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RGB y la proyección de imagen espectral raíz planta Phenotyping y investigación fisiológica: montaje Experimental y protocolos de la proyección de imagen

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DOI:

10.3791/56251

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8 de agosto de 2017

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1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo experimental para la evaluación de suelo cultivado planta raíz sistemas RGB y la proyección de imagen hyperspectral. Combinación de tiempo de imagen RGB serie con información quimiométricas de hyperspectral optimiza penetraciones en la dinámica de la raíz de planta.

Resumen

Mejor comprensión de la dinámica de raíz de planta es esencial para mejorar la eficiencia de uso de recursos de los sistemas agrícolas y aumentar la resistencia de variedades de cultivo contra tensiones ambientales. Se presenta un protocolo experimental para RGB y la proyección de imagen hyperspectral de sistemas de la raíz. El enfoque utiliza rhizoboxes donde las plantas crecen en el suelo natural sobre un tiempo más largo para observar completamente desarrollado sistema de raíces. Configuración experimental se ejemplifica para evaluar rhizobox plantas bajo estrés hídrico y estudiar el papel de las raíces. Una configuración de imagen RGB se describe para la cuantificación rápida y barata de desarrollo de las raíces en el tiempo. La proyección de imagen Hyperspectral mejora la segmentación de raíz desde el fondo de suelo en comparación con el umbral de color en RGB. La fuerza particular de la proyección de imagen hyperspectral es la adquisición de quimiométricas información sobre el sistema de la raíz y el suelo para comprensión funcional. Esto se demuestra con la asignación contenido de agua de alta resolución. La proyección de imagen espectral, sin embargo, es más compleja en la adquisición de imágenes, procesamiento y análisis en comparación con el enfoque RGB. Una combinación de ambos métodos puede optimizar una evaluación integral del sistema radicular. Ejemplos de aplicaciones integración de raíz y parte aérea rasgos se dan para el contexto de la investigación fisiológica phenotyping y planta de planta. Mejora de la imagen de la raíz puede obtenerse mediante la optimización de la calidad de imagen RGB con mejor iluminación utilizando diferentes fuentes de luz y por extensión de métodos de análisis de imagen para inferir propiedades de zona raíz de datos espectrales.

Introducción

Raíces proporcionan varias funciones esenciales para las plantas como el almacenamiento de asimilados, anclaje de las plantas terrestres en la tierra y la absorción y transporte de agua y nutrientes1. Desde un punto de vista evolutivo, la formación de ejes de la raíz se considera una condición previa fundamental para el origen de la tierra las plantas2. A pesar de esta importante función, históricamente las raíces han ocupado sólo una posición marginal en la investigación biológica. En tiempos más recientes, sin embargo, existe un creciente interés científico en los sistemas de raíz de planta como se evidencia en la figura 1.

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Figura 1: Importancia de los estudios de raíz en las Ciencias de planta.
Número de raíz relacionado con estudios como porcentaje de todos los estudios de planta publicados en revistas SCI en las últimas décadas. Buscar resultado de Scopus utilizando palabras clave "planta" y "planta y raíz". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dos razones principales pueden ser presumidos para ser la base de los recientes avances en la investigación de la raíz. Vegetación terrestre, primero se expone a estrés ambiental más frecuentes como resultado del cambio global3. En el contexto de producción de cultivos agrícolas se estima que globalmente alrededor 30% de la superficie agrícola está limitado por agua y fósforo4,5. Reducción del estrés de rendimiento de las cosechas son una razón principal de las brechas de rendimiento significativas que a nivel mundial se estima en el inferior el 50% de productividad potencial de los ecosistemas agrícolas de secano6. Además de la disponibilidad de bajos recursos, esto está también relacionado con eficiencia de uso de recursos pobres, es decir, insuficiente capacidad de una planta de explotación de los recursos disponibles7. Esto resulta en pérdidas de recursos móviles tales como nitrato, que puede afectar negativamente a otros ecosistemas. Por ejemplo, la eficiencia de uso de nitrógeno global actual se estima en 47%8. Eficiencia mediante métodos de mejora de la gestión del uso del mejor recurso y cultivares, resulta de gran importancia tanto para crecimiento de salidas agrícolas así como en cuanto a sostenibilidad ambiental sostenido. En esta planta de contexto las raíces se consideran un objetivo clave para mejores cultivos y cultivo sistemas9,10.

Un segundo fondo importante para el reciente interés en las raíces de plantas es un avance tecnológico en los métodos de medición. Métodos de raíz durante mucho tiempo han sido restringidos por dos desafíos clave: para la medición de las raíces de plantas que crecen en el suelo tuvieron que ser aislados para la cuantificación, en su mayoría por lavado11, tal modo perturbar el arreglo arquitectónico de ejes de raíz. Observación de raíz "in situ" mediante excavación métodos, de tal modo conservando la ubicación natural de las raíces en el suelo, se han utilizado para la descripción botánica12. Todavía son muy desperdiciador de tiempo y por lo tanto no cumplen con los requisitos de rendimiento de análisis comparativo sistema estructural-funcional de la raíz. Por otra parte métodos de alto rendimiento para la medición de la arquitectura de raíz en su mayoría se realizaron en medios artificiales y plántulas plantas13 donde la extrapolación al entorno natural de crecimiento de las plantas es cuestionable14.

El reciente auge de la investigación de la raíz está estrechamente ligado al avance en métodos15la proyección de imagen. Enfoques en los estudios de raíz la proyección de imagen se puede agrupar áspero en tres tipos. En primer lugar hay métodos 3D de alta resolución como CT y MRI16. Estos métodos son los más adecuados para el estudio de procesos de interacción de las raíces de la planta con el suelo, tales como sequía inducida por xilema embolia17. Por lo general se aplican a muestras relativamente pequeñas donde permiten observaciones detalladas. Una comparación del CT y de MRI para macetas de diferente tamaños y proyección de imagen de bien raíz se encuentra en18. En segundo lugar, hay alto rendimiento imagen métodos19,20. Estos métodos son principalmente basada en común 2D RGB la proyección de imagen de las raíces que crecen en medios artificiales (gel, papel de germinación) donde de alto contraste permite disección relativamente sencilla entre las raíces y el fondo. Son apropiados para la comparación de alto rendimiento entre caracteres de raíz de la plántula de genotipos diferentes cultivos bajo condiciones cada vez más artificiales estandarizadas13. Entre estos dos enfoques son métodos rhizobox: se utiliza la proyección de imagen 2D de las raíces que crecen en el suelo durante largo período de tiempo y tienen rendimiento medio21,22. Un desafío reciente para la proyección de imagen (2D) de la raíz es también captar indicadores de funcionalidad de la raíz además de descripción de la estructura23.

En el presente trabajo presentamos los protocolos experimentales de rhizobox crecido sistemas radiculares mediante (i) una simple y barata por encargo RGB imagen instalación y (ii) una configuración proyección de imagen de NIR más compleja la proyección de imagen. Resultados de ejemplo de estas dos configuraciones se muestran y discuten en el contexto de planta phenotyping e investigación fisiológica de la planta.

Protocolo

1. Cajas de rizosfera para el crecimiento de plantas

NOTA: El sistema experimental utiliza cajas de rizosfera para cultivar plantas con fines de obtención de imágenes de las raíces. Primero se describe el diseño de las cajas y el sustrato utilizado, y luego se proporcionan detalles sobre el procedimiento de llenado.

