Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

9.8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/56260

⸱

8 de noviembre de 2017

 ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Animal Bioscience and Biotechnology Laboratory, ARS, USDA, 3NIH Stem Cell Unit, Bethesda, National Institutes of Health, 4RenOVAte Biosciences Inc

En este artículo

Resumen

Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.

Resumen

Células madre pluripotentes embrionarias e inducidas pueden uno mismo-renovar y diferenciarse en múltiples tipos de células del cuerpo. Las células pluripotentes así son codiciadas para la investigación en medicina regenerativa y actualmente en ensayos clínicos para enfermedades oculares, diabetes, enfermedades cardíacas y otros trastornos. El potencial de diferenciarse en tipos celulares especializados juntados con los recientes avances en tecnologías, incluyendo el sistema CRISPR/Cas de edición genómica han proporcionado oportunidades adicionales para adaptar el genoma de iPSC para variadas aplicaciones incluyendo las enfermedades al modelado, terapia génica y sesgar las vías de diferenciación, para nombrar unos pocos. Entre las tecnologías disponibles de la edición, el CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes ha surgido como una herramienta de elección para la edición específica del genoma eucariótico. Los CRISPRs son fácilmente accesible, barato y muy eficiente en ediciones específicas de la ingeniería. El sistema requiere una nucleasa Cas9 y una secuencia de guía (20-mer) específica para el objetivo genómico contigua a un 3-nucleotide "NGG" protospacer-adyacente-motivo (PAM) para apuntar Cas9 para el locus genómico deseado, junto con un trazador de enlace Cas9 universal (RNA juntos llamados ARN guía individual o sgRNA). Aquí presentamos un paso a paso el protocolo para la generación eficiente de iPSC alimentador independiente y libre de huella y describir metodologías para la edición del genoma de iPSC usando los complejos de Cas9 ribonucleoproteína (RNP). El genoma edición protocolo es eficaz y puede ser fácilmente multiplexado por sgRNAs pre-secuestrantes para más de un objetivo con la proteína Cas9 y entregar simultáneamente en las células. Por último, se describe un enfoque simplificado para la identificación y caracterización de iPSCs con ediciones deseadas. Tomados en conjunto, las estrategias se deben optimizar la generación y edición de iPSC para múltiples aplicaciones.

Introducción

La reprogramación de células somáticas humanas para el estado de pluripotencialidad por la sobreexpresión de factores de reprogramación ha revolucionado la investigación con células madre con aplicaciones en modelado de enfermedad, medicina regenerativa y desarrollo de medicamentos. Varios métodos de reprogramación no están disponibles para la entrega de factores de reprogramación y generar iPSCs, pero el proceso es mano de obra intensiva y no muy eficiente1. Los métodos virales, aunque eficiente, están asociados con problemas de integración de virus y tumorigenicidad2,3,4. En este manuscrito, Divulgamos el uso de virus Sendai citoplásmico entrega factores y establecer líneas de huella libre iPSC que carecen de integración de cualquier secuencia de vectores virales en sus genomas5. El virus Sendai es un virus ARN que se diluye de pasajes de la célula citoplasma ~ 10 después de la infección y produce factores de reprogramación en abundancia, llevando a la rápida y eficaz reprogramación6,7. IPSCs establecido puede ser transición fácilmente al medio sin alimentador para evitar el uso de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) como células de alimentador8.

En esta publicación, además de que el virus de Sendai mediada por reprogramación, también Describimos un protocolo mejorado para la edición de iPSCs, que tiene el potencial para suministrar células humanas ilimitadas con modificaciones genéticas deseadas para la investigación. Hemos utilizado tecnología CRISPR/Cas9 para la modificación de iPSCs, que ahora está siendo usada para una amplia gama de aplicaciones incluyendo knock-ins y nocauts, deleciones genómicas a gran escala, combinado biblioteca de descubrimiento de genes, ingeniería genética de numerosos organismos modelo y gene terapia9,10,11. Esta técnica consiste en la formación de complejos de Streptococcus pyogenes-derivadas Cas9 nucleasa y 20-mer guía RNAs que logran el reconocimiento de destino a través de bases con secuencia de genomic destino junto a 3' nucleótido protospacer adyacente secuencia de adorno (PAM). La nucleasa Cas9 induce un nucleótidos rotura trenzado doble ~ 3 desde el sitio de PAM, que es posteriormente reparado predominante por no homóloga se terminan uniendo vía (NHEJ) a inserciones o deleciones en el marco de lectura abierto y lo funcional Knockout de genes12.

