Se presenta un método para el análisis de espectrometría de masa de péptidos endógenos en humanos del líquido cerebroespinal (CFS). Por medio de filtración de corte de peso molecular, fraccionamiento la cromatografía, análisis de espectrometría de masa y una posterior combinación de estrategias de identificación de péptidos, fue posible ampliar la peptidome CSF conocido casi diez veces en comparación con a estudios previos.
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Artículo de método
Preparación de muestras para análisis de Endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe un método para identificar péptidos endógenos en humanos del líquido cerebroespinal (CFS). Para ello, un método previamente desarrollado basado en la filtración de peso molecular (MWCO) de corte y análisis de espectrometría de masa fue combinado con un paso de fraccionamiento la HPLC fase inversa de alto pH fuera de línea.
Secreción en LCR es la principal vía para la eliminación de moléculas de arrojar por las células del sistema nervioso central. Así, muchos procesos en el sistema nervioso central se reflejan en el LCR, haciéndola un líquido valioso de diagnóstico. CSF tiene una composición compleja, que contiene proteínas que abarcan un rango de concentración de 8-9 órdenes de magnitud. Además de proteínas, estudios anteriores han demostrado también la presencia de un gran número de péptidos endógenos. Mientras menos estudiado que las proteínas, estas también pueden tener interés potencial como biomarcadores.
Péptidos endógenos se separaron del contenido de proteína del CSF a través de filtración MWCO. Quitando la mayoría del contenido proteínico de la muestra, es posible aumentar el volumen de la muestra estudiada y así también el importe total de los péptidos endógenos. La complejidad de la mezcla filtrada péptido fue abordada mediante la inclusión de una fase inversa paso de fraccionamiento antes de HPLC (RP) a un pH alcalino antes el análisis por LC-MS. El fraccionamiento fue combinado con un esquema simple concatenación donde 60 fracciones se agruparon en 12, consumo de tiempo de análisis así podría reducirse evitando en gran parte la elución.
Identificación de péptidos automatizada fue realizada usando programas de software de identificación de tres diferentes péptidos/proteínas y posteriormente combinar los resultados. Los diferentes programas fueron complementarios más que comparable con menos del 15% de las identificaciones comprometidos entre los tres.
Introducción
Biomarcadores en líquido cefalorraquídeo (LCR) están transformando actualmente investigación en enfermedades neurodegenerativas. En la enfermedad de Alzheimer, el trastorno neurodegenerativo más común, afectando a más 60 millones de personas en todo el mundo1,2, un trío de biomarcadores de la beta amiloide péptido, estabilización de microtúbulos de proteína tau y un fosforilados forma de tau, puede detectar la enfermedad con alta sensibilidad y especificidad y ha sido incluido en los criterios de investigación diagnóstica3. En otras enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de ....
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Protocolo
El protocolo que se describe a continuación es una versión refinada de la utilizada en un estudio previo donde se identificaron una gran cantidad de péptidos endógenos en CSF humana15. Versiones del protocolo original implican alteraciones menores en el tratamiento previo químico del LCR, así como optimización de degradado que se utiliza para el fraccionamiento previo fuera de línea de alto pH RP HPLC.
Consideraciones éticas
Todos los estudios de sueco paciente y control de los materiales han sido aprobados por comités de ética: St Göran (Ref. 2005-554-31/3). Muestras de l....
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Resultados
El método aquí descrito ha sido aplicado y evaluado en tres estudios antes de la introducción de fraccionamiento de la muestra (tabla 1). El primer estudio utilizado LC offline para detectar fracciones de CSF en una placa de destino de MALDI y dio lugar a péptidos endógenos identificados 73011. En los dos estudios siguientes, etiquetado isobárica se empleó. Principalmente en un control de caso de estudio para la identificación y caracterización de potenciales biomarcadores en el CSF endopeptidome .......
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Discusión
La introducción de un alto pH RP HPLC fraccionamiento previo paso a un protocolo previamente desarrollado para la recuperación de péptidos endógenos de ultrafiltración de peso molecular11 reducción de la complejidad relativa de la muestra y lo permitido para una 5 veces mayor volumen de muestra a ser estudiada. Esto, a su vez, incrementó la concentración del subconjunto de péptidos presentes en cada fracción y así mejora las posibilidades de detectar péptidos abundantes bajas.
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Divulgaciones
No hay intereses contrapuestos, financieros o de otros, entre los autores se han divulgado.
Agradecimientos
Muchas gracias a Tanveer Batth y colegas para asesoría en establecer el método de fraccionamiento anterior.
Este trabajo contó con financiamiento del Consejo de investigación sueco, la Wallström y Fundación Sjöblom, la pistola y Bertil Stohne Fundación Stiftelse, la Fundación de Bergwall de Magnus, Åhlén Fundación, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut y Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen y FoU-Västra Götalandsregionen.
Los principales destinatarios de la financiación de este proyecto fueron Kaj Blennow, Henrik Zetterberg y Johan Gobom.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 M bicarbonato de trietilamonio | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Clorhidrato de guanidinio | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina | Pierce | 20490 | TCEP |
| Yodoacetamida | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hidroxilamina 50% (p/p) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrilo, Far UV, HPLC grado de gradiente | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Ácido fórmico | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Ácido trifluoroacético | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Solución de hidróxido de amonio | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-30 | Filtro Merck Millipore | UFC903024 | MWCO |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Aguas | WAT023590 | SPE |
| Resprep Colector SPE de 12 puertos | Restek | 26077 | Colector de vacío |
| TMT10plex Juego de reactivos de etiquetas isobáricas | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Separación de muestras en línea |
| Ultimate 3000 RPLC Sistema binario de separación rápida | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Fraccionamiento de alto pH fuera de línea |
| Orbitrap Fusion Tribrid espectrómetro de masas | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Espectrómetro de masas para el análisis de muestras |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Plataforma de búsqueda de proteómica |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Motor de búsqueda de proteómica |
| Sequest HT | Thermo | - | Motor de búsqueda de proteómica |
| PICOS v7.5 | Soluciones Bioinformáticas Inc.) | - | Motor de búsqueda de proteómica |
| Aclamar PepMap 100, 75 y micro; m x 2 cm, C18, 100 y Aring; tamaño de poro, 3 y micro; m tamaño de partícula | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Columna de trampa (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 y micro; m x 500 mm, 100Å tamaño de los poros, 2 y micro; m tamaño de partícula | Thermo Fisher Scientific | 164942 | (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac Concentradores de alta capacidad | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Concentrador |
| de vacío XBridge Peptide BEH C18 Columna, 130Å, 3.5 µ m, 2,1 mm X 250 mm | Columna | de separación de | 186003566 (micro HPLC) |
Referencias
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al.
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Reimpresiones y permisos