  1. Diseño de rizocajas
    1. Construya rizocajas (Figura 2) con una placa trasera y marcos laterales hechos de PVC gris con un espesor de 15 mm. Utilice un tamaño de caja de 300 mm x 1000 mm. Para la ventana frontal, use vidrio mineral de 6 mm que se fija al marco de PVC mediante rieles metálicos atornillados a las paredes laterales.
    2. Realice tres orificios en el marco inferior para permitir el drenaje del exceso de agua. Estos orificios pueden cerrarse opcionalmente con tornillos de plástico.
    3. Antes de llenar, ajuste el diámetro interno de la rizocaja (entre 10 mm y 30 mm) insertando láminas de policarbonato alveolar. Se recomienda un espacio interno de 10 mm para la mayoría de los cultivos, con el fin de reducir el peso del sistema completo (el peso de la rizocaja sin suelo es de 13,2 kg).

Diagrama de la estructura de la pared con PVC, vidrio, láminas acanaladas; diseño de drenaje; dimensiones etiquetadas.
Figura 2: Sistema experimental de caja radicular y sus componentes.
La figura izquierda muestra las dimensiones de una caja radicular y la figura derecha sus componentes individuales, que consisten en una placa trasera de PVC gris con marco lateral, un vidrio mineral delantero, láminas acanaladas para un diámetro interno variable y ángulos metálicos para fijar el vidrio delantero al compartimento trasero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Sustrato
    1. Llene las cajas radiculares con suelo de campo (para este experimento: suelo superficial franco limoso de un chernozem cálcico) tamizado a un tamaño de partícula de 2 mm.
    2. Abra las cajas radiculares para llenar el compartimento interno (placa trasera con marcos laterales) en posición horizontal utilizando el sustrato prehumedecido. Llene de forma horizontal para evitar estratificación y segregación entre partículas finas y gruesas, lo cual ocurre al llenar en posición vertical vertiendo el sustrato a través de la abertura superior.
    3. Humedezca previamente el sustrato antes de llenar. Dependiendo del tipo de sustrato (especialmente de su contenido de limo y arcilla), no supere un contenido de agua de 0,12-0,18 cm3*cm-3 para evitar el pulido superficial y la degradación de la estructura. Añada la diferencia entre el contenido de agua inicial y el objetivo después de llenar las cajas radiculares con el sustrato.
      NOTA: No se recomienda llenar con sustrato (secado en estufa) completamente seco y luego añadir toda el agua posteriormente, ya que podría provocar un fuerte asentamiento del sustrato y la formación de grandes grietas.
  2. Ejemplo de llenado paso a paso
    1. Defina el contenido de agua objetivo. En este caso, se establece inicialmente en un 80 % del agua disponible para la planta (PAW), condición en la que las plantas no sufren déficit hídrico.
    2. Determine la capacidad de campo (FC) y el punto de marchitez permanente (PWP) del sustrato. Aquí, obtenga FC utilizando un tubo de PVC de altura equivalente (100 cm) a las cajas radiculares.
      1. Cierre el tubo por la parte inferior con un tapón que tenga pequeños orificios de drenaje, añada 1 cm de grava para evitar el bloqueo de los orificios por partículas finas del sustrato y llene con el sustrato hasta alcanzar la misma densidad aparente utilizada en las cajas radiculares (1,3 g cm-3).
      2. Sature el tubo con agua hasta que comience el drenaje y déjelo reposar durante dos días para alcanzar el equilibrio (el contenido de agua resultante es, por definición, equivalente a la capacidad de campo), cubriendo la abertura superior con una película plástica para evitar la evaporación. El valor de capacidad de campo alcanzado para el suelo en este experimento fue de 0,357 cm3 cm-3.
        NOTA: El contenido de agua en PWP debe conocerse previamente mediante métodos estándar de física del suelo (por ejemplo, mediciones con placa de presión24) o mediante funciones pedotransfer basadas en la textura25). En este caso, es igual a 0,12 cm3 cm-3 para el suelo utilizado.
      3. Si mide FC mediante extracción con placa de presión, tome el contenido de agua a un potencial matricial de h = -100 hPa y no a h = -330 hPa, para que coincida con la geometría de la caja radical (altura de 100 cm = 100 hPa).
      4. Calcule el contenido de agua (WC) al 80 % de PAW: WC (cm3 cm-3) = 0,80 (FC-PWP) + PWP. Para los límites hidráulicos del suelo utilizado aquí, esto da un contenido de agua volumétrico al 80 % de PAW de 0,31 cm3 cm-3.
      5. Calcule la cantidad de agua necesaria para un volumen de caja radical de 2850 cm3 (30 cm de ancho, 1 cm de espacio interno, 95 cm de altura, dejando libres los 5 cm superiores para riego). Esto da un volumen de agua de 883,5 cm3, equivalente a 883,5 g, considerando que la densidad del agua es 1,0 g cm-3 a 20 °C.
    3. Defina la densidad aparente (db) con la que llenará las cajas radiculares. En este caso, se establece en 1,3 g cm-3, valor típico en suelos agrícolas de campo. La cantidad de sustrato seco necesaria para llenar un volumen de caja radical de 2850 cm3 a esta db equivale a 3705 g de suelo seco.
    4. Humedezca previamente el suelo seco hasta un contenido gravimétrico de agua de 0,108 g g-1 (equivalente a un contenido volumétrico de agua de 0,14 cm3 cm-3) añadiendo 400 g de agua a 3705 g de suelo seco y mézclelo suavemente para obtener una distribución homogénea del agua. Rompa manualmente los agregados más grandes para mantener el tamaño de partícula ≤ 2 mm.
    5. Llene las cajas radiculares abiertas con el suelo prehumedecido y compáctelo suavemente utilizando una lámina de poliestireno (30 x 10 x 1,5 cm) para cubrir el volumen interno de la caja, logrando así una db homogénea de 1,3 g cm-3.
    6. Añada la cantidad restante de agua (483,2 g) para alcanzar el contenido de agua objetivo de 0,31 cm3 cm-3 rociándola sobre la superficie con una botella pulverizadora. Asegúrese de que las gotas sean pequeñas para evitar la degradación de la estructura superficial y lograr una humectación homogénea. Mantenga la caja sobre una balanza durante el riego para controlar la cantidad de agua realmente añadida al sustrato.
    7. Deje que el agua se redistribuya durante 10 minutos y luego coloque el vidrio sobre la superficie y fíjelo con los rieles metálicos laterales. El peso final promedio de las cajas radiculares con sustrato humedecido fue de 17818 ± 68 g (13230 g peso de la caja radical + 3705 g suelo seco + 883 g agua).
      NOTA: El contenido homogéneo de agua introducido en las cajas horizontales se redistribuirá cuando las cajas se coloquen en su posición final, según el gradiente de potencial resultante. Este es un proceso físico en todos los recipientes de crecimiento de plantas, dependiente de su geometría (altura), y los investigadores deben tener en cuenta la hidráulica de sus recipientes26.

