Oligodendrocytes myelinating promoción la propagación del potencial de acción rápida y la supervivencia neuronal. Descrito aquí es un protocolo específico de oligodendrocyte expresión de proteínas fluorescentes en organotypic rebanadas de cerebro con imágenes de lapso de tiempo posterior. Además, se presenta un procedimiento sencillo para la visualización de mielina sin manchas.
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Artículo de método
Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal
En este artículo
Resumen
Resumen
Las neuronas dependen del aislamiento eléctrico y soporte trófico de oligodendrocytes myelinating. A pesar de la importancia de los oligodendrocitos, las herramientas avanzadas actualmente utilizadas para estudiar las neuronas, sólo en parte se han tomado por los investigadores del oligodendrocyte. Celular tipo-específicas de tinción por transducción viral es un enfoque útil para estudiar dinámica organelo vivo. Este papel describe un protocolo para visualizar las mitocondrias oligodendrocyte en rebanadas de cerebro organotypic por transducción con virus adeno-asociado (AAV) portadores de genes para proteínas mitocondriales de fluorescentes específicos bajo el control transcripcional de el promotor de la proteína básica de mielina. Incluye el protocolo para hacer organotypic rodajas de cerebro de ratón coronal. Un procedimiento para Time-lapse de imágenes de las mitocondrias luego sigue. Estos métodos pueden ser transferidos a otros organelos y pueden ser particularmente útiles para el estudio de organelos en la vaina de mielina. Finalmente, describimos una técnica fácilmente disponible para la visualización de la mielina sin manchas en rebanadas de vida por microscopia Confocal de la reflexión (núcleo). No requiere ningún equipo adicional y puede ser útil para identificar la vaina de mielina durante proyección de imagen vivo.
Introducción
Sustancia blanca del cerebro se compone de axones de neuronas envueltas en mielina, membrana plasmática prolongada especializada formada por oligodendrocitos. Mielina es necesaria para la supervivencia a largo plazo de axones myelinated y propagación del potencial de acción rápido y confiable, y una pérdida de mielina puede causar disfunción neurológica. A pesar de su importancia, las propiedades de los oligodendrocitos son menos conocidos en comparación con las neuronas y astrocitos. En consecuencia, menos herramientas han sido desarrolladas para el estudio de oligodendrocitos.
Vivo la proyección de imagen de orgánulos celulares como mitoc....
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Protocolo
los procedimientos aquí descritos han sido aprobados por la Autoridad Noruega de investigación Animal. Proveedores y números de catálogo de consumibles y otros requieren equipos están disponibles en la lista de materiales al final del documento.
1. preparación de Organotypic rebanadas
Nota: esta receta utiliza dos crías de ratón en el día postnatal 7-9 (p7-9), que rinden 24 rebanadas organotypic divididos en dos platos de seis-bien cultura. A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos deben realizarse en una campana estéril y deben utilizarse guantes de nitrilo o látex. Deben usarse sólo los ing....
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Resultados
Rebanadas de cerebro Organotypic que fueron cultivadas y transduced como se describe anteriormente demostraron una escasa distribución de corticales oligodendrocitos expresan mito_dsred y GFP. Immunostaining con los anticuerpos contra Olig2 y MBP confirmaron que la expresión era específica de oligodendrocitos (figura 1).
Para la proyección de imagen vivo, oligodendrocitos transduced fueron reconocid.......
