Activa PARP1 utiliza nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) como sustrato a ADP-ribosylate varias proteínas objetivo, incluyendo sí mismo. Esta enzima y otros miembros de la familia han atraído mucha atención en los últimos años como inhibidores de la PARP han surgido como prometedores medicamentos para el cáncer. Aunque los inhibidores de la PARP inicialmente fueron encontrados para ser eficaz en el gen del cáncer de mama (BRCA)-transformado células de cáncer de mama, ahora hay una gran cantidad de evidencia de sus efectos en mono - y combinación de terapias junto con ADN dañando agentes, radiación contra un amplio espectro de cánceres con mutaciones que no se limita a BRCA15,16,17,18,19,20.

A nivel molecular, activación de la PARP fue demostrada que desempeñan un papel crítico en la organización de la estructura de la cromatina locales en sitios de daño. Contratación dependiente del PAR de las enzimas de modificación de la cromatina facilita la reparación DSB y dictados reparacion opciones de camino, sugiriendo el papel importante del andamiaje de modificación PAR en sitios de daño. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 recientemente demostramos la exclusión de la proteína p53-1 (53BP1) dañen sitios por PAR 32, proporcionando una explicación alternativa para el hyperactivation 53BP1 dependiente de endjoining no homóloga ( NHEJ) por PARP inhibidor y destacando la importancia de PARP en OSD reparación vía elección33,34. PARP1 también directamente PARylates y afecta a la reparación de la actividad de la DNA múltiples factores14.

Usando Microirradiation de láser como una herramienta para estudiar DDR y reparación en Vivo
Microirradiation láser para producir sub-micron alteraciones en cromosomas individuales primero fue descrito en 196935 y revisado en detalle en 198136. Varias décadas más tarde, microirradiation laser fue demostrado para inducir daño de la DNA en una región definida Submicrométrica en el núcleo celular y fue demostrado para ser una técnica valiosa para el estudio de reclutamiento o modificaciones de los diversos factores de lesiones del ADN in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. este método permite la detección de aquellos factores que no forman distintos focos inducido por irradiación (IRIF) en sitios de daño39,42. También es posible examinar la dinámica espacio-temporal de los cambios estructurales de la cromatina en los sitios de daño y en el resto del núcleo. Cuidadosamente comparamos el DDR inducida por láser diferentes sistemas y poder evaluar la relación entre el tipo de daño en el ADN y el microirradiation condiciones32,43,44, 45. Los patrones de reclutamiento aberrante de 53BP1 y telomeric repetición factor de Unión 2 (TRF2) fueron observados en los estudios previos de daños del láser, que sirvió de base para la preocupación recurrente por la naturaleza "non-physiological" del daño inducido por el láser46 ,47,48,49. Encontramos que estas aparentes discrepancias podrían explicarse ahora por PARP diferencial señalización que indicadores de la cantidad y la complejidad del daño inducido32. Confirmamos que: 1) laser-microirradiated las células (incluso después de la irradiación de energía de entrada alta) son arrestadas en interfase en una forma de control dependiente del checkpoint de daños y permanecer viables (al menos hasta 48 h)32,50; y 2) contratación de factor de reparación o modificaciones fielmente lo observado con el tratamiento con agentes perjudiciales convencionales de ADN y la inducción de OSD por endonucleasas32,39,42, recapitular 44,50,51,52. Estos resultados apoyan fuertemente la relevancia fisiológica de estudiar respuestas celulares inducidas por daños de láser.