Nuestro protocolo mejorado incluye los detalles para el cultivo de las células pancreáticas humanas, su reprogramación en mitotically inactivado fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) para lograr una mayor eficiencia de reprogramación, la posterior adaptación a la cultura libre de alimentador sobre Matrigel, caracterización de iPSCs establecida, guiada por CRISPR RNA diseño y preparación, entrega en iPSCs como complejos de RNP, única célula clasificación para generar líneas clonales de iPSCs editado, fácil detección e identificación de ediciones y caracterización de clones de la célula. Deleciones genómicas eficientemente se obtuvieron en este estudio por la introducción de la proteína Cas9 y dos complejos CRISPR sgRNA RNP para inducir roturas trenzados doble (distritales) y supresión de la intervención del segmento. Este método capitaliza el uso de dos guías para generar deleciones en el marco de lectura abierto, alta eficiencia de NHEJ a bajo número de clones necesidad de ser caracterizado y fácil proyección preliminar de clones por el capilar automatizado unidad de electroforesis, analizador de fragmento. Estos genoma eficaz edición de métodos para generar modelos de enfermedades humanas basadas en células madre se convertirá pronto en un enfoque estándar y de rutina en cualquier laboratorio de células madre. Finalmente, la edición del genoma exacto hará posible ir más allá de los modelos de enfermedad de célula de vástago y potencialmente podría ayudar a catalizar las terapias basadas en células.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Protocolo de reprogramación

