Técnica mínimamente invasiva constricción aórtica transversal en ratones para la inducción de la hipertrofia Ventricular izquierda

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir paso a paso la técnica de invasión mínima constricción aórtica transversal (TAC) en ratones. Por la eliminación de la intubación y la ventilación que son obligatorios para el procedimiento estándar utilizado, mínimamente invasiva TAC simplifica el procedimiento operativo y reduce el esfuerzo puesto en el animal.

Resumen

Constricción aórtica transversal (TAC) en ratones es una de las técnicas quirúrgicas más utilizadas para la investigación experimental de la presión inducida por sobrecarga izquierda hipertrofia ventricular (HVI) y su progresión a insuficiencia cardíaca. En la mayoría de las investigaciones divulgadas, este procedimiento se realiza con intubación y la ventilación del animal que lo hace exigente y requiere mucho tiempo y agrega a la carga quirúrgica al animal. El objetivo de este protocolo es describir una técnica simplificada de TAC mínimamente invasiva sin intubación y la ventilación de los ratones. Pasos críticos de la técnica se acentúan con el fin de lograr la baja mortalidad y alta eficiencia en la inducción de HVI.

Ratones C57BL/6 machos (10 semanas de edad, 25-30 g, n = 60) fueron anestesiados con una sola inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina y xilacina. Una respiración espontánea animales tras una esternotomía parcial superior 3-4 mm, un segmento de sutura de seda 6/0 a través de los ojos de una ayuda de ligadura se pasó bajo el arco aórtico y atado sobre una aguja calibre 27 blunted. Animales funcionan Sham experimentaron la misma preparación quirúrgica pero sin constricción aórtica. La eficacia del procedimiento en la inducción de HVI es atestiguada por un aumento significativo en la proporción de corazón y cuerpo. Esta relación se obtiene en los días 3, 7, 14 y 28 después de la cirugía (n = 6-10 en cada grupo y cada punto del tiempo). Usando nuestra técnica, la HVI se observa en TAC comparado con animales de la farsa del día 7 hasta el día 28. Operativa y tardía (más de 28 días) mortalidad es muy bajas en el 1,7%.

En conclusión, nuestra técnica rentable de mínimamente invasiva TAC en ratones lleva muy baja mortalidad operativas y postoperatorias y es altamente eficaz en la inducción de HVI. Se simplifica el procedimiento operativo y reduce el esfuerzo puesto en el animal. Se pueden realizar fácilmente siguiendo los pasos críticos descritos en este protocolo.

Introducción

En los últimos años, se ha realizado el estudio de la insuficiencia cardíaca en modelos de animales viables¹. En comparación con grandes modelos animales de insuficiencia cardíaca, modelos animales pequeños tienen numerosas ventajas potenciales. Al lado de bajos costos de mantenimiento y vivienda, modelos animales pequeños son accesibles a los investigadores más debido a la menos compleja de las instalaciones necesarias².

Modelos de ratón insuficiencia cardiaca ofrecen muchas de las mismas ventajas que los modelos de rata. Además vivienda a menor costo³, modelos de ratón se benefician de la disponibilidad de relevantes transgénicas y knockout (KO) cepas. La posibilidad de células tipo-específica, inducible por KO o estrategias transgénicas hacen el ratón una valiosa herramienta para el estudio de la patogenia de la insuficiencia cardíaca y para tratar de identificar nuevos regímenes terapéuticos³.

Entre el ratón actualmente utilizaron⁴modelos de insuficiencia cardíaca, constricción aórtica transversal (TAC) que primero fue descrita por Rockman⁵ es el modelo preferido para generar hipertrofia ventricular izquierda (HVI) inducida por sobrecarga de presión^{1 , 3}. la mayor ventaja de este modelo es la capacidad para permitir la estratificación de la HVI², aunque ventrículo izquierdo remodelado en respuesta a la TAC es variable entre las cepas de ratón diferente. En particular, ratones C57BL/6 desarrollan rápida dilatación del LV después de TAC que no puede ocurrir con otras cepas^4,6,7.

