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Construcción y evaluación de un modelo murino Osteolysis Calvarial por exposición a partículas de CoCrMo en aflojamiento aséptico

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DOI:

10.3791/56276

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17 de febrero de 2018

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1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

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En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un modelo murino osteolysis calvarial por exposición a partículas de CoCrMo, que constituye un modelo animal ideal para la evaluación de las interacciones entre las partículas de desgaste y diversas células en aflojamiento aséptico.

Resumen

Osteólisis inducida por partículas de desgaste es una de las principales causas del aflojamiento aséptico en el fracaso de la artroplastia, pero el mecanismo subyacente es incierto. Debido al largo seguimiento necesarios para detección y ocurrencia esporádica, es difícil evaluar la osteólisis inducida por el ofparticle de patogenesia en casos clínicos. Por lo tanto, modelos animales óptimos se requieren estudios adicionales. El modelo murino de osteólisis calvarial establecido por la exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta eficaz y válida para evaluar las interacciones entre las partículas y diversas células en aflojamiento aséptico. En este modelo, las partículas de CoCrMo primero fueron obtenidas por alto vacío de tres electrodos corriente y resuspendió en solución salina con tampón fosfato a una concentración de 50 mg/mL. Entonces, 50 μl de la suspensión resultante se aplicó a la mitad de la calvaria murino después de la separación del periostio craneal por agudo disección. Después de dos semanas, los ratones fueron sacrificados y se cosecharon muestras de la calvaria; se realizaron evaluaciones cualitativas y cuantitativas por hematoxilina y eosina y micro tomografía computada. Los puntos fuertes de este modelo incluyen simplicidad de procedimiento, evaluación cuantitativa de la pérdida de masa ósea, rapidez de desarrollo de osteólisis, uso potencial transgénico o knockout modelos y un costo relativamente bajo. Sin embargo, este modelo no puede utilizarse para evaluar la fuerza mecánica y efectos crónicos de las partículas en aflojamiento aséptico. Modelo murino osteolysis calvarial generado por la exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta ideal para evaluar las interacciones entre las partículas de desgaste y varias células, por ejemplo, los macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos, en aflojamiento aséptico.

Introducción

Aflojamiento aséptico es la causa más común de artroplastia total de cadera (THA) y fracaso de la artroplastia (TKA) total de la rodilla, que requiere de cirugía de revisión1. Sin embargo, el mecanismo subyacente permanece claro2. Una carta recordativa larga es necesaria para detectar la osteólisis inducida por partículas cuya ocurrencia es rara; por lo tanto, es un reto a explorar su patogenesia en casos clínicos. Por lo tanto, estudios más centrados en mecanismos celulares y tejidos complejos requieren que ambos experimentos en vivo en usan modelos de la osteólisis inducida por partículas y en vitro ensayos en células relacionadas con la homeostasis3del hueso. Un modelo animal válido es importante en revelar los efectos de las partículas de desgaste en la pérdida ósea, proporcionando la evidencia para otros ensayos celulares.

Un modelo murino osteolysis calvarial construido por exposición a partículas de CoCrMo es un método efectivo y válido para evaluar las interacciones entre las partículas y diversas células en aflojamiento aséptico. En este modelo, partículas de CoCrMo causan osteólisis calvarial induciendo citoquinas inflamatorias en macrófagos, activación de osteoclastos, inhibiendo la proliferación de osteoblastos, y promover la apoptosis de osteoblastos.

Sólo se tarda dos semanas para establecer este modelo. Osteólisis puede ser visualizada y cuantificada por hematoxilina y eosina (H & E) coloración y micro computarizada de tomografía (micro-CT)2. Además, este modelo tiene un ratón de relativamente bajo costo y transgénico y knockout modelos pueden utilizarse para un gran número de compuestos en diversas dosis3.

El procedimiento para establecer y evaluar este modelo es simple. En primer lugar, las partículas de CoCrMo fueron obtenidas por alto vacío de tres electrodos corriente y resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 50 mg/mL. Entonces, 50 μl de la suspensión resultante se aplicó a la mitad de la calvaria murino después de la separación del periostio craneal por agudo disección. Los ratones fueron sacrificados después de dos semanas, y se cosecharon muestras de la calvaria; se realizaron análisis cualitativos y cuantitativos por H & E tinción andmicro-CT.