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Protocolo

1. preparación de la célula básica

Nota: Este paso es para detección de inmunofluorescencia estándar del reclutamiento de la proteína endógena o modificación y para el uso de una línea celular estable expresar una proteína recombinante fluorescente etiquetada. Por ejemplo, las células epiteliales del riñón marsupial Potorustridactylus (PtK2) estable expresan EGFP 53BP11220-1711 o TRF2 YFP se utilizaron en nuestro anterior estudian (figura 1)32. En el caso anterior, el enfoque de formación región de 53BP1 (aminoácido 1220-1711) que contiene el dominio de Oligomerización del dominio Tudor y el motivo de la contratación ubiquitylation dependiente (UDR), fue fusionada a GFP mejorada (EGFP 53BP11220-1711). Esta proteína de fusión recapitula el reclutamiento de sitio de daño de los larga duración 53BP153,54,55. En células HeLa, fluorescencia etiquetados subunidades de cohesinas (p. ej., hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52y GFP-SA2 51) deberán ser estable expresadas para asegurar la incorporación eficaz en el complejo y recapitular S/G2 ciclo celular fase específico daño sitio reclutamiento de la cohesina endógeno51.

  1. Cualquier tipo de células adherentes sobre un plato de cultivo de tejidos de 35 mm con un cubreobjetos cuadriculado para permitir la identificación de la célula individual de la semilla. Ajustar el número inicial de la célula para alcanzar el 60% de confluencia en 36-48 h en la tasa de proliferación de la línea celular particular. Por ejemplo:
    1. De células epiteliales del riñón marsupial PtK2 (tipo salvaje o los estable expresan EGFP 53BP11220-1711 o TRF2 YFP):4 células en 2 mL de la placa de 2.0 x 10 avanzado mínimo esencial Medium (MEM) suplementado con 2 mM L-glutamina, bovino fetal 4% suero (FBS) y antibióticos (100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina) e incubar a 37 ° C con 7% CO2.
    2. Para HeLa células con expresión estable de fluorescencia con la etiqueta proteínas recombinantes GFP-SA2: semillas 1.0 x 105 células en 2 mL Medium (DMEM modificado Eagle de Dulbecco) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL, e incubar a 37 ° C con 5% CO2. Otras células HeLa pueden usarse incluso sin modificar las células o las células que expresan hSMC1-GFP.
  2. Permitir a las células para adherirse y proliferar por 36-48 h antes de la inducción de daño de DNA en 30-60% de confluencia (para permitir la visualización del número de red). Proceder a la sección 4.

2. transitorios de la transfección

Nota: A veces buenos anticuerpos no están disponibles para detectar las proteínas endógenas. Si no existen líneas celulares de expresión estable de proteínas marcadoras, llevar a cabo de transfecciones transitorias para controlar la fluorescencia de etiquetado proteínas para análisis de células vivas.