  1. generación de iPSC humana de las células pancreáticas humanas primarias
    1. capa un pozo de 6 placa con 1,5 mg/mL de colágeno fría y déjelo gel a 37 ° C por 1 h.
    2. Paso temprano humanas células pancreáticas primarias en medio de la Prigrow III (~ 1-1.5 × 10 5 células) en un colágeno cubierta placa de 6 pozos en día -2 para lograr aproximadamente 2.5 × 10 5 células o al menos el 60% de la placa confluency por bien en el día de transducción de señales (día 0). Para el primer estudio, placa de pozos de al menos 2-3 para conseguir un pozo con confluencia deseado en el día 0. Utilizar al menos un pozo como un control para contar las células.
    3. En el día de transducción (día 0), calentar 1 mL de medio de Prigrow III en un baño de agua de cada pozo para ser transduced. Cosechar las células de un control bien en 1 mL de 10% FBS medio usando 1 mL de tripsina/EDTA por 5 min o hasta que suelte las células para realizar un conteo de células. Para hacer medio de 10% FBS, agregar DMEM, 10% FBS, 1% glutamina, 1% piruvato de sodio 1% no esenciales aminoácidos y.
    4. Cuenta y comprobar la viabilidad de las células usando el contador de célula y calcular el volumen de cada virus necesita para alcanzar el objetivo basado en la titulación de virus y número de celular. Utilizar multiplicidad de infección (MOI) de KOS = 5, hc-Myc = 5 y hKlf4 = 3 para las células pancreáticas.
    5. Un sistema de deshielo de Sendai vector tubos de almacenamiento de-80 ° C en hielo y agregue cuidadosamente el volumen calculado de cada uno de los tres tubos de vector de Sendai a 1 mL de Prigrow III medio, previamente calentado a 37 ° C. pipeta suavemente para mezclar la solución. Bien en una placa de 6 pozos basta transducing con vectores virales Sendai para generar células reprogramadas.
    6. Aspirar el medio de Prigrow III de las células y poco a poco agregue la mezcla de virus reprograma a los pozos que contienen las células. Incube las células durante la noche en una incubadora de 37 ° C con un ambiente humidificado de 5% CO 2.
    7. Cuidadosamente deseche la mezcla de virus en las células y reemplazar con medio fresco de Prigrow III al día siguiente, 24 horas después de la transducción de señales. Las células de 5 d de la cultura y cambiar el medio cada día alterno.
    8. El día 5, preparar MEFs 0.1% gelatina cubierto primero 10 cm cultura platos (1.3 x 10 6 células/plato). Crecer MEFs T175 los matraces hasta el día 4 y luego el día 5, exponer las células a 6.000 rads de una fuente de radiación γ antes de sembrar las células 13 o uso la fuente MEF comercial.
    9. El día 6, utilizar 1 mL de solución de separación celular por 10 min para separar las células transduced, todos ellos platos de MEF en medio Prigrow III placa con inhibidor de la roca (bolsa de 5 m m, final 10 μm) e incubar durante una noche en una incubadora de 37 ° C con una atmósfera humidificada re de 5% CO 2.
    10. Cambiar el medio de Prigrow III a hESCs medio al día siguiente. Para hacer 500 mL de medio de hESC, agregar DMEM/F-12, reemplazo de suero de nocaut de 20% (v/v) (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 mM l-glutamina; Los aminoácidos no esenciales de 100 μm y 100 μm 2-Mercaptoetanol. Cambiar el medio suavemente cada día ahora.
    11. Observar las placas regularmente para la aparición de grupos de células o colonias de células reprogramadas. Las células transformadas forman agregados clonales con morfología de adoquines y gran núcleo y los nucleolos. Marca el probable ' iPSC ' colonias y revisa regularmente para el crecimiento.
    12. Casi cuatro semanas después de la transducción como colonias están listas para la cosecha o transferencia, preparar placas de 24 pocillos MEF 1.3 placa prelacado de 10 6 células/gelatina de la galjanoplastia como antes para la transferencia de colonias solo.
