Regeneración de microelectrodos de oro vestidas para un analizador en tiempo real de la célula

Resumen

Este protocolo describe una estrategia general para regenerar comerciales microelectrodos de oro vestidas para un analizador de célula libre de etiqueta para ahorro en los alta ejecución costos ofmicrochip-ensayos. El proceso de regeneración incluye la digestión de la tripsina, enjuague con agua y etanol y un paso de giro, que permite el uso repetido de los microchips.

Resumen

El ensayo de celular libre de etiqueta es ventajoso para estudio bioquímico, debido a no requiere el uso de animales de experimentación. Debido a su capacidad para proporcionar información dinámica sobre células bajo condiciones fisiológicas que ensayos bioquímicos clásicos, este ensayo de célula libre de etiquetas en tiempo real basado en el principio de impedancia eléctrica está atrayendo más atención durante los últimos década. Sin embargo, su utilización práctica puede ser limitado debido al costo relativamente caro de medición, en el que se utilizan microchips oro desechables consumibles costosos para el analizador de células. En este protocolo, hemos desarrollado una estrategia general para regenerar microelectrodos de oro vestidas para un analizador de célula libre de etiqueta comercial. El proceso de regeneración incluye la digestión de la tripsina, enjuague con agua y etanol y un paso de spinning. El método propuesto ha sido probado y demostrado para ser eficaz para la regeneración y el uso repetido de las placas electrónicas comerciales de al menos tres veces, que ayudará a los investigadores excepto en el alto costo de ejecución de ensayos en tiempo real de la célula.

Introducción

Debido a su eficiente y menos dependiente de trabajo proceso experimental, etiqueta-libre celular basada en tecnología ha sido testigo de un crecimiento rápido durante la última década fines analíticos como screening como en el aspecto de proteómica^1,2 , entrega³, etc.^4,5 comparada con métodos bioquímicos tradicionales dirigidos al análisis de la célula, análisis de la célula libre de etiquetas en tiempo real con el prototipo desarrollado por Giaever y compañeros de trabajo previamente^{6 la droga} ....

Protocolo

Nota: en general, el proceso de regeneración incluye la digestión de tripsina y paso enjuague con agua y etanol. El tiempo de digestión cambia según el número de células utilizadas y el tipo y número de células utilizadas pueden diferir dependiendo de la experimentación. Se aconseja comprobar los microchips regenerados mediante métodos ópticos y electroquímicos para optimizar las condiciones de regeneración. Durante el experimento, pueden estar involucrados productos químicos solubles e insolubles, y aquí se detallan estos dos casos típicos de los procedimientos de regeneración.

1. preparación de soluciones de regeneración de

Resultados

Propiedades de superficie de oro microchips: los procedimientos de regeneración usados en este protocolo fueron descritos en la figura 1. La figura 2 muestra el microscópico superficial fotos de fresco y regenerado electronica placas por el microscopio óptico. Como se muestra en la figura 2A y figura 2, microscópicas observaciones indi.......

Discusión

Resumimos varios métodos disponibles^{17,23,24,25,26} para regenerar microchips en la tabla 1. Básicamente, estos métodos involucrados condiciones experimentales relativamente fuertes para lograr la regeneración completa de fichas debido a la presencia de interacciones fuertes de molécula-molécula como la del complejo inmune utilizado para chips .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rata: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
ratón anti-rata CD11b monoclonal (clon OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Paneo: 1:1,000; Tinción: 1:500
Policolonal de cabra anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Tinción: 1:500
Conejo policlonal anti-Ki67	Abcam	Gato# AB15580	Tinción: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-ratón 594	Invitrogen	Cat# 11055	Tinción: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-cabra 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Tinción: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Tinción: 1:500
Triton-X (detergente en ICC tinción)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Sulfato de heparán	Galeno Suministros de laboratorio	Cat# GAG-HS01
Heparina	Sigma	Cat# M3149
Peptona de sólidos lácteos	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R& D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Lana ovina colesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Colágeno IV	Corning	Cat# 354233
Ácido oleico	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Ácido eicosadienoico (gondoico) Productos	químicos de las Islas Caimán	Cat# 20606
Calceína AM colorante	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Tripsina	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicilina/ Estreptomicina	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamina	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetilcisteína	Sigma	Cat# A9165
Insulina	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Selenito de sodio	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (alta glucosa)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lisina	Sigma	Cat# A-003-E
Placas Primarias	VWR	Cat# 62406-456
Reactivos de stock	reconstitución	Concentración utilizada	Almacenamiento
Apo-transferrina	10 mg/mL en PBS	1:100-20	y grados; C
N-acetilcisteína	5 mg/mL en H2O	1:1,000-20	° C
Selenito de sodio	2,5 mg/mL en H2O	1:25,000-20	° C
Colágeno IV	200 μ g/mL en PBS	1:100-80	y grados; C
TGF-b2	20 μ g/mL en PBS	1:10,000-20	° C
IL-34	100 μ g/mL en PBS	1:1,000-80	° C
Colesterol de lana ovina	1,5 mg/mL en etanol al 100%;	1:1,000-20	° C
Sulfato de heparán	1 mg/mL en H2O	1:1,000-20	° C
Ácido oleico/Ácido gondoico	gondoico: 0,001 mg/mL; Oleico: 0,1 mg/mL en etanol al 100%	1:1,000-20	°
C Heparina	50 mg/mL en PBS	1:100-20	y grados; C
Solutions	Receta		Comentarios
perfusión	50 μ g/mL de heparina en DPBS++ (PBS con Ca++ y Mg+ +)		Úselo cuando esté helado
Douncing Buffer	200 μ L de 0,4% de DNaseI en 50 mL de DPBS++		Úselo cuando esté helado
Tampón de paneo	2 mg/mL de peptona de sólidos lácteos en DPBS++
crecimiento de microglía (MGM)	DMEM/F12 que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 μ g/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 5 μ g/mL de N-acetilcisteína, 5 y mu; g/mL de insulina, 100 μ g/mL de apo-transferrina y 100 ng/mL de selenito		Use MGM helado para desplazar la microglía fuera del plato de inmnopanning.
Recubrimiento de colágeno IV	MGM que contiene 2 μ g/mL de colágeno IV
Tampón de separación de mielina	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS sin Ca++ y Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2		Mezcle bien después de la adición de  CaCl2 y MgCl2
TGF-b2/IL-34/Medios de crecimiento (TIC) que contienen colesterol	MGM que contiene 2 ng/mL de TGF-b2 humano, 100 ng/mL de IL-34 murino, 1,5 μ g/mL de colesterol de lana ovina, 10 μ g/mL de heparán sulfato, 0,1 μ g/ml de ácido oleico, y 0,001 μ g/ml de ácido		Asegúrese de agregar colesterol a los medios calentados a 37 °C; C y no agregue más de 1.5 μ g/mL o se precipitará. No filtre los medios que contengan colesterol. Equilibre los medios TIC con un 10% de CO2 durante 30 minutos y 1 hora antes de agregarlos a las celdas para asegurar un pH óptimo.

fuerte medio de de sodio gondoico