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Discusión
El protocolo para hacer las culturas organotypic descritas aquí es una versión modificada18 del protocolo descrito por De Simoni y Yu (2006)5. Los cambios más importantes han sido subrayados a continuación. Tampón Tris se añade al medio de cultivo, que mejora la supervivencia de las láminas cuando están fuera de la incubadora durante la transducción viral y cambio del medio celular. También se modifica el procedimiento de esterilización de confeti. Mientras que otros protoc.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
Agradecemos a Linda Hildegard Bergersen y Magnar Bjørås para el acceso a laboratorio y equipos, personal de Janelia Biología Molecular compartido recursos para la producción de virus y plásmidos y Koen Vervaeke ayuda con medidas de potencia láser de la célula. Este trabajo fue financiado por la Asociación Noruega de salud, el Consejo Noruego de la investigación y el equipo de microscopía fue financiado por Norbrain.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Agujas utilizadas para la entrada y salida del baño |
| Gas de bioóxido Bombillas | AGA | ||
| Sigma-Aldrich | Z615927 | Bombillas de pipeta | |
| Quemador Bunsen (Quemador de propano líquido) | VWR | 89038-530 | |
| Conjunto de cables para controladores de calefacción | Warner Instruments | 64-0106 | Controlador de temperatura - parte del termómetro |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 para incubadora |
| Cubreobjetos, cuadrado Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | Para colocar debajo del baño para imágenes en vivo. Selle con pegamento o gelatina de petróleo. |
| D-(+)-Glucosa | Sigma | G7021 | |
| Pinza delicada | Finescience | 11063-07 | Para disección |
| Rotulador de diamante | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Pipetas de vidrio desechables Pasteur 230 mm | VWR | 612-1702 | Pipetas de vidrio |
| Hoja de afeitar de acero inoxidable de doble filo | Electrónica Microscopy Sciences | #7200 | Cuchilla de afeitar para vibratomo |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Círculos de papel de filtro | Schleicher & Schuell | 300,220 | Papel de filtro utilizado para la filtración de PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Úselo para conectar/ajustar la posición de entrada y salida en el baño |
| Toalla de mano C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, plana para cámara RC-41, | Warner Instruments | 64-1418 | Arpa para sujetar el confeti en el baño. Corte las cuerdas antes de usar con rodajas organotípicas. 1,5 mm, 13 mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Modelo 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Campana de flujo laminar Suero |
| caballo, inactivado por calor | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrana, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | confeti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax con HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Cuchara Heyman Tipo B | Microscopía Electrónica Ciencias | 62411-B | Espátula pequeña y redondeada con extremo afilado para disección |
| Unidad de filtro Millex-GP | Millipore | SLGPM33RA | Unidad de filtro de jeringa |
| Inserto de cultivo de células milicelulares, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Insertos de cultivo celular |
| Módulo de control Minipuls de 3 velocidades | GILSON | F155001 | Bomba peristáltica para imágenes en vivo - Parte del módulo de control (conectar a un cabezal de dos canales) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta | Surface Thermo Fischer Scientific | 140675 | Placa de cultivo |
| Suspensión de nistatina | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objetivo W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Objetivo de inmersión en agua utilizado para imágenes en vivo. (WD=2,5 mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehído, granular | Microscopía electrónica Sciences | #19208 | |
| Cámara de perfusión PC-R | SiSkiYou | 15280000E | Baño para imágenes en vivo |
| Penicilina-Estreptomicina, líquido | Invitrogen | 15070-063 | |
| Placa de Petri 140 mm | Heger | 1075 | Placa de Petri grande |
| Placa de Petri 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Placa de Petri mediana |
| Petridish 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Placa de Petri pequeña Solución |
| salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma | P4417 | PBS comprimidos |
| R2 Cabezal de dos canales | GILSON | F117800 | Bomba peristáltica para imágenes en vivo - Cabezal de dos canales (requiere módulo de control) |
| Espátulas redondas/planas, acero inoxidable | VWR | 82027-528 | Espátula grande para disección |
| Papel de lija | VWR | MMMA63119 | Opcional, para alisar pipetas de vidrio roto |
| Tijeras, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Tijeras grandes para disección |
| Tijeras, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Tijeras pequeñas y afiladas para disección |
| Hoja de un solo filo | Electrónica Microscopy Sciences | #71972 | Hoja de afeitar de un solo filo |
| Calentador de solución en línea simple SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 Controlador de | temperatura - parte del calentador |
| Unidad de filtro Steritop-GP, 500 ml , 45 mm | Millipore | SCGPT05RE | Filtro para esterilizar soluciones |
| Súper pegamento precisión | Loctite | 1577386 | |
| Hoja de bisturí quirúrgico n.º 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Hoja de bisturí redondeada |
| Controlador de temperatura TC324B | Warner Instruments | 64-0100 Controlador de | temperatura para imágenes en vivo (requiere solución de calentador y ensamblaje de cables) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Incubadora con camisa de agua serie II | Incubadora Forma Scientific | 78653-2882 |
Referencias
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T.
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Reimpresiones y permisos