2. Configuración de la cámara climática

  1. Equipe la sala climática (Figura 3) con 8 lámparas LED que proporcionen una iluminación homogénea de 450 μmol m-2 s-1 con picos espectrales a 440 (azul) y 660 (rojo) nm para un crecimiento óptimo de las plantas.

Diagrama del experimento de estrés en plantas; configuración de LED, estación meteorológica, conductancia estomática, gráfico de déficit de vapor.
Figura 3: Cámara climática con rizocajas para el experimento de estrés.
(A) Vista izquierda de toda la cámara con iluminación LED, estación meteorológica y PC (aquí para registrar los higrómetros foliares); vista derecha con un acercamiento del marco metálico que sostiene las rizocajas con una inclinación de 45 ° y placas de madera utilizadas para proteger la ventana de vidrio de las rizocajas de la luz. (B) Experimento de estrés con remolacha azucarera que combina cuatro etapas con estrés debido a diferentes demandas atmosféricas (alta/baja) y disponibilidad de agua en el suelo (alta/baja). Las barras verdes de conductancia estomática media indican la respuesta de la planta al estrés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Establezca los parámetros ambientales según las necesidades de la planta o del experimento. En este caso, utilice 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad para la iluminación. Durante el establecimiento de las plantas y antes de iniciar los tratamientos de estrés, ajuste la temperatura a 20 °C durante el día y 15 °C durante la noche, y mantenga la humedad relativa en 50 ± 8 %.
  2. Coloque las cajas radiculares con una inclinación de 45 ° utilizando un soporte metálico adecuado. Esto maximiza el crecimiento de las raíces hacia la superficie de vidrio debido al gravitropismo.
  3. Cubra la ventana de vidrio con una placa de madera para mantener la zona radicular en la oscuridad y evitar el crecimiento de algas causado por la penetración de luz a través de la superficie de vidrio.

3. Configuración y tratamientos del ejemplo con remolacha azucarera

  1. Pregermine semillas de remolacha azucarera sobre papel de filtro húmedo durante tres días a 20 °C en un incubador hasta que emerja la radícula. Esto asegura la siembra con plantas viables.
    NOTA: La pregerminación no es necesaria para plantas con alta vigor de germinación, evitando así el riesgo de dañar la radícula durante la siembra. Sin embargo, para semillas de remolacha azucarera con un pericarpio grueso, el riesgo de semillas no viables es alto y la pregerminación acelera significativamente la emergencia de la radícula en comparación con la siembra directa en suelo.
  2. Perfore un pequeño orificio de aproximadamente 1,5 cm de profundidad en el centro del rizobox con un destornillador, coloque una semilla en él usando pinzas con la radícula orientada hacia abajo y junto a la ventana de vidrio (esto mejora la visibilidad inicial) y cúbrala suavemente con suelo.
  3. Agregue una capa de 0,5 cm de grava fina (2-4 mm) sobre el suelo para proteger los agregados del suelo de la desagregación durante el riego y reducir las pérdidas por evaporación. Para facilitar la emergencia, mantenga la superficie del suelo libre de grava en el lugar donde se ha colocado la semilla.
  4. Agregue 10 g de agua para mejorar el establecimiento.
  5. Durante el establecimiento y el crecimiento inicial hasta el inicio de los tratamientos de estrés experimental, riegue los rizoboxes cada 2-4 días para mantener el contenido inicial de humedad del 80 % PAW.
    1. Determine la cantidad de agua de riego necesaria pesando los rizoboxes y agregando agua hasta alcanzar el peso inicial de cada caja individual. Para el riego manual, use una pipeta para evitar la degradación de la estructura superficial durante el riego.
  6. Organice los rizoboxes según el diseño establecido en la cámara climática. El protocolo descrito aquí se basa en un experimento con seis cultivares de remolacha azucarera en cinco repeticiones según un diseño completamente al azar (DCA).
    1. Vuelva a colocar los rizoboxes cada vez que los saque del soporte metálico para pesarlos y regarlos. Esto evita cualquier efecto de inhomogeneidad residual (luz) dentro de la cámara climática.
  7. Defina el momento del inicio de los tratamientos de estrés y el tipo de estrés. Se utilizan aquí las siguientes condiciones (Figura 4).
    1. Inicie las mediciones en BBCH 15 (cinco hojas desplegadas) con raíces que cubren aproximadamente el 75 % de la profundidad del rizobox y con el dosel suficientemente desarrollado para realizar mediciones en las hojas. Mantenga cada etapa durante al menos tres días para asegurar la adaptación a las nuevas condiciones y realizar las mediciones.
    2. Para las observaciones sin estrés, mantenga las condiciones iniciales con humedad óptima del suelo (80 % PAW) y condiciones ambientales (20 °C/15 °C de temperatura, 50 ± 8 % HR), lo que da un déficit de presión de vapor diurno (DPV) de 1,28 ± 0,1 kPa (cf. Figura 3 C).
    3. Aumente la demanda atmosférica a un DPV diurno de 2,45 ± 0,4 kPa elevando la temperatura a 27 °C/20 °C y reduciendo la HR al 35 %, manteniendo la humedad del suelo en 80 % PAW.
    4. Posteriormente, seque los rizoboxes hasta un 40 % PAW, equivalente a un contenido de agua de 0,215 cm3 cm-3, suspendiendo el riego. Restablezca las condiciones ambientales iniciales con baja demanda atmosférica (DPV de 1,28 kPa).
    5. Combine los estrés aumentando la demanda atmosférica a un DPV de 2,45 kPa y manteniendo la humedad del suelo en 40 % PAW.

