Este protocolo describe la caracterización de ADN polimerasa síntesis de ADN modificado a través de la observación de los cambios en el ADN fluorescente etiquetado infrarroja usando proyección de imagen de gel y electroforesis en gel. Geles de acrilamida se usan para obtener imágenes de alta resolución de la separación de los ácidos nucleicos cortos, que migran a distintas velocidades dependiendo del tamaño.
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Artículo de método
Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida
En este artículo
Resumen
Resumen
Para cualquier enzima, robustos métodos cuantitativos son necesarios para la caracterización de las enzimas nativas y de ingeniería. Para polimerasas de la DNA, síntesis de ADN puede ser caracterizada mediante un en vitro síntesis análisis de ADN seguido de electroforesis en gel de poliacrilamida. El objetivo de este análisis es cuantificar la síntesis de ADN natural y DNA modificado (M-DNA). Estos enfoques son particularmente útiles para la resolución de oligonucleótidos con la resolución de un solo nucleótido, que permite la observación de pasos individuales durante la síntesis de oligonucleótidos enzimática. Estos métodos se han aplicado a la evaluación de una gran variedad de propiedades bioquímicas y biofísicas, como la medición de constantes de velocidad de estado estacionario de cada paso de la síntesis de ADN, la tasa de error de la síntesis de ADN y la afinidad de unión de ADN. Mediante el uso de modificado componentes incluyendo pero no limitado a, trifosfatos de nucleósidos modificados (NTP), M-ADN o mutantes polimerasas de la DNA, la utilidad relativa del sustrato-ADN polimerasa pares pueden evaluarse con eficacia. Detallamos aquí, el ensayo, incluyendo los cambios que deben realizarse para acomodar no tradicionales primer ADN etiquetado estrategias tales como la fluorescencia etiquetada ADN cerca de infrarrojo. Además, hemos detallado pasos técnicos cruciales para gel de acrilamida verter y correr, que puede a menudo ser un desafío técnico.
Introducción
Polimerasas de la DNA realizan precisa y eficiente la síntesis de ADN y son esenciales para mantener la integridad del genoma. La habilidad de sintetizar cientos de nucleótidos por segundo sin errores también hace herramientas esenciales de polimerasas de la DNA en biología molecular y biotecnología. Sin embargo, estas propiedades también limitan las aplicaciones de substratos DNA M; en términos generales, naturales polimerasas de la DNA no pueden sintetizar muchos sustratos potencialmente valiosos de M-DNA, probablemente debido a la alta presión selectiva contra la utilización de sustratos no estándar en vivo. Muchos grupos han desarrollado enfoques de evolu....
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Protocolo
1. ensayo de actividad
Nota: hay dos tipos típicos de ensayos que se ejecutan a menudo para caracterizar polimerasas de la DNA usando los métodos descritos aquí. Se diferencian en si caracterizan cualitativamente síntesis general (comprende muchos pasos de la síntesis de ADN) o si se centran cuantitativamente en pasos individuales. Describimos los pasos necesarios para cada uno de estos abajo.
Nota: Como el conjunto de materiales es relativamente complejo, para los experimentos sensibles tiempo, recomendamos que todos los materiales están montados previamente. Las recetas de todos los componentes críticos del ensayo son los siguientes....
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Resultados
Se muestran un análisis de gel de poliacrilamida al éxito de una caracterización cualitativa de la actividad total (descrito en la sección 2.1, figura 1) y de la cinética de estado estacionario (descrito en la nota final de la sección 2.1, figura 2). Un análisis de gel de poliacrilamida al fracasado también se muestra (figura 3).
Tenga en c.......
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Discusión
Aquí, hemos descrito un ensayo para caracterizar la síntesis mediada por la ADN polimerasa de la DNA de M. Utilizando cebadores de ADN etiquetados infrarrojo cercano, y usando electroforesis en gel de poliacrilamida de desnaturalización para resolver diverso tamaño de oligonucleótidos, podemos obtener la resolución de un solo nucleótido en oligonucleótidos, permitiendo una medición precisa de la síntesis. Estos enfoques se pueden utilizar para medir ya sea el conjunto de la actividad de la enzima (sección 2.1) o para med.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Corporación de investigación para el progreso científico (Cottrell Colegio académico Premio #22548) y biotecnologías TriLink (ResearchReward beca #G139).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetilado BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (es decir, DTT) | Productos de investigación Internacional | D11000 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (es decir, EDTA) (solución 0.5M) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glicerol | Sigma | G5516 | |
| Formamida | Acros | AC42374-5000 | |
| Naranja G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Azul de bromofenol | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (todos los demás NTPs modificados) | TriLink Biotechnologies | cebador | |
| 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | Utilizamos el tinte IR700 que se puede comprar como una síntesis personalizada. Por lo general, compramos los oligonucleótidos purificados por HPLC. La secuencia es 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| plantilla 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Síntesis personalizadas | lo general, compramos los oligonucleótidos purificados por HPLC. La secuencia es 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38,67% de acrilamida y 1,33% de bis-acrilamida |
| Tris/Borato/EDTA (TBE) sólido | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Cinta de gel | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Abrazadera de resorte blanca grande de polipropileno | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Persulfato de amonio (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetrametiletilendiamina (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| espaciadores de 0,75 mm | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| placas de vidrio con muescas de 33x42 | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| CBS Scientific | WPS-100 | ||
| Peine para electroforesis en gel | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Equipo de electroforesis en gel | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| agua | utilizamos un sistema Milli-Q de Millipore | ||
| ADN polimerasas | Los preparamos en nuestro laboratorio utilizando protocolos publicados. |
Referencias
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution.
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Reimpresiones y permisos