Un modelo murino osteolysis calvarial construido por exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta ideal para evaluar las interacciones entre las partículas de CoCrMo y varias células, como macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos, en aflojamiento aséptico.

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Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Nanjing.

1. preparación de la partícula CoCrMo

  1. Obtener partículas de CoCrMo mediante alto vacío fabricadas tres electrodos corriente4. Aleación de CoCrMo lugar en el instrumento bajo 10-3 Pa vacío, 0,04 MPa argón y 3:2 (v/v) de hidrógeno y 650 A cátodo actuales.
  2. Medir los diámetros de las partículas de CoCrMo.
    1. Añadir 1 mg de CoCrMo partículas en 1,5 mL de etanol anhidro.
    2. Resuspender las partículas CoCrMo en etanol anhidro por agitación ultrasónica a 28 kHz y 600 W durante 5 minutos.
    3. Aplicar una gota (aproximadamente 20 μl) de la suspensión resultante de la tabla objetivo de microscopio electrónico de transmisión (TEM). Serie de fotos TEM en el voltaje de aceleración de 200 kV y 0,24 nm resolución de captura.
    4. Utilice el software suministrado para calcular la distribución tamaño medio diámetro y partícula en micrografías TEM.
  3. Descontaminación de endotoxinas
    1. Autoclave de 50 g de partículas durante 15 min a 121 ° C y 15 psi.
    2. Detectar endotoxinas por un análisis cuantitativo de amebocitos de Limulus Lysate (LAL) (< 0,25% consideró indican ausencia de endotoxina UE/mL)5.
  4. Resuspender las partículas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 50 mg/mL solución stock6.

2. construcción del modelo Calvarial Osteolysis

  1. Anestesiar el 6 semana de edad C57BL/J6 (seis ratones por grupo) withpentobarbital (50 mg/kg). Utilice la prueba del pellizco para evaluar el nivel de anestesia. Prevenir la resequedad de los ojos con solución salina normal.
  2. Lugar de ratones en la posición propensa. Quitar la piel sobre el cráneo con una afeitadora y desinfectar la piel utilizando las bolas de algodón médico que contiene el etanol del 75%.
  3. Para el punto de localización, identificar dos puntos, incluyendo los puntos medios entre los dos ojos y las orejas, respectivamente. Luego, determinar la línea entre los dos más puntos y haga una incisión en la piel a lo largo de la línea de arriba con unas tijeras (figura 1A).
  4. Retire el periostio craneal del calvaria con un bisturí (figura 1B)6.
  5. Piel en ambos extremos de la sutura con sutura interrumpida simple.
  6. Hacer una línea de sutura a través del centro de la incisión sin anudar. Sujete los dos extremos de la línea de sutura.
  7. Incorporar 50 μl de suspensión de partículas de CoCrMo (50 mg/mL en PBS) en medio de la calvarias (figura 1)2.
  8. Nudo la última puntada de la sutura interrumpida simple (figura 1).
  9. Mantener los ratones durante otras 2 semanas.

3. evaluación del modelo de osteólisis Calvarial por la exploración Micro-CT

  1. Sacrificar a los ratones con dióxido de carbono. Decapita a los ratones en el plano horizontal. Retire el tejido cerebral dentro y la piel y la piel exterior. La cosecha la calvarias para experimentos adicionales.
  2. Aclarar suavemente todo el tejido suave en el calvaria con pinzas. Fijar el calvarias despejado en paraformaldehído al 4% a 4 ° C por 24 h. sumergir calvarias en PBS 24 h antes de la exploración micro-CT.
  3. Analizar la calvarias ratones mediante micro-CT en alta resolución en una resolución isométrica de 18 μm y la configuración de energía de rayos x de 45 kV y 550 mA.
  4. Llevar a cabo la reconstrucción tridimensional de los datos con el software micro-CT.
  5. Análisis cuantitativo y cualitativo.
    1. En primer lugar, seleccione la región cuadrada alrededor de la sutura de la línea media como la región de interés.
    2. En segundo lugar, medir la densidad mineral ósea (DMO), osea el volumen total volumen (BV/TV), número trabecular (Tb.N), espesor trabecular (Tb.Th), separación/separación trabecular (Tb.Sp) y porcentaje de porosidad total con el software suministrado para micro-CT.
    3. En tercer lugar, comparar los tres grupos para las distintas medidas por ANOVA unidireccional. Para el análisis post-hoc de la varianza, aplicar el método de Bonferroni2.