4. Métodos de imagen de raíces

  1. Combinar métodos de imagen para aprovechar sus ventajas respectivas y según la información que se desee obtener.
    1. Aplicar imágenes RGB en el rango del espectro visible (VIS) para rastrear el crecimiento, la arquitectura y la morfología radicular a lo largo del tiempo, lo cual implícitamente requiere mediciones frecuentes. Las ventajas de las imágenes RGB son: (i) bajo costo, (ii) adquisición rápida de imágenes, (iii) bajos requisitos de espacio en disco duro (tamaño de imagen: 48 MB) y (iv) alta resolución (3648 x 5472 píxeles).
    2. Utilizar imágenes hiperespectrales (HSI) en el rango del infrarrojo cercano (NIR) cuando se requieran características quimiométricas de la raíz y del suelo. Las ventajas son: (i) características espectrales para la segmentación entre raíces y fondo de suelo y (ii) acceso a propiedades fisicoquímicas del sistema (por ejemplo, contenido de agua del suelo, edad de la raíz). Las desventajas son: (i) mayor tiempo de escaneo (aproximadamente 16 minutos por rizocaja), (ii) gran tamaño de los conjuntos de datos (13,7 GB por imagen de rizocaja), (iii) menor resolución de la cámara NIR (320 x 256 píxeles) y (iv) mayor complejidad en el análisis de datos.
  2. Imágenes RGB de raíces
    1. Utilizar una caja de imagen (Figura 4) que proteja de la luz ambiental y fije la posición de la cámara, compuesta por un marco metálico de 1 m de ancho y 1 m de alto, con paredes laterales revestidas con tableros de prensa. En el extremo frontal, fijar la cámara en dos posiciones a una distancia de 80 cm de la rizocaja.
      1. Colocar una cinta métrica en el marco de la rizocaja con cinta adhesiva transparente y posicionar la rizocaja en el soporte de la caja de imagen.
      2. Iluminar la rizocaja utilizando cuatro tubos fluorescentes de 24 W colocados a una distancia de 80 cm de la rizocaja. Además, instalar cuatro tubos UV de 15 W a 20 cm de la rizocaja como iluminación alternativa, aprovechando la auto-fluorescencia de las raíces en caso de bajo contraste entre la raíz y el fondo del sustrato (de color claro).
      3. Capturar dos imágenes (posición superior e inferior) para cubrir la mitad superior e inferior de una rizocaja, con una superposición de aproximadamente 3 cm.
    2. Adquirir imágenes RGB con una cámara réflex digital que esté fijada mediante placas de liberación rápida en las posiciones correspondientes de la caja de imagen.
      1. Aplicar la siguiente configuración al utilizar los tubos fluorescentes. Ajustar esta configuración de ejemplo ante cualquier cambio en las dimensiones, la iluminación o el modelo de cámara.
        1. Desactivar el enfoque automático y el estabilizador en el objetivo de la cámara. Configurar la cámara en modo manual.
        2. Establecer la sensibilidad ISO en 500. Establecer el tiempo de exposición en 13. Establecer la apertura en 5,6.
        3. Desactivar el bloqueo del espejo. Configurar el balance de blancos en Balance de Blancos Automático.
      2. Utilizar la siguiente configuración para la iluminación con tubos UV:
        1. Desactivar el enfoque automático y el estabilizador en el objetivo de la cámara. Configurar la cámara en modo manual.
        2. Establecer la sensibilidad ISO en 1000. Establecer el tiempo de exposición en 13. Establecer la apertura en 5,6.
        3. Desactivar el bloqueo del espejo. Configurar el balance de blancos en Fluorescencia.
    3. Combinar las imágenes RGB de la parte superior e inferior de la rizocaja en una única imagen mediante un editor de fotos (por ejemplo, Adobe Photoshop). Utilizar la cinta métrica en el marco lateral de las rizocajas y verificar los objetos superpuestos (características de raíces y suelo).
      1. Copiar las dos imágenes separadas, cada una con un tamaño de píxeles de 3648 x 5472, en un nuevo archivo de tamaño 3648 x 10944 píxeles y fondo blanco.
      2. Reducir la opacidad de la capa de una imagen al 60 % y alinear las partes superpuestas de las imágenes (cinta métrica, objetos). Posteriormente, restaurar la opacidad de la capa al 100 %.
      3. Basándose en la regla de la imagen, añadir dos líneas rojas de exactamente 1 cm en la parte superior de la imagen donde no haya raíces presentes. Estas líneas se utilizarán posteriormente en el análisis de imágenes para escalar la imagen a las dimensiones de longitud correctas.
      4. Combinar todas las capas y eliminar las partes de la imagen fuera de la ventana rellena de suelo utilizando la herramienta de recorte.
      5. Guardar la imagen como archivo tiff para su posterior análisis.
      6. En el caso de imágenes con iluminación UV, reducir los colores a escala de grises antes de guardar, utilizando la barra de herramientas Ajustes-Blanco y Negro y seleccionando el filtro predefinido Alto Contraste Azul.
    4. Para la segmentación entre raíces y fondo de suelo, así como para la cuantificación de los rasgos radiculares de interés (por ejemplo, longitud, superficie, diámetro, ramificación), utilizar cualquier software de análisis de raíces (véase www.plant-image-analysis.org para herramientas disponibles). En este caso se utiliza WinRhizo.
      1. Abrir la imagen tiff de la rizocaja en el software.
      2. Calibrar la escala de longitud de la imagen utilizando las barras de escala añadidas a la imagen.
      3. Seleccionar Basado en Color en el menú de Análisis, eligiendo Distinción entre Raíz y Fondo.
      4. Definir un archivo de calibración con clases de color correspondientes a raíces y suelo (fondo). Para las imágenes de ejemplo utilizadas aquí (cf. Figura 8), se definen tres clases de color para raíces (laterales viejas, laterales jóvenes, raíz principal) y tres clases de color para el suelo.
      5. Para las imágenes en escala de grises (iluminación UV), seleccionar (i) Basado en niveles de gris y (ii) Raíz Pálida sobre Fondo Negro en el menú Distinción entre Raíz y Fondo, y utilizar un umbral de intensidad Lagarde local para la segmentación.
      6. Abrir un archivo de datos donde se guardarán los resultados.
      7. Ejecutar el análisis y posteriormente verificar si existen regiones (por ejemplo, en los bordes) que estén mal clasificadas. En tal caso, definir una región de exclusión y reiniciar el análisis. Para raíces no clasificadas, añadir clases de color adicionales y reiniciar el análisis. Para elementos clasificados erróneamente como raíces, activar/aumentar las opciones de filtrado Residuos y Bordes Irregulares.