  1. Para las células HeLa, el día 1, semillas de 6-8 x 104 células en medios de cultivo de 0.5 mL en un pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar en una 100% humidificado incubadora a 37 ° C y con 5% CO2. Consulte el paso 1.1 para las condiciones de los medios de cultivo.
  2. Día 2, uso de un plásmido de expresión mamíferos codifican un ADN fluorescente etiquetado reparar factor (por ejemplo, GFP-NTH1 o GFP-OGG1 daño base32,44,56, GFP-Ku para dosis alta distritales57, GFP-53BP1 32 para distritales relativamente simples, u otras proteínas de interés sobre etiqueta fluorescente) para realizar la transfección de ADN mediada por liposomas. Diluir 0,3 μg ADN plásmido en 25 μl de medio de cultivo libre de suero en un tubo de 1,5 mL.
  3. En otro tubo de 1.5 mL, diluir 1 μl basadas en liposomas DNA transfección de reactivo en 25 μl de medio de cultivo libre de suero y mezcle suavemente.
  4. Mezclar suavemente el agente diluido de ADN y transfección e incubar 10 min a temperatura ambiente (RT) para formar complejos ADN-lípidos.
  5. Lavar las células con medios de cultivo de 0, 5 mL una vez, eliminar los medios de comunicación y añadir 0.5 mL medio de cultivo fresco a las células (como en el paso 1.1).
  6. Añadir los complejos DNA-lípidos a las células. Mezclar suavemente, meciendo la placa varias veces. Volver a poner las células en la incubadora como en el paso 2.1.
  7. Después de 4-6 h, eliminar los medios de cultivo de las células y añadir 300 μL 0.05% tripsina-EDTA. Quitar, añadir 200 μL de tripsina-EDTA e incubar en la incubadora de 37 ° C durante 3-4 minutos.
  8. Después de confirmar que las células son separadas, añadir 800 μl medios de cultivo y resuspender las células mediante pipeteo suavemente para dispersar los grumos de células. Transferir la suspensión a una placa de cultivo de 35 mm con un cubreobjetos cuadriculada y añadir los medios de cultivo a un volumen final de 2 mL.
  9. Incubar las células en la incubadora como en el paso 2.1 durante 48 h, luego proceda a la sección 4.
    Nota: Si la expresión de la proteína recombinante es tóxica (células transfected muestran morfología redonda o irregular después de la incubación en el paso 2.8), acortar el tiempo de expresión y realizar láser microirradiation (sección 4) a 16-20 h después de tan larga como la transfección del expresión de la proteína puede ser confirmada (para la detección de la fluorescencia, vea el paso 4.3). En este caso, realizar la transfección directamente en el plato de 35 mm. Semilla de 3.0 x 105 HeLa células en un plato de 35 mm con un cubreobjetos cuadriculado para lograr aproximadamente el 50-70% confluencia después de plásmidos de ADN transfectar h. 30 y cambiar medios de 2-6 h después de transfección. Proceder con láser microirradiation 12-20 h más tarde si es razonable expresión de la proteína y las células aparecen sanas.

3. ciclo celular sincronización

Nota: Para la recombinación homóloga reparación (HR) proteínas, tales como Rad51 y cohesin, el reclutamiento es más prominente en la fase S/G2 del ciclo celular, en que hora reparación toma lugar51. Así, para supervisar la contratación de estas proteínas, sincronización de células en fase S/G2 es necesario.

  1. Sincronización de fase S/G2
    1. Utilizar el protocolo de bloque de timidina doble para sincronización celular en S/G2 fase50,51. Después de la siembra de las células en un plato de 35 mm cuadriculada cubreobjetos (ver paso 1.1), incubar las células con timidina (a una concentración final de 2, 5 mM) en medios de cultivo (como en el paso 1.1) de 17 h a 37 ° C y con 5% CO2.
    2. Lavar las células con 1 mL medio de cultivo libre de timidina (como en el paso 1.1) dos veces e incubar las células en medios de cultivo libres de timidina de 2 mL para 9 h como en el paso 1.1.
    3. Añadir 200 μL de solución stock de 27,5 mM timidina (disuelto en medios de cultivo) en los medios de cultivo con las células a una concentración final de timidina 2,5 mM. Incube las células como en el paso 3.1.1 para h. 15 otro enjuague e incubar las células en medios de cultivo libres de timidina para 4-6 h, inducir daño en el ADN (sección 4).
    4. Confirmar la eficiencia de sincronización mediante el uso de marcadores de ciclo celular (ciclina A2 y B1-S/G2 y G2, respectivamente), S/G2 fase específica DNA daños reparación factores (e.g., Rad51 o cohesinas), o por el IdU/EdU incorporación (de células en fase S)51.
  2. Sincronización de fase G1
    1. Semillas 6-8 x 104 células HeLa en una placa de cultivo de 35 mm con cuadriculada cubreobjetos (paso 2.1).
    2. Después de 2 días, identificar las células en metafase, que están un poco levantado y en forma redonda, debajo de un microscopio invertido con objetivo de 10 X y 10 X oculares lentes. Adquisición de imágenes para registrar la posición de las células en metafase en el cubreobjetos cuadriculada.
    3. Después de 3-4 h, confirman División de la célula en dos células hijas (en fase G1) e inducir daño al ADN (sección 4).