      1. Prepare la membrana (e.g., Matrigel) matriz por tomar basado en el factor de dilución en el certificado de análisis. Añadir una alícuota de 25 mL de DMEM/F-12 y capa cuatro 6 placas (1 mL/pocillo) e incube a temperatura ambiente (RT) durante al menos 1 h antes de su uso. Escoger manualmente 12-24 colonias utilizando una pipeta estéril para aspirarlos y transferir a las placas MEF en 500 μl de medio de hESCs.
      2. Aspire los medios de comunicación en el pozo suavemente alteran o rompen las colonias. También toma 24 a 48 colonias en placas de 24 pocillos matriz recubierta de membrana. Para las placas de membrana recubierta, utilice mTeSR1 (complementado con inhibidor de roca de 10 μm) por 24 h y cambiar todos los días. Dentro de 6-10 d de escoger colonias, está listos para ser transferido a las placas de 24 pocillos o bien 12 membrana nueva para la expansión clonal.
    13. Si es necesario, separar las colonias en MEFs con colagenasa 1 mg/mL por 20 min, lavado dos veces con células/mTeSR1 y transferencia a membrana de cubierta placas de 12 o 24 pocillos. Si hay suficientes colonias robustas crecimiento en la membrana de la matriz de paso 1.1.12, congelación de las colonias en MEFs con iPSC congelación medios según el fabricante ' pautas de s.
    14. Separar las colonias robustas sobre la membrana en el paso 1.1.12 con 500 μl del dispase por 20 min y placa otra vez en la membrana de la matriz recubiertos de placas de 12 pocillos. Manualmente raspe cualquier células diferenciadas o contaminantes células de alimentador MEF para enriquecer para clones de pluripotent en la membrana de.
    15. Ampliar los clones después de 6-8 d por cultivo sobre membrana cubierta placas saldándose con una solución de dispase como antes y agregados de células pequeñas en membrana del fresca de la galjanoplastia había revestida placa de 6 o 12 pocillos. Medio de mTeSR1 de cambio diariamente. Caracterizar los clones reprogramados por tinción, immunostaining para la pluripotencia marcadores (OCT3/4 y NANOG), FACS análisis de marcadores de superficie de pluripotent y ensayos de diferenciación de la fosfatasa alcalina. Crecer y los clones en placas recubiertas de membrana para todos los ensayos incluidos CRISPR edición como se explicó anteriormente, a menos que se mencione otra solución de recubrimiento de la cultura.
  2. Caracterización de humanos iPSCs
    1. tinción de fosfatasa alcalina
      Nota: aquí se utiliza un kit comercial. Consulte la tabla de materiales.
      1. Placa iPSCs putativo humano en placa de 24 pozos y cultura para 4-5 d con el cambio de los medios de comunicación diario.
      2. Para iniciar el protocolo de tinción, aspirar el medio de cultivo y lavan las células con 1 mL de PBS 1 x con 0,05% Tween 20 (SAFT).
      3. Añadir 0,5 mL de solución de arreglo en el kit de las células e incubar a temperatura ambiente durante 2 a 5 min aspirar la solución de fix y lavar las células fijas con SAFT. No permita que los pocillos se sequen.
      4. Añadir 0,5 mL de solución recién preparada de sustrato AP por bien mezclando la solución A, B y C. Incubar las células en la oscuridad (envuelto con papel de aluminio o en un recipiente oscuro) a temperatura ambiente durante 5 a 15 min
        Nota: Cerca supervisar el cambio de color y detener la reacción cuando el color se vuelve brillante para evitar la tinción inespecífica.
      5. Detener la reacción aspirando la solución substrato con AP y lavar los pocillos dos veces con 2 mL de PBS 1 x.
      6. Observar las colonias al microscopio y capturar las imágenes en 4 X o 10 aumentos con cualquier microscopio de campo brillante con una cámara de.
    2. Immunostaining
      1. placa iPSCs humano en placa de 24 pozos y cultura para 4-5 d con el cambio de los medios de comunicación diario.