Configuración de imagen de plantas con lámparas UV y halógenas; soporte para cajas radiculares, montajes para cámaras para análisis de raíces y copa.
Figura 4: Caja de imagen para adquirir imágenes RGB de cajas radiculares.
Vista izquierda del lado frontal donde se colocan las cajas radiculares para la toma de imágenes con fuentes de luz en el interior; vista derecha del lado posterior donde se monta la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Imagen hiperespectral de raíces
    1. Configuración del hardware
      1. Utilice un sistema de imagen hiperespectral de raíces (Figura 5) compuesto por (i) una cámara monocromática de infrarrojo cercano (NIR) refrigerada termoeléctricamente, de 14 bits, con un rango espectral de 900 nm a 1700 nm, 320 por 256 píxeles y una frecuencia de cuadros de 100 Hz, y (ii) un espectrógrafo de imagen con un rango espectral de 900 nm a 2500 nm y una resolución espectral de 3.6 nm. Coloque una fuente de iluminación lineal de halógeno (cuatro focos de halógeno de 50 W) en una geometría de 45°/-45°. Monte el sensor de imagen en un sistema de posicionamiento de dos ejes. La ventana de escaneo tiene un tamaño de 240 x 1000 mm, es decir, 30 mm en cada borde del rizobox no quedan cubiertos por la imagen.
      2. Controle el sistema mediante un script de Matlab para (i) la adquisición de estándares blanco y oscuro, (ii) el ajuste del tiempo de integración de la cámara, (iii) la selección de la resolución espacial (tamaño de píxel de 0.1 mm; tamaño de píxel de 1.0 mm) y espectral (todas las 222 bandas espectrales con una resolución de 3.6 nm; espectro suavizado con 54 bandas y una resolución de 14.8 nm), y (iv) la definición de la región de escaneo en el rizobox.
      3. Guarde las imágenes como archivos SIF. Para evitar problemas durante el guardado de archivos grandes, divida cada tramo escaneado (9 tramos por rizobox) en cuatro segmentos (tres de 300 mm de longitud y uno de 100 mm de longitud) y guárdelos por separado con un nombre de archivo único compuesto por el número de tramo (1 a 9), la parte (1 a 4), así como la fecha y hora (AAAA.MM.DD HH:MM:SS). Un escaneo completo de un rizobox requiere un espacio en disco duro de 13.7 GB.
    2. Adquisición y análisis de imágenes.
      NOTA: Figura 6 muestra los pasos de adquisición de imágenes, segmentación y análisis.
      1. La adquisición de imágenes comprende la selección de la configuración de la cámara para obtener una calidad de imagen óptima y la definición de los parámetros de escaneo.
        1. Determine los tiempos de integración de la cámara para el escaneo del rizobox y el estándar blanco en el software de la cámara.
          1. Abra la interfaz gráfica de imagen (GUI) y mueva la cámara a una posición del rizobox donde haya raíces.
          2. Ajuste el tiempo de integración de la cámara apuntando a un objeto claro (es decir, una raíz) de manera que aproximadamente el 85 % del rango dinámico completo de la cámara se utilice en el histograma mostrado por el software. Repita este procedimiento para el estándar blanco moviendo el sistema de posicionamiento de la cámara para apuntar al estándar blanco. Luego cierre el software de la cámara.
        2. Abra la GUI de imagen de Matlab y realice todos los ajustes para el escaneo actual del rizobox. Para los datos aquí reportados, utilice la siguiente configuración:
          Tiempo de integración del estándar blanco: 1000
          Tiempo de integración del rizobox: 4000
          Resolución espectral: Resolución completa (es decir, 222 bandas espectrales de rango estrecho)
          Resolución espacial completa (tamaño de píxel de 0.1 mm)
          1. Adquiera los estándares oscuro y blanco antes de cada sesión de imagen, por ejemplo, una vez al día. El estándar oscuro representa el ruido de la cámara, mientras que el estándar blanco proporciona la reflectividad máxima. Estos datos son necesarios para la normalización de la imagen durante el preprocesamiento.
          2. Defina si se escanea todo el rizobox o solo una parte del mismo. En el presente caso, se imagina todo el rizobox. Luego inicie el escaneo.
      2. Procese la imagen con un script de Matlab. A continuación se describen las operaciones realizadas por el script.
        NOTA: Los scripts actualmente se encuentran en una versión sin documentar y pueden obtenerse del autor correspondiente. Tras su adecuada documentación, estarán disponibles para descarga en el sitio web de la institución del autor correspondiente (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
        1. Componga un tramo completo de imagen desde el centro del rizobox (que contiene raíces) fusionando las cuatro partes del tramo.
          NOTA: En esta etapa no es necesario ni recomendable utilizar una imagen espectral de todo el rizobox (es decir, los 9 tramos completos), ya que el tamaño del archivo haría que cada paso de cálculo en Matlab fuera muy lento, y la información contenida en un solo tramo central es suficiente para los primeros pasos del análisis de imagen.
        2. Normalice la imagen utilizando los estándares oscuro y blanco adquiridos, teniendo en cuenta los diferentes tiempos de integración de los escaneos del estándar blanco y del rizobox, que se guardan automáticamente durante el escaneo en un archivo.
        3. Aplicar opcionalmente un filtro de suavizado para eliminar el ruido de la imagen. Actualmente, el script ofrece filtrado mediano con kernel 3x3 y corrección múltiple de dispersión. Para la evaluación de imágenes presentada aquí, no se aplican filtros.
        4. Muestre la imagen en todas las bandas espectrales registradas para obtener una primera visión general y decida una longitud de onda para mostrarla al seleccionar regiones de interés (cf. segmentación de imágenes).
      3. Realice la segmentación entre raíces y fondo de suelo en un script independiente con los siguientes pasos.
        1. Seleccione regiones de interés (ROI) para raíz y suelo con el fin de encontrar características espectrales para la segmentación. Utilice la herramienta de selección a mano alzada para marcar una ROI en la imagen mostrada a una longitud de onda previamente identificada con buen contraste entre raíces y suelo. Aquí, utilice tres ROI en la raíz (laterales viejas y jóvenes, raíz principal) y dos ROI en el suelo (zona seca y húmeda).
        2. Muestre un rectángulo con las ROI seleccionadas y el resto como una máscara negra, y visualice la imagen de ROI seleccionada en todas las longitudes de onda.
        3. Elimine todas las líneas en la matriz de imagen que contengan píxeles con intensidad espectral = 0 (píxeles negros).
        4. Fusione las ROI de raíz y suelo en una matriz de primer plano (raíz) y una matriz de fondo (suelo) para la segmentación.
        5. Busque bandas espectrales (intensidad de espectros individuales o relaciones espectrales) que proporcionen la mejor separación entre el primer plano de raíz y el fondo de suelo27. Cuantifique la distinción entre los histogramas resultantes de píxeles para raíz y suelo utilizando la distancia de Bhattacharyya28.
        6. Seleccione un valor de intensidad umbral que separe los histogramas.
        7. Cree una imagen binaria aplicando el umbral seleccionado a la imagen original. Esto establece a cero todos los píxeles con intensidad menor que el umbral y a uno aquellos con intensidad mayor (realizado automáticamente por el script).
        8. Guarde la imagen binaria como archivo tiff.
      4. Abra la imagen binaria y analice los rasgos de la raíz. Seleccione (i) Basado en niveles de gris y (ii) Raíz clara sobre fondo negro en el menú Distinción entre raíz y fondo y utilice umbral de intensidad global (la imagen ya está binarizada).
      5. Para mapear el contenido de agua a partir de los datos hiperespectrales, adquiera un conjunto de datos de calibración y aplique una ecuación de calibración a una imagen de rizobox.
        1. Divida un rizobox en compartimentos de 5 cm utilizando láminas de poliestireno para llenarlos con suelo (mismo sustrato y db que el utilizado en el experimento) a diferentes contenidos de agua (Figura 8).
        2. Calcule las cantidades respectivas de agua que deben mezclarse con el suelo y llene los compartimentos (mismo procedimiento descrito en 1.3. para el rizobox completo).
        3. Escaneé el rizobox de calibración con los mismos ajustes utilizados para los rizoboxes plantados.
        4. Realice los siguientes pasos utilizando un script.
          1. Fusione las cuatro partes de un tramo de la caja de calibración de agua en un solo tramo y normalícelo con los estándares oscuro y blanco.
          2. Seleccione recuadros rectangulares en cada compartimento con diferente contenido de agua y guárdelos en un arreglo estructurado.
          3. Determine la característica espectral que mejor separa los compartimentos de contenido de agua. Esto se realiza con un algoritmo de búsqueda del máximo global de las diferencias de intensidad entre los espectros medios de contenidos de agua adyacentes.
          4. Calcule el valor medio de intensidad espectral para esta característica en cada compartimento de contenido de agua del rizobox de calibración.
          5. Ajuste una ecuación de regresión a través del contenido de agua medido directamente y el cuantificador espectral respectivo.
          6. Aplique la ecuación de regresión a cada píxel no clasificado como raíz en una imagen de rizobox y para la característica espectral (banda) determinada anteriormente que mejor se relaciona con el contenido de agua.