4. valoración del Laser de potencia de entrada

Nota: En el presente Protocolo, inducir daño en el ADN utilizando un 780 nm pulsado sistema de láser NIR fs conectado a un microscopio confocal, o un 800 nm pulsos fs NIR láser acoplado a un microscopio de epifluorescencia invertida. Aunque de entrada potencia (irradiancia real en el punto focal del láser en la muestra) necesaria para inducir DDR comparable es diferente en estos sistemas, el principio básico de valoración de la potencia de entrada es aplicable a ambas, o ninguna, NIR sistemas32,57 . La energía en situ por el láser pulso y pico de intensidad de radiación en el punto focal para los sistemas de dos láser estaban en la gama de 5.33 × 10-2-4 × 10-1 de nJ y de 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, respectivamente,32.

  1. Encienda el láser NIR y permitir que el sistema láser calentamiento durante 1 hora antes de su uso.
  2. Coloque un plato de las células en una fase caliente (37 ° C) en una cámara que permite CO2 (5%) y control de humedad (100%).
    Nota: Si una cámara de CO2 no está disponible, use CO2-medios de cultivo independiente para un máximo de 5-6 h. Si no hay una fase de calentamiento, mantener las células bajo el microscopio para < 20 minutos y vuelva a colocar inmediatamente en la incubadora de cultivo de tejidos con control de humedad, temperatura adecuada y CO2. Estas condiciones de cultivo pueden variar dependiendo del tipo de célula específico utilizado así como el organismo de derivación (por ejemplo, mamíferos y anfibios).
  3. Para análisis de células vivas de fluorescencia etiquetas proteínas, seleccione un filtro GFP (excitación de 450-490 nm, 515-586 nm de emisión) o Cy3 (540-552 nm excitación, emisión de > 590 nm) para GFP o proteína fusionada mCherry, respectivamente, con un 100 X o inmersión de aceite X 63 objetivo.
  4. La búsqueda de células que tienen señales de fluorescencia comparable, lo que refleja niveles comparables de expresión de la proteína. Evitar que las células que tienen expresión demasiado débil o demasiado fuerte con el fin de reducir la variabilidad de la célula a célula en las mediciones de fluorescencia.
  5. Valorar la potencia de entrada del láser.
    1. 780 nm láser NIR conectado a un microscopio confocal
      1. Utilice la función de bleach software para apuntar pistas lineales dentro del núcleo celular por exposición a los escáneres de láser (resolución 512 x 512 píxeles, zoom X1, blanqueado región 50 x 4 píxeles, 12,8 μs tiempo de permanencia de pixel, iteración x1) a través del objetivo de aceite (100 X / 1.3 NA).
      2. Ajustar el porcentaje de transmisión de láser (mediante el software y hardware integrado en el sistema de microscopio láser por el fabricante) al 5% sin cambiar ningún otro ajuste.
      3. Colocar una célula en el centro del campo. Haga clic en la región de herramienta de interés (ROI), dibujar una línea o cuadro (aproximadamente 50 x 4 píxeles) en el núcleo usando el ratón y haga clic en el botón de "Bleach" para inducir daño en el ADN.
        Nota: En los pasos de la irradiación posterior, "blanqueo" debe aumentarse en incrementos de 5% a 40% o hasta 100% si es necesario.
      4. 800 nm láser NIR al microscopio de epifluorescencia
      5. Control de potencia de entrada a través de una (63 X / 1.4 NA) objetivo de inmersión de aceite fase contraste por rotación motorizada de un filtro de polarización introdujo en la trayectoria de viga y montado sobre un escenario rotatorio motorizado controlado por ordenador32,39 , 58.
      6. Ajuste el ángulo del polarizador (°) y medir la energía de entrada (mW) en el microscopio, usando un medidor de potencia láser. Determinar los ángulos de polarizador que proporcionan potencias de entrada que van desde los 20 mW mW-155 en incrementos de 5-10 mW.
      7. Ajuste el ángulo del polarizador que corresponde a la potencia de entrada 20 mW.
        Nota: Para nuestro sistema de láser, si el ángulo del polarizador es 40 º, la potencia de entrada es de 65 mW. Aumentar la potencia de entrada con incrementos de 5-10 mW.
  6. Para el análisis de células vivas, vaya a pasos 6.1 y 6.3. Para la detección de inmunofluorescencia de las proteínas endógenas o modificaciones proceda a la sección 5. Después del análisis, vaya al paso 4.7 para más valoración de la potencia del láser. Para analizar el requisito de factor aguas arriba, vaya a la sección 7.
    Nota: Contratación de factores BER y NHEJ es rápido (dentro de unos minutos) y transitorio (< ~ 30 min - 1 h dependiendo el puesto factor y < ~ 4 h dañar inducción, respectivamente). En contraste, la contratación de recursos humanos factores Rad51 y cohesin es detectable en ~ 30 min - 1 h y tienden a persistir más de 8 h a las rupturas ADN lesiones44,50,51. Por lo tanto, es necesario examinar otra vez puntos post irradiación para reparación de diferentes factores.
  7. Aumentar la potencia de entrada en incrementos deseadas (es decir, 5% para 780 láser NIR y 5-10 mW para 800 NIR) como en el paso 4.4 y repita los pasos 4.5-4.7 en un nuevo conjunto de células para determinar el umbral (50% de células dañadas Mostrar reclutamiento) y máximo (100% de células ver contratación) para cada proteína.