      2. Lavar las células una vez brevemente con PBS y revisión por 20 min con paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS.
      3. Lavado tres veces por 10 min (3 x, 10 min) con PBS a TA.
      4. Saturar los sitios inespecíficos con 10% cabra o burro de suero normal (NS, dependiendo del anticuerpo secundario animal se crió en) en PBS durante 40 min a TA. Para sólo epítopos intracelulares, incluyen 0.3% TX-100 en PBS (TX/PBS) a permeabilizar.
      5. Lavar 3 veces, 5 minutos con PBS a TA.
      6. Diluir los anticuerpos OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 y SOX17 en una solución fresca de 5% NS en PBS e incubar por 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
      7. Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS a TA.
      8. Diluir apropiado secundaria Alexa Fluor 488 o 568 anticuerpos en 5% NS/PBS e incubar células por 1 h a RT.
      9. Lavar 3 veces durante 5 min a TA.
      10. Incubar con DAPI en PBS 10 min y lavado 2 x durante 5 minutos a RT. uso un microscopio de fluorescencia para tomar fotos.
    3. Activado por fluorescencia de la célula clasificación (FACS)
      1. placa iPSCs humanas en una placa de 6 pozos y cultura hasta las colonias se convierten en 80% confluente (por lo menos 10 5 células /sample) con cambio medio diario de mTeSR1.
      2. En el día del experimento, aislar las células y disociar a una suspensión unicelular como se explicó anteriormente en el protocolo. Lavar con medio de 10% FBS.
      3. De marcadores de superficie, resuspender en 0.5-1 mL de 10% FBS medio y mantener en hielo.
      4. De marcadores intracelulares, resuspender en 1 mL de 4% PFA/PBS e incubar 10 min a temperatura ambiente. Lavar con medio de 10% FBS. Resuspender en 0.1% TX/PBS e incubar por 15 min en hielo. Lavar nuevamente con medio de 10% FBS. Resuspender en 0.5-1 mL de 10% FBS medio y mantener en hielo.
      5. Añadir 50 μl de la suspensión celular en 50 μl de medio conteniendo de 10% FBS recomendado cantidad de TRA-1-60, TRA-1-81 o SSEA-4 anticuerpos e incubar por 30 min a 1 h.
      6. Lavar dos veces con 10% FBS.
      7. Resuspender en 100 μl de 10% medio FBS que contiene anticuerpos secundarios fluorescentes e incubar durante 30 min lavado dos veces con 10% FBS y resuspender en volumen apropiado del 10% FBS. Las células vivas se pueden distinguir de las células muertas por tinte de yoduro de propidio en < 1 μg/mL para estimar la apoptosis de las células durante el proceso de.
    4. Tri-linaje diferenciación
      1. de semilla de dos placas de 6 pocillos con 1.5-2 x 10 6 iPSCs/pozo en medio de mTeSR1 con inhibidor de roca de 10 μm.
      2. Permite a las células a crecer de 2-3 d con diario mTeSR1 cambio medio hasta que los pozos son 80-90% confluente.
      3. Para la inducción de ectodermo, añadir medio de inducción neural (NIM) según el fabricante ' instrucciones en 2-3 pocillos de las placas de 6 pozos.
      4. Cambiar el Medio RPMI conteniendo 2% B27 suplemento menos insulina y 12 μm CHIR99021 para la inducción del mesodermo en 2-3 pozos de placas 14. Agregar solamente RPMI conteniendo 2% B27 suplemento menos insulina para el próximo 24 h. Añadir 5 μm IWP4 al Medio RPMI con un 2% B27 suplemento menos insulina para las próximas 24 horas. Después de 72 h, sustituir los medios de comunicación con RPMI conteniendo 2% B27 suplemento conduce a la generación de vencer a cardiomiocitos en 2-3 d.
      5. Para la inducción del endodermo, cambiar el medio en los pocillos de las placas de 6 pozos para MCDB 131 complementado con bicarbonato de sodio 1,5 g/L, 1 x Glutamax glucosa 10 mM, 0,5% BSA, 100 ng/mL GDF8 y 5μm de CHIR99021 de cultura en el mismo medio sin CHIR99021 de 24 h. para 2-3 d 15.
      6. Seguir el protocolo de immunostaining del paso 2 para los tres linajes y busque la expresión de marcadores relevantes.