Configuración del espectrógrafo para análisis óptico; iluminación halógena, caja de rizosfera, unidad de control de potencia/movimiento.
Figura 5: Escáner hiperespectral de raíces.
Se indican los componentes principales del escáner. La imagen pequeña muestra la cámara durante la adquisición de imágenes de una caja de rizosfera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de análisis de imagen hiperespectral: configuración de adquisición, segmentación, mapeo de agua, análisis quimiométrico.
Figura 6: Pasos en la imagen hiperespectral de raíces.
La imagen hiperespectral de raíces consta de tres pasos principales: (i) adquisición de imágenes, (ii) segmentación de imágenes y (iii) análisis de los datos espectrales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Experimento de germinación de semillas; gradientes de humedad en poliestireno y papel de germinación.
Figura 7: Caja radicular para calibración de agua.
La caja radicular contiene compartimentos con sustrato a diferentes contenidos de agua que están subdivididos por láminas de poliestireno. El papel de germinación en los compartimentos secos asegura que las partículas del suelo no se arrastren hacia los compartimentos adyacentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Ejemplos de aplicación

NOTA: La información cuantitativa de la raíz se aplica en el contexto del fenotipado de plantas (comparación de cultivares) y para la investigación fisiológica de plantas. A continuación se presentan datos aéreos para ejemplificar estos casos.

  1. Área foliar: Mida el área foliar de forma no destructiva en etapas seleccionadas durante el experimento mediante la longitud y anchura de las hojas como variable sustituta. Alternativamente, pueden utilizarse imágenes del dosel29.
    1. Al final del experimento, mida la longitud y anchura foliar junto con el área de las hojas cortadas utilizando un medidor de área foliar. Calibre el método no destructivo aplicando una ecuación de regresión a los pares de datos.
  2. Materia seca: Al final del experimento, mida la materia seca aérea cortando las plantas con tijeras y seque las muestras durante 24 horas a 105 °C en una estufa.
  3. Conductancia estomática: Mida la conductancia estomática con un porómetro foliar. Antes de la medición, mantenga el dispositivo al menos una hora en la cámara climática para permitir que los sensores se equilibren con las condiciones ambientales, y calibre el equipo cada vez que cambien las condiciones ambientales en la cámara climática. Realice mediciones en al menos tres hojas por planta.

Resultados

Se presentan resultados de ejemplo para la segmentación de raíces basada en imágenes RGB e imágenes HS. Para la imagen espectral, se proporciona un ejemplo de mapeo de agua de alta resolución. Finalmente, se muestran resultados que demuestran el contexto científico en el que se aplican los datos de raíces basados en imágenes.

Medición de raíces basada en RGB

Figura 8 muestra una serie temporal de imágenes RGB de la raíz de la variedad de remolacha azucarera Ferrara. Las imágenes revelan algunos artefactos debidos a una iluminación inhomogénea de las cajas radiculares, con áreas más brillantes a lo largo del lado izquierdo y diferente luminosidad en la zona de superposición entre las imágenes superior e inferior.

Estudio de crecimiento de raíces RGB, remolacha azucarera 'Ferrara', días 20-35, análisis de lapso de tiempo, diagrama de crecimiento.
Figura 8: Serie temporal de crecimiento de raíces a partir de imágenes RGB.
Las imágenes muestran el cultivar de remolacha azucarera Ferrara en diferentes días posteriores a la siembra (DAS). Las imágenes muestran algunos artefactos debidos a una iluminación no homogénea en el lado izquierdo de la imagen y entre las imágenes superiores e inferiores. Barras de escala, 2 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9 proporciona detalles sobre la segmentación de raíces basada en el umbral de color para el cultivar Ferrara en el día después de la siembra (DAS) 35. Como referencia (Figura 9A), se utiliza una imagen binaria en la que todas las raíces fueron rastreadas manualmente con una tableta gráfica. El tiempo requerido para el rastreo manual de todo el sistema radical, completamente desarrollado y denso, de la remolacha azucarera fue de aproximadamente cuatro horas. Figura 9B ofrece una vista detallada de un área seleccionada en la parte superior de la imagen, donde están presentes raíces laterales viejas. Aquí, varios ejes radiculares no son clasificados por el umbral de color. En la parte inferior (Figura 9C), por el contrario, donde predominan las raíces jóvenes blancas, la segmentación basada en el color clasifica correctamente todos los ejes radiculares. El sistema radical binarizado (Figura 9D) muestra un área negra en el lado izquierdo debida a un artefacto de iluminación, que fue definido como región de exclusión antes de realizar el análisis cuantitativo. Figura 9E muestra los histogramas de píxeles correspondientes a características seleccionadas (raíces frente a suelo) para el canal rojo de la imagen RGB de Ferrara en el DAS 35. Los píxeles de las raíces (color azul) muestran claramente tres picos correspondientes a laterales jóvenes brillantes, laterales viejos oscuros y raíz principal. La superposición entre los laterales viejos y el fondo del suelo es muy fuerte, lo que lleva a ejes radiculares no clasificados (cf. Figura 9B).

Diagrama de segmentación de raíces basado en color RGB con análisis histograma de tipos de raíces y diferenciación del suelo.
Figura 9: Segmentación de raíces mediante umbral de color.
(A) Sistema de raíces segmentado manualmente utilizando una tableta gráfica, (B) área con ejes de raíces viejas mal segmentados en la parte superior y (C) ejes jóvenes correctamente segmentados en la parte inferior de la imagen, y (D) imagen binaria obtenida mediante umbralización basada en color. (E) Histogramas de píxeles para características seleccionadas de la imagen RGB. Las raíces están representadas por las barras azules con diferentes tipos de raíces indicados; el suelo está representado por las barras rojas. Barras de escala en A y D, 2 cm; barras de escala en B y C, 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La longitud total de raíces visibles resultante cuantificada para la imagen de referencia segmentada manualmente es de 1534,1 cm, mientras que la segmentación automatizada basada en color da una longitud total de raíces de 1427,6 cm.

Las imágenes en escala de grises obtenidas mediante iluminación UV no ofrecen una ventaja en el caso mostrado aquí y tuvieron un desempeño inferior en comparación con el umbralizado a color (longitud de raíz: 1679,7 cm). No fue posible segmentar las raíces viejas, y hubo más ruido en la imagen, probablemente debido a la menor intensidad lumínica de las lámparas UV. Sin embargo, en el caso de raíces jóvenes con alta auto-fluorescencia y un sustrato de fondo brillante, la iluminación UV aún puede ser una opción, como se muestra en una imagen obtenida de otro experimento en el que se utilizó arena como sustrato de fondo (Figura 10).

Microscopía de fluorescencia; estructura de la raíz; izquierda: imagen confocal con tonos azules, derecha: imagen de campo brillante.
Figura 10: Iluminación con luz ultravioleta para visualizar raíces sobre un fondo claro.
Ejemplo de un sistema de raíces de trigo duro creciendo en una caja rizosférica llena de arena de cuarzo. La caja rizosférica se imagina con iluminación para (A) luz UV y (B) luz fluorescente (diurna). Barras de escala, 2 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mediciones de raíces basadas en HSI

Figura 11 muestra los espectros promedio para tres regiones de interés en la raíz (laterales viejas y jóvenes, raíz principal) y dos regiones de interés en el suelo (parte superior e inferior del cajón radicular).