5. tinción de inmunofluorescencia

Nota: para la detección de la modificación covalente de la proteína, como PAR (marcador de daño complejo) y fosforilación de H2AX (γH2AX) (marcador de OSD), así como dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) y 8-oxoguanine (8-oxoG) (reticulación y base de marcadores de daño, respectivamente), las células deben fijarse y teñidas con anticuerpos específicos. Además, es mejor confirmar los resultados obtenidos con las fluorescencia de etiquetado proteínas recombinantes por la detección de anticuerpos de las proteínas endógenas, para distinguir artefactos inducidas por la sobreexpresión de proteínas de fusión recombinantes.

  1. Fijar las células en diferentes momentos después de la inducción de daño (paso 4.5) dependiendo de los factores mediante la sustitución de los medios de cultivo (véase el paso 1.1) con 1,5 mL de paraformaldehído al 4% / 1 X PBS durante 10 min a TA.
    PRECAUCIÓN: Los vapores de paraformaldehido son tóxicos y todo trabajo debe hacerse de una campana ventilada.
  2. Extraiga a paraformaldehído al 4% / PBS y añadir 1 mL de 0.5% de detergente/PBS por 10 min a TA.
  3. Eliminar 0.5% detergente/PBS y enjuague las células con 2 mL de PBS durante 5 minutos dos veces e incubar las células en 2 mL de solución de bloqueo (suero de 10%, 1% BSA/PBS) durante 1 h a TA.
  4. Eliminar bloqueo de la solución y añadir 2 mL de PBS a las células y reemplazar PBS solución de anticuerpo primario de 250 μl del 3% BSA/PBS durante la noche a 4 ° C o 1 h a RT. uso un 1: 200-dilución 1: 500 (típica concentración aproximadamente 1 μg/mL, determinado empíricamente) para anticuerpos específicos para diferentes marcadores de daño ADN (p. ej., γH2AX/53BP1 (OSD); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/cohesinas (DSB, HR); 6/CPD-4PP (reticulación daño); 8-oxoG ADN glicosilasas (e.g., NTH1) (daño base); PAR (daños complejos de alta dosis)).
  5. Retirar la solución de anticuerpo y lavar con 2 mL de PBS durante 5 minutos dos veces, quitar PBS e incubar con 250 μl 0.1% de anticuerpo secundario en 3% BSA/PBS para 1 h en la oscuridad a TA.
  6. Retirar la solución de anticuerpo secundario y agregar 2 mL de PBS durante 5 minutos dos veces y mantener las células en 1.5-2 mL PBS a 4 ° C para la proyección de imagen en pasos 6.1 y 6.2.