2. IPSC edición de humano genoma usando CRISPR-Cas9

  1. sgRNA y preparación de Cas9 proteína
    1. proteína Cas9 alícuotas en tubos de microcentrífuga en condiciones estériles y almacenar las alícuotas por congelamiento de los tubos a -80 ° C.
    2. Diseño dos objetivo guía RNAs por gene basadas en el software del MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) o cualquier webtool de diseño otros guía CRISPR. Objetivo primer o segundo exón del gene (basado en el marco de lectura abierto) para generar agujeros ciegos. Elegir los dos guías que cortaron juntas (~ 30-100 bp aparte) y fácilmente podemos visualizar la eliminación mediante el mismo conjunto de iniciadores de detección. Elegir a las guías de la salida del software sobre la base de puntuación de mayor calidad y menor número de sitios objetivo. Diseño de cartillas de proyección mediante la explosión de la cartilla del programa (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Cartillas de detección debe ser al menos 100 bp de la Cas9 corta páginas y el tamaño del producto PCR debe ser preferiblemente entre 400-700 bp para más fácil amplificación por PCR.
    3. Diseño el oligo sgRNA complementaria dos DNAs (19-22 nucleótidos de longitud dependiendo de la secuencia de la guía) con un Bsa1 cortar sitio en cada extremo. El oligo DNAs puede ser sintetizada comercialmente y recocido para formar DNA de doble cadena. Para recocido, añadir 1 μl de 100 μm guías, 25 μl de buffer (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) de recocido y 23 μl de agua. Incubar en un termociclador programado para iniciar a 95 ° C durante 2 minutos y luego gradualmente de refrigeración a 25 ° C durante 45 min
    4. Clon 2 μl del fragmento resultante en una enzima de restricción Bsa1 digerido 1 μl de vector de pCR2.1 de promotor de T7 interno con un sitio de unión de Cas9 con T4 ADN ligasa según el fabricante ' Protocolo s.
    5. La secuencia de los fragmentos de ADN clonados y cuando se establezca la fidelidad, en vitro transcribir los clones usando un kit de T7 para generar solo guía RNAs. Purificar el sgRNAs con un kit comercial y eluir en agua libre de ARNasa. Compruebe la concentración de RNA.
  2. Transfección de hiPSCs
    1. hiPSCs en medio mTeSR1 de la cultura como se describe anteriormente hasta que las células son confluentes de 40-50%.
    2. Dos horas antes nucleofection, sustituir el medio con 2 mL de medio de mTeSR1 precalentado con inhibidor de roca de 10 μm.
    3. Una hora más tarde, preparar pozos de destino para las células nucleofected por membrana aspiración, preparado como el anterior, de placa de 12 pozos y sustitución con precalentado 1 mL de medio de mTeSR1 con inhibidor de roca de 10 μm. Mantenga a 37 ° C para la incubación de.
      4. Suplemento de
    4. Prepare nucleofection master mix (escala apropiadamente según las muestras) para cada muestra por adición 16.4 μL de P3 primaria celular; 3.6 μl de 1 suplemento del kit de nucleofector, 0.5 μg de proteína Cas9 y 0,5 μg de cada sgRNA en 22 μL volumen de reacción. vector de pMAX GFP también fue nucleofected según el fabricante ' recomendaciones de s en las células más o menos estimar la eficiencia de la transfección iPSC.
    5. Lave cada uno con 2 mL de PBS de RT después de aspirar el medio que contiene el inhibidor de la roca de los pozos de iPSC. Luego aspirar PBS, añadir 1 mL de solución de separación celular e incubar la placa a 37 ° C durante 10 minutos
    6. Resuspender las células en 3 mL de medio de mTeSR1 y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para generar una suspensión unicelular. Células de transferencia disociada a una centrífuga de 15 mL del tubo que contiene medio de mTeSR1 de 5 mL.
    7. Contar las células con el contador de célula y calcular el volumen total requerido de 0.5 x 10 6 células/transfección. Coloque la cantidad deseada de las células en el tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugar a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar sobrenadante.