El inicio repentino de hipertensión conseguido TAC causas un aproximadamente 50% aumento en masa del VI en 2 semanas, que permite examinar rápidamente la actividad de intervenciones farmacológicas o moleculares con el objetivo de modular el desarrollo de HVI⁴. La inducción aguda de la hipertensión severa por TAC no exactamente reproducir la hipertrofia ventricular izquierda progresiva y remodelación observado en el ajuste clínico de la estenosis aórtica o hipertensión arterial. Sin embargo, este modelo es utilizado por muchos investigadores para identificar y modificar nuevas dianas terapéuticas en la insuficiencia cardíaca⁴.

Realización de TAC en los ratones requiere mayor experiencia quirúrgica que requiere de otras técnicas utilizadas para inducir HVI y posterior insuficiencia cardiaca². Mayoría de los autores realiza este procedimiento de intubación y ventilación del animal^2,8, que hace este procedimiento más exigente y requiere mucho tiempo y agrega a la carga quirúrgica para el animal. Sólo algunos investigadores han utilizado mínimamente invasiva TAC en su estudio con breve referencia al procedimiento quirúrgico^9,10,11.

El objetivo de este protocolo es describir paso a paso una técnica mínimamente invasiva constricción aórtica transversal en ratones, destacando las etapas críticas del procedimiento simplificada y fácil de usar. Siguiendo estos pasos, uno fácilmente puede realizar esta técnica.

Protocolo

ratones macho C57BL/6J (10 semanas, 25-30g, n = 60) se utilizan en el presente Protocolo. Animales reciben atención humana conforme a las directrices formuladas por el Ministerio de agricultura y de educación superior e investigación, y todos los procedimientos se realizan con arreglo a la Directiva comunitaria europea de 24 de noviembre de 1986 () 86/609/CEE) y las leyes francesas. El protocolo fue aprobado por la " Comité Regional de ética Animal experimentación CREMEAS " (#2016092816207606).

1. preparación para la cirugía

1. mantener los ratones durante una semana después de la llegada a las instalaciones de animales en un ciclo de luz/oscuridad de 12h / 12h, en jaulas estándar, con la comida (para los detalles vea la tabla de materiales) y agua ad disponible libitum.
2. En el día de la operación, coloque los ratones en jaulas individuales unos minutos antes de la inducción de la anestesia, con el fin de evitar cualquier estrés adicional a los animales. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos el día antes de la cirugía.
3. Intra peritoneally inyectar una dosis única de una mezcla de ketamina (51,4 mg/kg) y xilacina (3,3 mg/kg) diluidos en solución salina (0,9% NaCl).
4. Asegurarse de la profundidad de la anestesia por la ausencia del reflejo de retirada del dedo del pie.
5. Afeitar el cuello y el pecho del animal con una maquinilla de afeitar disponible comercialmente y desinfectar el área depilado con alcohol al 70%.
6. Colocar el animal decúbito supino en una plataforma de trabajo de corcho limpio y fijar las patas con cinta adhesiva.