6. Análisis de fluorescencia cuantitativo de Immunostained o células vivas

  1. Capturar imágenes de las células manchadas o vivo (n > 10) utilizando microscopio utilizado para la irradiación. Para el sistema de microscopio de epifluorescencia, utilice la resolución de 1.344 x 1.024 píxeles y guardar imágenes como archivos TIFF de 16 bits. Para un microscopio confocal, utilice 1 aumentos; Láser de argón para la GFP/FITC, láser de HeNe 594 para Cy3/mCherry; 512 x 512 o 1.024 x 1.024 píxeles de resolución de la imagen; escaneo velocidad 5, número: 1 para exploración rápida o 2 + para un promedio de más de múltiples para mejorar la relación señal a ruido.
  2. Utilice un análisis de la imagen programas diseñados para medir la intensidad del pixel.
    1. Utilice la herramienta de rectángulo volumen para dibujar un ROI alrededor del sitio del daño en la imagen de célula individual. Use el mismo tamaño ROI para medir la señal de fluorescencia de fondo en el nucleoplasia adyacente a, pero no superpuestos con los sitios de daño. Esto es importante para la normalización de fotoblanqueo asociado con el sistema de microscopio no confocal.
    2. Para medir las señales de fluorescencia usando el programa de análisis de imagen, haga clic en "Informe de análisis de volumen" en la caja de herramientas. Aparecerá una nueva ventana. En la sección de "Datos para mostrar", casillas sólo el "Nombre" y "Densidad". Haga clic en "Terminado" para visualizar las medidas.
    3. Los valores de exportación a un programa de hoja de cálculo haciendo clic en el icono de tabla encontrado en la parte inferior de la ventana Informe de volumen y seleccionadas "(formato excel) las pestañas" para separadores de campo y "Archivo" para el destino de la exportación.
    4. Para obtener señales de relativa, utilice el programa de hoja de cálculo para dividir la intensidad de fluorescencia en el sitio del daño (columna 1) por que en el control del región (columna 2) en el nucleoplasia de fondo y restar por 1 para la normalización.
  3. Análisis de tiempo-curso de fluorescencia cuantitativa en tiempo real con el microscopio confocal
    1. Identificar células de proteína-positivas fluorescente etiquetas utilizando el microscopio como en el paso 4.3.
    2. Realizar imágenes de fluorescencia Time-lapse antes del daño y en diferentes momentos después de la inducción de daño en la sección 4. Primero dibujar el blanqueador ROI (para la inducción de daño), a continuación, seleccione la "adquisición > serie" submenú configurar "Número" como 20 y el "retardo" como 30 s, elegir "blanqueador una vez después de la primera exploración" y haciendo clic en "start B". En este caso, la primera imagen es adquirida inmediatamente antes de la inducción de daño, seguida por 19 adquisición de imagen en un intervalo de 30 s. Intervalos ("retardo") se pueden modificar según el propósito del estudio.
    3. Una vez completada la adquisición de la imagen, haga clic en "Significa" y dibujar el retorno de la inversión en la región de daño. Haga clic en "Mostrar tabla" para obtener una tabla la intensidad en el ROIs seleccionadas. Normalizar los datos, dividiendo la intensidad de la fluorescencia del sitio daños en diferentes puntos temporales por la intensidad de la misma región antes del daño y restar 1.

7. pequeño interferir ARN (siRNA) transfección

Nota: El agotamiento de la proteína Diana es una manera eficaz para delinear el requisito de factor aguas arriba para el reclutamiento de la proteína observados dañar sitios (sección 4). Además, la estrategia es la mejor manera de abordar la especificidad de un anticuerpo que se utiliza para la detección de inmunofluorescencia (ver sección 5).