    8. Resuspender cada unidad de 0.5 x 10 6 células en 22 μL de la mezcla principal de transfección preparada en el paso 4. Transferir rápidamente las células en la cámara central de un pozo de una tira de nucleocuvette. Coloque la tira en un nucleofector necesario y nucleofect las células mediante programa CB150.
    9. Después nucleofection, agregar rápidamente 80 μl de medio mTESR1 precalentado con inhibidor de roca de 10 μm en cada pocillo de las células nucleofected. Suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
    10. Transferir suavemente las células de la tira a los pocillos de la placa de 12 pozos prelacado membrana, que contiene medio de mTeSR1 con inhibidor de la roca preparada en el paso 3.
    11. Después de 1 d, cambie a medio fresco mTeSR1 sin inhibidor de la roca. Cosecha de células 2-3 d después nucleofection sola célula clasificación.
  3. Sola celda aislamiento de hiPSCs específicos
    1. un día antes de la clasificación, preparación de placas de 96 pocillos MEF por la siembra de 2 x 10 6 células/gelatina-placas cubiertas de en medio de 10% FBS. Aproximadamente el 70-80% de los clones sobrevivir después nucleofection y 2-3 placas MEF se pueden preparar para cada experimento edición.
    2. Después de la incubación durante la noche, cambiar el medio a medio de hESCs (como se describe anteriormente) suplementado con 100 ng /bFGF mL, 1 x SMC4 (inhibidores de añadido a los medios de comunicación para mejorar la viabilidad de la célula) y 5 mg/mL fibronectina para promover adherencia.
    3. Reemplazar el medio en el hiPSCs en la placa de la pozo 12 de mTeSR1 a mTeSR1 suplementado con 1 x SMC4 durante al menos 2 h antes de la única célula clasificación.
    4. Aspirar el medio de hiPSCs y lavar las células con PBS. Añadir 500 μl de solución de la separación de células en cada pozo e incubar a 37 ° C durante 10 min después de la aspiración del PBS. Generar la suspensión unicelular agregando 1 mL de mTeSR1 (sin suplemento) a cada pocillo y pipeteo arriba y abajo suavemente varias veces.
    5. Suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 200 x g a RT. aspirar sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de mTeSR1.
    6. Clasificar las células en las células usando un clasificador de células con boquilla de 100 mm en condiciones estériles con una celda en el pozo individual de las placas de 96 pocillos preparadas en el paso 1.
    7. Cuatro días después de su clasificación, formación de la Colonia debe ser evidente; reemplazar en este momento el medio de cultivo con hESC suplementado con 1 x SMC4.
    8. Ocho días después de su clasificación, sustituir medio con células medio y cultura 2 d.
    9. Separar las colonias mediante colagenasa 1 mg/mL por 20 min y transfiere a placas de 24 pocillos membrana revestida en mTeSR1 con inhibidor de la roca. Que los clones de unicelulares crecen y extraer su ADN genómico después de duplicar o expandirlos. Uso de iniciadores específicos gene para amplificar el ADN mediante PCR Diana.
    10. Kit de analizador de fragmento de uso para la detección inicial de la región genómica de PCR amplificado destino de todos los clones mediante la ejecución a través del gel/tinte mezcla según el fabricante ' instrucciones. Estimar el tamaño de fragmento resultante en el software PROSize comparando con la escala apropiada, que se ejecuta con las muestras. De secuencia esperado ' editado ' clones y analizar datos de secuenciación para confirmar la edición o canceladuras.
    11. Para diferenciar clones monoallelic y biallelic, amplificar la secuencia editada con PCR y clonado en el vector de pJET1.2. Enviar por lo menos 8-10 clones para secuenciación y comprobamos si la secuencia para confirmar la edición en uno o ambos alelos.
    12. Una vez se han identificado clones de iPSC con éxito dirigidas mediante genotipificación, examinar para confirmar que no han perdido la pluripotencia o ganado anormalidades cromosómicas a través del proceso.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