Gráfico de análisis espectral de raíces, reflectancia normalizada frente a longitud de onda, comparaciones entre suelo y raíz.
Figura 11: Espectros medios de raíz y suelo.
Espectros provenientes de regiones de interés (ROI) en la raíz (tres tipos de raíces) y en el suelo (parte superior e inferior del rizobox). Las ROI se seleccionan para determinar un criterio óptimo de segmentación entre raíz y suelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Es evidente que las raíces principales y laterales jóvenes difieren considerablemente del fondo en la intensidad de la mayoría de las bandas espectrales. En el caso de las laterales viejas, las diferencias de intensidad son mucho menores. Una característica que puede inferirse visualmente es la pendiente diferente del espectro alrededor de la región de absorción de agua (1450 nm). Aquí, la pendiente de los espectros de las raíces es mayor en comparación con los espectros del suelo. Además, puede identificarse un cambio en los espectros de la raíz principal y de las laterales jóvenes en la región alrededor de 1100 nm, que no ocurre en las laterales viejas.

Figura 12A muestra el resultado del algoritmo de búsqueda que identifica una relación espectral con el mayor contraste entre primer plano y fondo. La relación de los espectros a 1476 nm y 1076 nm proporciona la mejor separación entre raíces y suelo. El histograma resultante de los píxeles de primer plano de las raíces y del fondo del suelo se muestra en la Figura 12B. Aunque existe cierta superposición, la mayoría de los píxeles están claramente separados del fondo del suelo. Al ajustar una curva gaussiana bimodal al histograma y utilizar la distancia de Bhattacharyya para la cuantificación, se obtiene un valor de 7,80. Un valor superior a 3,0 indica un fuerte contraste de imagen que permite una separación confiable28.

Mapa de calor espectral e histograma para el análisis de intensidad de longitud de onda; análisis de datos de emisión óptica.
Figura 12: Diferencia en reflectancia entre el primer plano de la raíz y el fondo del suelo para diferentes relaciones de bandas espectrales e histograma de píxeles en la relación espectral utilizada para la segmentación.
(A) Los colores brillantes (amarillo) indican alto contraste entre el primer plano y el fondo, mientras que los colores oscuros (azul) indican bajo contraste. Las primeras 15 bandas se han eliminado debido al ruido. Las líneas rojas indican la relación de bandas con el mayor contraste. (B) Histograma de píxeles de las raíces (azul) y del suelo (rojo) en la relación espectral de segmentación. Las barras azules representan la raíz y las barras rojas representan el suelo. El valor de intensidad corresponde a la relación entre la banda espectral 160 y la banda espectral 49. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La imagen binaria (Figura 13) se crea aplicando un umbral de intensidad global de la razón espectral identificada con un valor de 1,008 calculado a partir de la distancia del histograma27. El análisis de la longitud de las raíces de esta imagen arroja una longitud total de 1557,3 cm, lo que representa un error de solo el 1,5 % en comparación con la imagen de referencia trazada manualmente.

Diagrama de estructura de red neuronal; árbol dendrítico; imagen de microscopía; visualización de conectividad neuronal.
Figura 13: Imagen binaria del sistema radicular de la variedad de remolacha azucarera Ferrara.
La imagen se obtiene aplicando un umbral espectral global. Barra de escala (esquina inferior izquierda), 2 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aunque la segmentación de raíces ha mejorado mediante el uso de información espectral en comparación con la información basada en color, la intención principal de la imagen hiperespectral es el análisis de las propiedades quimiométricas de la imagen. Esto se ejemplifica mediante la representación del contenido de agua de una imagen de una caja de rizosfera.

Figura 14A muestra los espectros medios de los compartimentos en la caja radicular de calibración (cf. Figura 7) llenos con suelo de diferente contenido de agua. La forma de los espectros es similar entre los compartimentos, es decir, en este caso una razón espectral no proporciona necesariamente un criterio de clasificación más estable. Por lo tanto, se identifica la intensidad en una única banda espectral (1680 nm), donde la diferencia media entre contenidos de agua adyacentes es máxima, como el mejor criterio de separación. Los histogramas resultantes de píxeles para esta longitud de onda espectral se muestran en la Figura 14B.

Gráficos de análisis espectral; (A) espectros de absorción, (B) distribución de intensidad para estados húmedo-seco.
Figura 14: Características espectrales para la calibración del contenido de agua.
(A) Espectros promedio de nueve compartimentos de agua del rizobox de calibración con diferentes contenidos de agua; (B) Histogramas de píxeles para los compartimentos de agua en la banda 216, donde la distancia promedio entre compartimentos adyacentes es máxima. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La relación entre la intensidad promedio de píxeles a 1680 nm y el contenido de agua medido se muestra en la Figura 15.

Gráfico de humedad del suelo; ajuste exponencial y lineal. Contenido de agua frente a reflectancia; capacidad de campo, punto de marchitez.
Figura 15: Relación entre reflectancia espectral y contenido volumétrico de agua.
La figura muestra pares de datos de contenido de agua medido y reflectancia espectral con curvas empíricas (lineal y exponencial) ajustadas a los datos, excluyendo los contenidos más altos de agua (triángulos rojos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La diferenciación de contenidos de agua más altos a partir de la intensidad espectral resulta difícil. Se puede ajustar una regresión significativa (ya sea lineal o exponencial) con un alto R2 para contenidos de agua hasta aproximadamente 0,30 cm3 cm-3. Las condiciones de suelo más húmedo no pueden predecirse de forma confiable mediante el valor de intensidad. Un comportamiento similar de una relación exponencial entre reflectividad y contenido de agua, con una respuesta decreciente para contenidos de agua superiores a 0,30 cm3 cm-3, también se ha observado en otros estudios30.

Se muestra una imagen de una caja radicular con una cartografía detallada del contenido de agua en la Figura 16. Se deben destacar cuatro aspectos. Primero, puede observarse una región con menor contenido de agua en las partes enraizadas de la caja radicular. Segundo, la mayor disminución se concentra en las proximidades de ejes radiculares individuales. Tercero, las zonas de agotamiento también ocurren donde no se ven ejes radiculares en la superficie, lo que indica regiones donde las raíces están ocultas en el suelo. Cuarto, la cartografía del agua sin procesamiento adicional de la imagen da como resultado un aspecto irregular debido a la agregación del suelo. Esto puede indicar una distribución heterogénea del contenido de agua a escala de agregado, pero también puede deberse a efectos de la morfología superficial sobre la calidad de la imagen. Las técnicas quimiométricas de procesamiento de imágenes son una opción para superar tales efectos morfológicos en imágenes espectrales31, pero hasta ahora no se han implementado en los scripts de Matlab utilizados aquí.

Diagrama de la estructura de una neurona; detalle de las ramas dendríticas en el análisis de redes neuronales.
Figura 16: Mapeo del contenido de agua en una caja de raíces (rhizobox).
Los colores azul oscuro representan regiones con alto contenido de agua, mientras que las áreas de verde a rojo muestran regiones con bajo contenido de agua. La raíz de la planta aparece superpuesta en la imagen en color negro. Barra de escala (esquina inferior izquierda), 2 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ejemplos de aplicación

Figura 17 relaciona rasgos cuantitativos de las raíces obtenidos mediante análisis de imágenes con mediciones de la parte aérea.