  1. Día 1: Preparar 2 pozos de células HeLa en una placa de 24 pozos de siembra 6-8 x 104 células HeLa en medios de cultivo de 0.5 mL en cada pocillo, uno para la transfección de siRNA control y uno para PARP1 siRNA (AGA AAT CTC TTA CCT CAA de 5'-CCG-3').
  2. Día 2: Confirmar que las células son aproximadamente 40-50% confluente. Realizar la primera ronda de la transfección de siRNA: diluir 5 pmol siRNA en 25 μl de medio de cultivo libre de suero, añadir lípidos μl 3 basaron de reactivo de transfección en el tubo, mezclar suavemente e incube durante 5-10 min a TA.
  3. Lavar las células con medio de cultivo fresco 0,5 mL de una vez y mantener las células en medios de cultivo fresco de 0,5 mL (véase el paso 1.1).
  4. Añadir los complejos RNA-lípidos a las células y mezclar suavemente inclinando el plato hacia delante y hacia atrás. Volver a poner las células en la incubadora como en el paso 2.1.
  5. Aspire la mezcla de transfección y agregar 0,5 mL medio de cultivo fresco (paso 1.1) después de 6 h.
  6. Día 3: Realizar la segunda ronda de transfecciones siRNA (vea el paso 7.2). Entonces, la semilla 60-100% de las células en una placa de 35 mm cubreobjetos cuadriculada como se describe en el paso 2.3.
  7. Día 5: Continuar con la microirradiation de láser con la condición de potencia de láser óptimo para reclutamiento máximo del factor de interés, según lo determinado por la sección 4. Por lo general, agotamiento eficiente puede observarse en aproximadamente el 60-90% de las células HeLa.
    Nota: Como alternativa y complementaria enfoque, inhibidores, si está disponible, puede utilizarse para inhibir la función del factor de interés32,44. Para analizar el efecto de inhibir la señalización de la DDR, agregar inhibidor PARP de 20 μm, 1 μm PAR glycohydrolase (PARG) inhibidor o a 10 μm dependiente de DNA proteína quinasa con inhibidor de la subunidad catalítica (DNA-PKcs) y el inhibidor de ATM de 10 μm en dimetil sulfóxido (DMSO) a la platos 1 h antes de la inducción de daño. Agregue el DMSO sólo a las células del control.

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Resultados

Usando células PtK2 estable expresaban EGFP 53BP11220-1711 o TRF2 YFP, láser alimentación valoración se llevó a cabo para determinar las condiciones óptimas para su contratación (figura 1)32.

En los sitios de daño del láser de alta potencia de input, el agrupamiento significativo de CPD (daño reticulando típicamente generado por daño ultravioleta (UV)) así como GFP-NTH1 ADN glicosilasa que específicamente reconoce el daño de base...

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Discusión

Las ventajas de la utilización de láser microirradiation para la investigación DDR son:

1. es factible inducir diferentes tipos y cantidades de ADN dañan por roturas de cadena simple a complejo daño en el ADN, y para detectar factores de reparación diferentes a la DNA dañan sitios mediante el ajuste de los parámetros de la irradiación láser. También es posible infligir daño varias veces en el mismo núcleo de la célula con el fin de evaluar los efectos de transporte (como en la

