Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.
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Artículo de método
Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9
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Resumen
Resumen
Células madre pluripotentes embrionarias e inducidas pueden uno mismo-renovar y diferenciarse en múltiples tipos de células del cuerpo. Las células pluripotentes así son codiciadas para la investigación en medicina regenerativa y actualmente en ensayos clínicos para enfermedades oculares, diabetes, enfermedades cardíacas y otros trastornos. El potencial de diferenciarse en tipos celulares especializados juntados con los recientes avances en tecnologías, incluyendo el sistema CRISPR/Cas de edición genómica han proporcionado oportunidades adicionales para adaptar el genoma de iPSC para variadas aplicaciones incluyendo las enfermedades al modelado, terapia génica y sesgar las vías de diferenciación, para nombrar unos pocos. Entre las tecnologías disponibles de la edición, el CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes ha surgido como una herramienta de elección para la edición específica del genoma eucariótico. Los CRISPRs son fácilmente accesible, barato y muy eficiente en ediciones específicas de la ingeniería. El sistema requiere una nucleasa Cas9 y una secuencia de guía (20-mer) específica para el objetivo genómico contigua a un 3-nucleotide "NGG" protospacer-adyacente-motivo (PAM) para apuntar Cas9 para el locus genómico deseado, junto con un trazador de enlace Cas9 universal (RNA juntos llamados ARN guía individual o sgRNA). Aquí presentamos un paso a paso el protocolo para la generación eficiente de iPSC alimentador independiente y libre de huella y describir metodologías para la edición del genoma de iPSC usando los complejos de Cas9 ribonucleoproteína (RNP). El genoma edición protocolo es eficaz y puede ser fácilmente multiplexado por sgRNAs pre-secuestrantes para más de un objetivo con la proteína Cas9 y entregar simultáneamente en las células. Por último, se describe un enfoque simplificado para la identificación y caracterización de iPSCs con ediciones deseadas. Tomados en conjunto, las estrategias se deben optimizar la generación y edición de iPSC para múltiples aplicaciones.
Introducción
La reprogramación de células somáticas humanas para el estado de pluripotencialidad por la sobreexpresión de factores de reprogramación ha revolucionado la investigación con células madre con aplicaciones en modelado de enfermedad, medicina regenerativa y desarrollo de medicamentos. Varios métodos de reprogramación no están disponibles para la entrega de factores de reprogramación y generar iPSCs, pero el proceso es mano de obra intensiva y no muy eficiente1. Los métodos virales, aunque eficiente, están asociados con problemas de integración de virus y tumorigenicidad2,3,
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Protocolo
1. Protocolo de reprogramación
- generación de iPSC humana de las células pancreáticas humanas primarias
- capa un pozo de 6 placa con 1,5 mg/mL de colágeno fría y déjelo gel a 37 ° C por 1 h.
- Paso temprano humanas células pancreáticas primarias en medio de la Prigrow III (~ 1-1.5 × 10 5 células) en un colágeno cubierta placa de 6 pozos en día -2 para lograr aproximadamente 2.5 × 10 5 células o al menos el 60% de la placa confluency por bien en el día de transducción de señales (día 0). Para el primer estudio, placa de pozos de al menos 2-3 para conseguir un pozo con confluencia deseado en el día 0. Util....
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Resultados
En esta publicación, hemos seguido un protocolo simple pero eficiente para la generación de iPSC de células pancreáticas humanas mediante integración o vectores de virus Sendai huella libre. Figura 1A se muestra una representación esquemática de este protocolo de reprogramación. Las células pancreáticas humanas fueron compradas comercialmente, cultivados en medio de Prigrow III y transduced con virus Sendai como se explicó anteriormente. Transduced huso en fo.......
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Discusión
Reprogramación de células somáticas humanas iPSCs ha proporcionado un gran impulso a los campos de investigación de la biología básica, medicina personalizada, enfermedades modelado, desarrollo de medicamentos y medicina regenerativa16. Muchos métodos actuales y ampliamente utilizados de generación de iPSC humano requieren el uso de virus con el riesgo de la integración en el genoma del anfitrión o episomal vectores con baja eficiencia de reprogramación. Aquí, presentamos un método eficiente para .......
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Divulgaciones
BT es un miembro fundador de renovar Biosciences Inc.
Agradecimientos
Trabajo en el laboratorio fue apoyado por beca de postdoctorado para Dr. Anjali Nandal y concesión exploración del fondo de investigación de la célula de vástago de Maryland a BT (TEDCO).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vectores virales de Sendai - CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Descongelar en hielo; S No: 1 |
| Tripsina EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0,05%, 100 ml; S No: 2 |
| Inhibidor de rocas (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Uso 10 μ M; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medio | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Reemplazo de suero (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 1X; S No: 6 | |
| Suero fetal bovino | Thermo Scientific | SH30071.03 | Alícuota; S No: 7 |
| L-glutamina (Glutamax, 100X), líquido | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140-050 | 1/100; S Nº: 9 |
| 2-Mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1.000; S No: 10 |
| Hemacitómetros Hausser | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| Solución de gelatina al 0,1% | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubar a 37º C durante 1 hora; S No: 12 |
| SSEA-4 anticuerpo | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 anticuerpo | Señalización celular | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 anticuerpo | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1.000; S No: 15 |
| Colágeno I, Rat Tail Life | Technologies | A10483-01 | Mantener frío; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescente 488/568 (anticuerpos secundarios) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2.000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| placa de cultivo de tejidos de 100 mm | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Alcance de disección | Nikon | SMZ745 | S Nº: 23 |
| Campana de recogida | NuAire | NU-301 | S Nº: 24 |
| 15 ml Tubo de centrífuga | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Tubo de centrífuga | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Piruvato de sodio | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoetanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medio | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Contador de células | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Sistema de rayos X Faxitron | CellRad | S No: 33 | |
| Accutase | Tecnologías celulares innovadoras AT-104 | S No: 34 | |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | stock de 1 mg/ml; S No: 35 |
| Dispasa | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC matrigel calificado | BD Biosciences | 354277 | Para diluir, use DMEM/F-12 frío; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Caldo 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehído | EMS | 15710 | 4% de existencias en PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S Nº: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Kit de fosfatasa alcalina | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 proteína | PNA | Bio CP01-50 | Descongelación y alícuota; S No: 44 |
| Suero de cabra o burro | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 ADN ligasa | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectina | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| Kit de clonación CloneJET | Thermo Scientific | K1232 | S Nº: 56 |
| Analizador de fragmentosTM | Advanced Analytical S | Nº: 57 | |
| mTeSR1 kit medio | STEMCELL Technologies | 5850 | Caliente a temperatura ambiente; S No: 58 |
| Medio de congelación mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Medio de congelación CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Células pancreáticas humanas | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Medio de inducción neural | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulina | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 anticuerpo | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| Anticuerpo NKX2-5 | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| Anticuerpo SOX17 | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Yoduro de propidio | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (clasificador de células) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
Referencias
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka,....
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Reimpresiones y permisos