2. Cirugía

1. técnica quirúrgica estéril se utiliza a través de los procedimientos. En una respiración espontáneamente animal, realizar una incisión cervical de la línea media longitudinal más de 10 mm con un cuchillo de hoja 11 de supra esternal a medio pecho para exponer el esternón ( figura 1).
2. Retraer la tiroides pasando una sutura de estancia polipropileno monofilamento 4/0 con un Crile-Wood, sostenedor de la aguja y cinta a la plataforma de trabajo.
3. Separar claramente los músculos pre-traqueales con pinzas micro-quirúrgica para destapar la tráquea.
4. Deslice suavemente el liso con punta curva pinzas micro-quirúrgico con las mandíbulas cerradas sobre la tráquea y detrás del esternón.
5. Por cuidadosamente abrir y cerrar las mordazas de las pinzas de microcirugía curvadas con punta suave realizan una disección Roma debajo de los músculos de la tráquea y detrás del esternón para alejar a la pleura.
6. Tome los músculos supra-clavicular derecha con el fórceps recto micro-quirúrgico con punta lisa y tire suavemente el pecho del animal.
7. Deslice la mordaza inferior de la pinza de hueso bajo el esternón y realizar una esternotomía parcial superior de 3-4 mm ( figura 2). Directa de la parte inferior de la mini-esternotomía levemente hacia la izquierda.
8. Pasar una monofilamento 7/0 estancia polipropileno sutura de dentro a fuera a través del espacio intercostal segunda a cada lado de la mini-esternotomía usando un porta aguja micro-quirúrgico. Estar cerca de ángulo costo-esternal para evitar lesiones a vasos torácicos intercostales e internos o pleura.
9. Difundir los bordes esternales con suturas de estancia polipropileno monofilamento 7/0 a cada lado y fijarlos con cinta adhesiva a la plataforma de trabajo.
10. Mueva suavemente a un lado los músculos pre-traqueales, grasa mediastínica y timo utilizando liso con punta curva pinzas microquirúrgicas para visualizar el arco aórtico bajo ampliación de baja potencia (X 2-3) ( figura 3). Tener especial cuidado de no tocar ni dañar la pleura parietal para prevenir el desarrollo de neumotórax.
11. Exponer el tejido blando debajo del arco aórtico atando fórceps ( figura 4 A) y extender suavemente sus mandíbulas. Preparar un túnel en el tejido blando debajo del arco aórtico con segunda pinzas para atar suavemente abriendo y cerrando las mandíbulas en el tejido suave.
12. Pasar un segmento de ligadura de seda 6/0 a través de los ojos de una ayuda de ligadura ( figura 4 B) en la mano izquierda debajo del arco aórtico y recuperar atando pinzas en la mano derecha entre el origen de las derecha innominadas e izquierdas arterias carótidas comunes ( figura 5).
13. Cortar una aguja de calibre 27 a una longitud de 5 mm y romos ambos extremos presionándolas con un sostenedor de la aguja Crile. Coloque la aguja de calibre 27 blunted cerca del arco aórtico ( figura 6) con el fórceps recto micro-quirúrgico con punta lisa y atar la sutura firmemente alrededor de la aguja y la aorta entre la carótida común izquierda y derecha innominada arterias usando el fórceps atar dos ( figura 7). Para amarrar bien la sutura, realizar un nudo doble inicial seguido por cuatro nudos adicionales. Asegúrese de que todos los nudos planos.
14. Después de la ligadura, quite rápidamente, pero suavemente la aguja hasta lograr un estrechamiento del diámetro de 0,4 mm y una constricción aórtica reproductivos transversal 65-70%.
15. Revise hemostasia del tejido blando alrededor del arco aórtico, de los bordes esternales y los músculos pre-traqueales. Poner gasa hemostática reabsorbible donde se observa exudación de sangre. Quitar el polipropileno de monofilamento 7/0 alojarte las suturas que se utilizan para separar los bordes esternales.
16. Pasar una simple sutura de polipropileno monofilamento 6/0 con un micro-quirúrgico portagujas de fuera a dentro el espacio segundo intercostal izquierdo y luego desde dentro a fuera del espacio intercostal derecha segundo. Estar cerca de ángulo costo-esternal para evitar lesiones a vasos torácicos intercostales e internos o pleura.
17. Unir los bordes esternales atando sutura de polipropileno de monofilamento 6/0 con un Crile-Wood porta-agujas.
18. Cerca de la piel con un ejecutar sutura en una sola capa con un Crile-Wood sostenedor de la aguja de polipropileno monofilamento 5/0.
19. Realizar el procedimiento de falsa idéntico a la operación de constricción sin atar una sutura alrededor de la aorta.

3. Recuperación postoperatoria

1. controlar los animales muy de cerca. transferir el ratón a una jaula individual y colocar en una posición propensa.
2. Permitir el ratón para recuperar con una luz de calentamiento hasta despertar (menos de 1 h después de inducir anestesia).
3. Para la analgesia postoperatoria, inyectar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía intraperitoneal. repetir las inyecciones subcutáneas de 0.1 mg/kg de buprenorfina cada 8 h durante los primeros tres días según lo indicado.
4. Colocar los ratones operados en jaulas estándar (máximo 3 ratones por jaula) y mínimos 2 ratones por jaula.