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Akira Yasui en la Universidad de Tohoku, Japón para el plásmido de expresión de GFP-NTH1 y Dr. Eros Lazzerini Denchi en el Scripps Research Institute, La Jolla, California de TRF2 YFP y plásmidos de expresión de EGFP 53BP11220-1711 . Este trabajo fue financiado por la oficina de investigación científica de la fuerza aérea (FA9550-04-1-0101) y la Fundación Beckman Laser Institute Inc. (a M.W.B), la beca de la Fundación Ford de la Academia Nacional de Ciencias (B.A.S) y MCB NSF-1615701 y CRCC CRR-17-426665 (a. K. Y.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ti:Zafiro NIR láser de femtosegundo pulsado Mira-900Coherent Inc.Mira 900
 Carl ZeissAxiovert 200M
63X/1.4 NA objetivoZeissAPOCHROMAT Ph3 
Platina de rotación compacta Newport CorpPR50PP
Controlador de temperaturaWarnerTC-344B
Sistema de calefacciónIbidi 10918
Sistema de incubación de gasIbidi 11920
Medidor de potencia y energía láser (RoHS)CampocoherenteMaxII-TOP 
ORCA-R2 Cámara CCD digitalHamamatsuC10600
LSM 510 META Microscopios de escaneo láserCarl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APOCarl Zeiss
35mm Platos cuadriculados MatTekP35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 células epiteliales renalesATCCCCL 56 
Células HeLaATCCCCL-2
DMEMLife Technologies11885-092
Medio independiente del CO2 Life Technologies18045-088
MEM Life Technologies12492-013suplementado con L-Glutamina, 4% FBS
penicilina/estreptomicinaFisher Scientific15140122
L-GlutaminaFisher Scientific 25030081
FBSOmega ScientificFB-02
Timidina   SIGMAT9250
medios sin suero        (Opti-MEM I Medios de Suero Reducidos)Fisher Scientific11058021
Dímero de pirimidina anti-cicolbutancia (CPD) (ratón)Kamiya Biomedical CompanyMC-062
Anti-XRCC1 (ratón)Gene Tex IncGTX72311
Anti-53BP1 (conejo)Santa Cruz Biotechsc-22760
Anti-CtIP (conejo)Abcamab70163
Polímeros anti-PAR (ratón)Enzo Life SciencesBML-SA216-0100
Anti-PAR (conejo)Trevigen4336-BPC-100
Anti-TRF2 (ratón)Novus Biological NB100-56506
Anti 6-4PP (ratón)Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (conejo)                                        (para la detección de cohesinas)Yokomori (KY)
Anti-Rad51 (Conejo)Santa Cruz BiotechnologySC-8349
Anti-Ku70 (ratón)  Novus BiologicalsNB100-102
8-oxiguanina Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Conejo)                                       generado en KY labref 43
  Anti-hCAPG (Conejo)                                      (para la detección de condensina)generado en KY labref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc711-165-152
Burro Anti-Ratón Alexa Fluor 488 IgGThermo Fisher ScientificA-21202
HiPerFect siRNA Reactivo de transfecciónQiagen301705
Lipofectamine 2000 Reactivo de transfecciónThermo Fisher Scientific11668019
GFP-SMC1 línea celular estable       generado en el laboratorioref 49  
Línea celular estable GFP-NEIL2generada en KY labref 54
Línea celular estable GFP-NTH1generada en KY labref 32
Plásmido GFP-SMC1generado en KY lab
Plásmido GFP-Kugenerado en KY lab
Anti-MDC1 (conejo)  Novus BiologicalsNB100 – 395
Anti-gH2AX (conejo)  Millipore07– 164
EGFP-53BP1(1220-1711) Línea celular estable PtK2generada en el laboratorioref 32
TRF2-YFP Línea celular estable PtK2generada en el laboratorioref 32
DMSOSigmaD2650-100ML
Inhibidor de PARGTrevigen4680-096-03
ADN– Inhibidor de PKcs  NU7026 SigmaN1537
Inhibidor de ATM KU55933  Calbiochem118500
Olaparib Tecnología ApexbioA4154
Paraformaldehído MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA CIENCIA MS100503-916 (EA)
Cantidad Un software de análisis 1-D versión 4.6.9Bio-RadSOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC Programa de análisis de imágenes
Excelprograma de hoja de cálculode Microsoft
Triton X100Fisher ScientificBP151-500detergente
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) 10X sin calcio y magnesioFisher Scientific14200166diluido a 1X 
Microscopio invertido generado en el laboratorio de KY de Berns de Berns

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