Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

Xiangduo Kong; Gladys M.S. Cruz; Bárbara A. Silva; Nicole M. Wakida; Nima Khatibzadeh; Michael W. Berns; Kyoko Yokomori

doi:10.3791/56213

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Artículo de método

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

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DOI:

10.3791/56213

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31 de enero de 2018

Xiangduo Kong^*¹ , Gladys M.S. Cruz^*² , Bárbara A. Silva² , Nicole M. Wakida² , Nima Khatibzadeh² , Michael W. Berns²^,³^,⁴ , Kyoko Yokomori¹

¹Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, ²Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, ³Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, ⁴Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Resumen

Daño de la DNA induce respuestas concretas de reparación y señalización de la célula, que es fundamental para la protección de la integridad del genoma. Microirradiation laser se convirtió en una valiosa herramienta experimental para investigar el ADN daños respuesta (DDR) en vivo. Permite análisis unicelular alta resolución en tiempo real de la dinámica macromolecular en respuesta a daño inducido por el láser confinado a una región Submicrométrica en el núcleo celular. Sin embargo, varias condiciones de láser han sido utilizadas sin apreciación de las diferencias en los tipos de daño inducido. Como resultado, la naturaleza de los daños es a menudo no bien caracterizado o controlado, provocando inconsistencias evidentes en los perfiles de contratación o modificación. Hemos demostrado que las condiciones de irradiación diferentes (es decir, diferentes longitudes de onda así como diferentes potencias de entrada (cultivos) de un láser de femtosegundo (fs) y de infrarrojo cercano (NIR)) inducida por distintos conjuntos de proteínas DDR y reparación. Esto refleja el tipo de daño en el ADN producido. Este protocolo describe cómo titulación laser de potencia de entrada permite la inducción de diferentes cantidades y la complejidad del daño de la DNA, que pueden controlarse fácilmente por la detección de daño base y reticulación, diferencial poli (ADP-ribosa) (PAR) de señalización, y Asambleas de factor de reparación específica de la vía en sitios de daño. Una vez determinadas las condiciones de daño, es posible investigar los efectos de daños diferente complejidad y daño diferencial de señalización, así como agotamiento de factor aguas arriba de cualquier factor de interés.

Introducción

En Vivo Señalización de daño de ADN no es haber entendido bien
In vivo, el ADN es acomplejado con histonas y otros factores para formar fibras de cromatina. Regulación de la estructura de la cromatina es de suma importancia para el metabolismo del ADN. Por ejemplo, la variante de la histona H2AX es fosforilada por la ataxia-telangiectasia mutado (ATM) y otras cinasas siguiente doble cadena rompe inducción (DSB) y es importante para la amplificación de la señal de OSD daños así como proporcionar un sitio para otro factores. Difusión de elección de vía de señalización y reparación de daños parecen ser críticamente influenciado por l....