4. Cosecha del corazón

1. en el día del análisis, eutanasia el ratón con una solución de ketamina 300 mg/kg y xilacina 20 mg/kg en solución salina por inyección intraperitoneal.
2. En primer lugar recoger la sangre de la vena cava inferior y luego a través de la misma línea Inyecte 5 mL de solución de 2,6 mM de EDTA en solución salina.
3. El corazón de la cosecha, eliminar las aurículas y peso del corazón (los ventrículos derecho e izquierdos sin aurículas).
4. Separar la izquierda de la derecha ventrartículo con el septo queda a la parte del ventrículo izquierdo. Pesar dos muestras de tejido y congelar en nitrógeno líquido.

Resultados

Operativa y última supervivencia
La supervivencia operativa fue muy alta, 98,3% (59 de los 60) para toda la serie (TAC y animales funcionan sham). La muerte sólo operativa fue debido a una complicación de sangrado en un ratón cepillada para operación simulada. Supervivencia posoperatoria durante el período de observación de 28 días también fue excelente, un 98.3% (58 de 59). La única última muerte postoperatoria ocurrió en un ratón de TAC el día (D) 16, posiblemente de...

Discusión

El objetivo de este protocolo es presentar una ilustración paso a paso de la técnica quirúrgica para la constricción aórtica transversal mínimamente invasiva en ratones. Descripción técnica detallada de la constricción aórtica transversal en ratones ha sido reportado por otros autores^2,8. Sin embargo, estos investigadores realizan la cirugía después de la intubación y la ventilación de los animales. El uso de un paso adicional de intubación ventilación aumenta la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio quirúrgico	Olympus	SZX2-TR30
Razor	Rowenta	Nomad TN3650FO
Suturas:
Polipropileno 7/0	Ethicon	BV-1X
Polipropileno 6/0	BBraun	C0862061
Seda 6/0 ligadura	FST	18020-60
Polipropileno 4/0	Ethicon	8683
Polipropileno 5/0	Ethicon	Z303
Medicamentos:
Ketamina	Merial	Imalgè ne 1000, LBM154AD
Xilacina	Bayer	Rompun 2%, KP09PPC
Buprenorfina	Ceva	Vetergesic, 072013
Instrumentos:
para huesos	Herramientas quirúrgicas finas	16101-10
Ayuda para la ligadura	Herramientas quirúrgicas finas	18062-12
Pinzas de atado	Herramientas quirúrgicas finas	18026-10
Portaagujas Crile-Wood	Herramientas quirúrgicas finas	12003-15
Pinzas para microcirugía	Herramientas quirúrgicas finas	11003-12
pinzas de microcirugía	Herramientas quirúrgicas finas	11002-12
Pinzas de tejido	Herramientas quirúrgicas finas	11021-12
Portaagujas para microcirugía	Herramientas quirúrgicas finas	12076-12
Tijeras para microcirugía	Herramientas quirúrgicas finas	91501-09
Tijeras para mayonesa	Herramientas quirúrgicas finas	14511-15
Cuchillo de 11 hojas	Fine Surgical Herramientas	10011-00
ARN fuerte y qPCR:
TriReagent	Euromedex	TR-118-200
Rneasy Mini kit	Qiagen	74704
Qubit Ensayo de ARN fluorimétrico	Fisher Scientific	10034622
ARN 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
Kit de ADNc de alta capacidad	Fisher Scientific	10400745
Taqman Master Mix	Fisher Scientific	10157154
Taqman Imprimaciones BNP	Fisher Scientific	Mm01255770_g1
Taqman ANP Fisher	Scientific	Mm01255747_g1
Imprimaciones Taqman ACE	Fisher Scientific	Mm00802048_m1
Imprimaciones Taqman Col1a1	Fisher Scientific	Mm00801666_g1
Taqman TGFb Imprimaciones Fisher	Scientific	Mm01178820_m1
Taqman Gapdh	Fisher Scientific	Mm99999915_g1
ABIPrism  Termociclador	Applied Biosystems	7000
Software:
GraphPad Prism	GraphPad	Prism 7
Alimento para animales
Dieta completa para ratas/ratones adultos Safe	UB220610R