En esta publicación, hemos seguido un protocolo simple pero eficiente para la generación de iPSC de células pancreáticas humanas mediante integración o vectores de virus Sendai huella libre. Figura 1A se muestra una representación esquemática de este protocolo de reprogramación. Las células pancreáticas humanas fueron compradas comercialmente, cultivados en medio de Prigrow III y transduced con virus Sendai como se explicó anteriormente. Transduced huso en fo...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Reprogramación de células somáticas humanas iPSCs ha proporcionado un gran impulso a los campos de investigación de la biología básica, medicina personalizada, enfermedades modelado, desarrollo de medicamentos y medicina regenerativa16. Muchos métodos actuales y ampliamente utilizados de generación de iPSC humano requieren el uso de virus con el riesgo de la integración en el genoma del anfitrión o episomal vectores con baja eficiencia de reprogramación. Aquí, presentamos un método eficiente para ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

BT es un miembro fundador de renovar Biosciences Inc.

Agradecimientos

Trabajo en el laboratorio fue apoyado por beca de postdoctorado para Dr. Anjali Nandal y concesión exploración del fondo de investigación de la célula de vástago de Maryland a BT (TEDCO).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vectores virales de Sendai - CytoTune-iPS 2.0 KitInvitrogenA16517Descongelar en hielo; S No: 1
Tripsina EDTAGibco Life Tech25300-0540,05%, 100 ml; S No: 2
Inhibidor de rocas (Y-27632)MiliporeSCM075Uso 10 μ M; S No: 3
DMEM/F-12 medioInvitrogen11330-032S No: 4
Reemplazo de suero (KSR)Gibco10828028S No: 5
DMEMInvitrogen11960069 1X; S No: 6
Suero fetal bovinoThermo ScientificSH30071.03Alícuota; S No: 7
L-glutamina (Glutamax, 100X), líquidoThermo Scientific350500611/100; S No: 8
aminoácidos no esencialesGibco11140-0501/100; S Nº: 9
2-MercaptoetanolGibco2198502355 mM, 1/1.000; S No: 10
Hemacitómetros HausserHausser Scientific02-671-54S No: 11
Solución de gelatina al 0,1%STEMCELL Technologies7903Incubar a 37º C durante 1 hora; S No: 12
SSEA-4 anticuerpoSantacruzsc-217041/100; S No: 13
TRA-1-81 anticuerpoSeñalización celular4745S1/200; S No: 14
OCT4 anticuerpoSanta Cruzsc-52791/1.000; S No: 15
Colágeno I, Rat Tail LifeTechnologiesA10483-01Mantener frío; S No: 16
Alexa Fluor fluorescente 488/568 (anticuerpos secundarios)InvitrogenA21202/A100421/2.000; S No: 17
DPBSHycloneSH30028LS1X; S No: 18
placa de cultivo de tejidos de 100 mmFalcon353003S No: 20
placa de cultivo de tejidos de 96 pocillosFalcon353078S No: 21
placa de cultivo de tejidos de 6 pocillosFalcon353046S No: 22
Alcance de disección NikonSMZ745S Nº: 23
Campana de recogidaNuAireNU-301S Nº: 24
15  ml Tubo de centrífugaGreiner Bio-One188271S No: 25
50  ml Tubo de centrífugaGreiner Bio-One227261S No: 26
Piruvato de sodioInvitrogen11360S No: 28
β-mercaptoetanolSigmaM7522S No: 29
Prigrow III medioABMTM003S No: 31
Countess™ Contador de célulasInvitrogenC10227S No: 32
Sistema de rayos X FaxitronCellRadS No: 33
AccutaseTecnologías celulares innovadoras AT-104S No: 34
CollagenaseLife Technologies17104019stock de 1 mg/ml; S No: 35
DispasaSTEMCELL Technologies7923S No: 36
hESC matrigel calificadoBD Biosciences354277Para diluir, use DMEM/F-12 frío; S No: 37
bFGFR & D233-FBCaldo 10 ug/ml; S No: 38
ParaformaldehídoEMS157104% de existencias en PBS; S No: 39
TRA-1-60Santa Cruzsc-217051/100; S Nº: 40
NANOGReproCELLRCAB0004P-F1/100; S No: 41
Tween 20SigmaP9416-100MLS No: 42
Kit de fosfatasa alcalinaStemgent00-0055S No: 43
Cas9 proteínaPNABio CP01-50Descongelación y alícuota; S No: 44
Suero de cabra o burroSigmaD9663/G9023S No: 45
Triton X-100SigmaX100-100MLS No: 46
DAPIThermo ScientificD1306S No: 47
TrisSigma9285-100MLS No: 48
NaCLSigmaS7653-250GS No: 49
EDTASigmaBP2482-500S No: 50
T4 ADN ligasaNEBM0202TS No: 51
Mega Shortscript T7 kitThermo ScientificAM1354S No: 52
Mega Clear kitThermo ScientificAM1908S No: 53
SMC4BD Biosciences354357S No: 54
FibronectinaSTEMCELL Technologies7159S No: 55
Kit de clonación CloneJETThermo ScientificK1232S Nº: 56
Analizador de fragmentosTMAdvanced Analytical SNº: 57
mTeSR1 kit medioSTEMCELL Technologies5850Caliente a temperatura ambiente; S No: 58
Medio de congelación mFreSR™STEMCELL Technologies5855S No: 59
Medio de congelación CryoStor®STEMCELL Technologies7930S No: 60
MEFsGlobalstemGSC-6301GS No: 61
L-glutaminaInvitrogen25030081S No: 62
Células pancreáticas humanasABMT0159S No: 63
STEMdiff™ Medio de inducción neuralStemcell Technologies5835S No: 64
RPMIThermofisher11875-093S No: 65
2% B27-insulinaThermofisherA1895601S No: 66
CHIR99021Stemcell Technologies72052S No: 67
IWP4Stemcell Technologies72552S No: 68
2% B27Thermofisher17504044S No: 69
MCDB 131Life Technologies10372019S No: 70
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS8761-100MLS No: 71
GlucosaSigma-AldrichG8270-100GS No: 72
BSAProliant68700S No: 73
GDF8Pepro-Tech120-00S No: 74
TUJ1 anticuerpoEMD MiliporeAB9354S No: 75
Anticuerpo NKX2-5Santa CruzSc-14033S No: 76
Anticuerpo SOX17R & D systemsAF1924S No: 77
Yoduro de propidioThermo ScientificP3566S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™LonzaAAF-1002S No: 79
FACSAria II (clasificador de células)BD biosciencesSORP UVS No: 80

Referencias

  1. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
  5. Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612(2012).
  6. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
  7. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594(2014).
  9. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
  10. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559(2017).
  11. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
  12. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
  13. McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
  15. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
  16. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
  17. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
  18. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

RNP de CRISPR Cas9Protocolo de edici n gen micaiPSC sin huellasM todo de nucleofecci nClasificaci n de c lulas nicasTinci n de fosfatasa alcalinaAn lisis de inmunofluorescenciaKit de analizador de fragmentos
Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.