Análisis de datos de crecimiento vegetal; gráficos de longitud de raíz, relación del área superficial, materia seca y conductancia estomática.
Figura 17: Ejemplos típicos de aplicaciones para datos de raíces.
(A) y (B) muestran información de raíces utilizada para la caracterización de partes aéreas y subterráneas de la planta en un contexto de fenotipado. (A) representa el crecimiento de la raíz de la variedad de remolacha azucarera Ferrara, (B) compara seis variedades de remolacha azucarera cultivadas en cajas de rizosfera utilizando la relación entre el área foliar y el área de raíz (datos de una réplica). (C) y (D) son relaciones funcionales entre caracteres tal como se observan en investigaciones de fisiología vegetal. (C) muestra la influencia de la relación entre el área foliar y el área de raíz en la producción de materia seca y (D) la relación entre el área superficial de la raíz y la conductancia estomática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 17A y 17B son relevantes para la fenotipificación centrada en la caracterización completa de las partes aéreas y subterráneas de la planta. Figura 17A muestra el crecimiento radicular del cultivar de remolacha azucarera Ferrara (cf. Figura 8 para imágenes). La expansión del sistema radicular indica la capacidad de un cultivar para explorar el volumen del suelo en un período de tiempo determinado del ciclo vegetativo. Figura 17B muestra la relación entre el área superficial de las hojas y las raíces de seis cultivares de remolacha azucarera, proporcionando un descriptor del equilibrio entre el suministro (raíz) y la demanda (hoja) de la planta.

Figuras 17C y 17D muestran ejemplos de relaciones funcionales de interés en la investigación fisiológica. En la Figura 17C, la relación entre el área foliar y el área radicular se relaciona con la materia seca formada durante el experimento, lo que indica el papel predominante de la superficie asimiladora como factor limitante para la acumulación de materia seca. La falta de significancia, a pesar de un valor de R2 comparativamente alto, se debe al reducido número de datos apareados (n=6) utilizados aquí. La Figura 17D revela que los cultivares con mayor área superficial radicular (absorción mejorada) presentan una conductancia estomática promedio más alta a lo largo del experimento. El mayor área radicular aparentemente sostiene la extracción de agua, prolongando así la apertura estomática.

Discusión

Los protocolos proporcionan dos enfoques complementarios para suelo crecido en proyección de imagen de sistema de la raíz. Un paso crítico para obtener resultados experimentales confiables se llena de la rhizoboxes que tiene que garantizar una capa uniforme y homogénea del sustrato en el vidrio delantero proporcionan el contacto de la raíz y el suelo firmemente en la ventana de observación y evitar espacios de aire. Esta es la razón principal para utilizar comparativamente finas del suelo tamizada de < mm 2: agregados más grandes resultan en mayor superficie morfología en la ventana de observación con espacios vacíos entre los agregados. Además de un mayor riesgo de deshidratación de punta de raíz, esto también requiere técnicas más complejas de procesamiento de imagen para la asignación de agua31.

Modificaciones del Protocolo por lo tanto se centran en mejorar y rápido llenado de rhizoboxes. Tiempo de relleno actualmente es cerca de 30 minutos por la caja. Además se analizan uso de rhizoboxes con dos ventanas de cristal para la proyección de imagen de ambos lados y modificaciones para optimizar la homogeneidad de iluminación para imágenes RGB mejor. Ampliación hardware también puede considerar la integración de optodes plana32 así como capacitancia33 la proyección de imagen en el sistema de rhizobox. Esto es sin embargo más allá de las actividades actuales de modernización.

Modificaciones del software se centran en el registro automático de la imagen a la parte superior del fusible y RBG imágenes34de fondo. Para hiperespectral imagen extracción de característica sin supervisión avanzada acerca28 y más sensibles métodos de detección de objetivo supervisados como MVS35 son probados. Tal modo los datos hiperespectrales potencialmente permitan la evaluación de múltiples propiedades suelo, rizosfera y raíz36. Además se pretende desarrollar un (semi) automatizadas de software para rhizobox raíz imágenes basadas en una versión modificada de raíz sistema analizador37 cuantificar morfológicas (longitud, diámetro, superficie) así como de rasgos arquitectónicos (frecuencia de ramificación, ángulos de ramificación).

La principal limitación del protocolo comparado con métodos de proyección de imagen 3D es la restricción a la raíz visible superficial y propiedades de la rizosfera. Sin embargo se ha demostrado que los rasgos visibles de raíz son un proxy confiable para el sistema entero de la raíz21. La técnica de rhizobox se combina fácilmente con el tradicional muestreo destructivo (lava) al final del crecimiento dinámico proyección de imagen con el fin de validar a la relación de visible vs total del sistema raíz rasgos. Esta relación puede variar entre especies21, muestreo destructivo se recomienda para inferencia confiable de rasgos visibles de cualquier nueva serie de fenotipado con una especie de cultivo diferentes.

La ventaja clave del protocolo presentado aquí es la combinación de las condiciones de crecimiento realista (suelo), relativamente alto rendimiento potencial para el temporal resolver la proyección de imagen RGB e inferencia en la funcionalidad de la raíz (por ejemplo, absorción de agua) a través de los datos de raíces y rizosfera quimiométricas de hyperspectral imaging. Así los métodos supera las restricciones de la inferencia en plántula de alto rendimiento y no suelo raíz de métodos14, mientras que parcialmente permite penetraciones profundas phenotyping en procesos funcionales con complejidad menos experimental y un mayor rendimiento en comparación con métodos avanzados de 3D15.

En próximos experimentos se utilizará el protocolo para estudiar el efecto de la micorriza en el desarrollo del sistema radicular y la funcionalidad de las legumbres así como en cuanto a características de raíz de fenotipado de las especies de cultivo de cobertura en relación con la estructura del suelo, el nitrógeno y el carbono bicicleta.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores reconocen que la financiación de la austríaca ciencia fondo FWF mediante el proyecto número P 25190-B16 (las raíces de la resistencia a la sequía). Establecimiento de la infraestructura de proyección de imagen hyperspectral fue apoyado financieramente por el Federal gobierno de Baja Austria (Niederösterreich tierra) vía el proyecto K3-F-282/001-2012. Financiación adicional para el experimento de la remolacha azucarera se recibió de AGRANA investigación & GmbH de centro de innovación (ARIC). Los autores agradecen a Craig Jackson para el soporte técnico durante el experimento y el inglés corrección del manuscrito. También reconocemos Markus Freudhofmaier que contribuyeron a la configuración de imagen RGB y Josef Schodl para la construcción del montaje rhizobox.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RhizoboxTechnisches Bü ro fü r BodenkulturConstructor
Lámparas LED ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
Tubo de luz fluorescente HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
Tubo de luz UV Eurolite 45cm slim 15 WConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Versión 12.0 x 32Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013Regent Instruments Inc.
Cámara SWIR Xeva-1.7-320XenicsXEN-000105
Espectrógrafo Imspector N25ESpecim
imágenes hiperespectralesCarinthian Tech Research AGConstructor experimentalDiseño y montaje de escáner de imágenes hiperespectrales y software
Matlab R2106aMathworksIncluye cajas de herramientas para el procesamiento de imágenes, el procesamiento de señales y la estadística y el aprendizaje automático
AP4 PoromoeterDelta-T-Devices
LI-3100C Medidor de áreaLI-COR
BASF Láminas de poliestireno StyradurObi Baumarkt9706318Se pueden utilizar diferentes tipos de láminas de poliestireno u otro material que separe el suelo humedecido de manera diferente
experimentalEscáner de

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