4. evaluación del modelo de osteólisis Calvarial por tinción H & E

  1. Descalcificar muestras de calvaria en 15% ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)-PBS a 4 ° C. Cambiar la solución de descalcificación cada día durante 3 semanas.
  2. Incrustar las muestras descalcificadas en parafina para un 2 x 1 cm x 1 cubo de cm y cortar en secciones de 2 μm en la zona de deposición de partículas.
  3. Mancha las secciones con hematoxilina y eosina como describió anteriormente7.
  4. Capturar imágenes de la pathomorphism general por microscopia ligera.

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Resultados

Las partículas de nanoescala producido interno CoCrMo fueron alrededor de 50 nm (error estándar de 3.56) de diámetro, como cuantificado por TEM (figura 2). Después de la exposición de ratón calvarias a partículas de CoCrMo, los animales (n = 6 por grupo) se mantuvieron durante dos semanas. Dentro de dos semanas, la incisión calvarial fue curada completamente, y la sutura puede caer. Cualquier infección local o no sindical puede afectar la evaluación de la pér...

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Discusión

Existen dos métodos principales para la osteólisis inducida por partículas de desgaste en ratones: el modelo de bolsa de aire y el modelo de osteólisis calvarial. En el modelo de bolsa de aire, una bolsa de aire subcutáneo generada se establece primero, seguido por la introducción de partículas de desgaste y la implantación en el tejido óseo del8. La pared de bolsa imita el periostio en aflojamiento aséptico. Sin embargo, la implantación de hueso es no vascular sin actividad biológica, que hace di...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81572111), la clínica de la ciencia y tecnología proyecto de Fundación de la provincia de Jiangsu (BL2012002), el proyecto de investigación científica de Nanjing (201402007), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (BK20161385) y la Fundación especial de asociación médico chino (2015COS0810).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aleación de CoCrMo de prótesisWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IIMateria prima para obtener nanopartículas de CoCrMo
Fabricación de corriente continua de tres electrodos de alto vacíoFacultad de Ciencia de Materiales y Ingeniería, Universidad de TecnologíaMáquina de diseño propio
de 6 semanas de edad C57BL / 6JModelo centro de investigación animal de la Universidad de NanjingN000013
100% etanolReactivo de NanjingC0691514023solvente de nanopartículas de CoCrMo para transmisión escaneo con microscopio electrónico Tubos de
microcentrífuga de 1,5 mlTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW603
Balanza microanalíticaShenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTDEX125DZH
Agitador ultrasónicoShanghai Yuhao instrumento científico co., LTDYH-200DHPara suspender nanopartículas de CoCrMo
Microscopio electrónicode transmisión FEITecnai G20
SimplePCI softwareCompix Inc.6.6 versiónPara calcular el diámetro medio y la distribución del tamaño de partícula.
Bandeja de esterilización de mano altaQIULONGYIQIKYQL-100DSPara descontaminar endotoxinas
Limulus Ensayo de lisado de amebocitos (LAL)Charles RiverR13025Para detectar endotoxinas 
15 ml Tubos de microcentrífugaTaizhou Suyi MedicalB122
Solución salina tamponada con fosfatoBoster Biological TechnologyAR0030Disolvente de solución madre de nanopartículas de CoCrMo
Pentobarbital SodioSigmaP3761Para anestesiar ratones
Solución salina normalSACKLERSR8572EP-15Para evitar la sequedad de los ojos de los ratones
Etanol al 75%Nanjing ReactivoC0691560275Desinfección
Bola de algodón médicoShuitao1278298933
AfeitadoraKemeiKM-3018Para afeitar la piel
TijeraRWD LIFE SCIENCES12005-10Para incidir la piel
SuturaRWD LIFE SCIENCEF34001-01Para suturar la piel
PortaagujasRWD LIFE CIENCIAF33001-01Para suturar la piel
AgujaRWD LIFE SCIENCER14003-12Para suturar la piel
Pinzas para vasosRWD LIFE SCIENCEF22003-09Para suturar la piel
BisturíRWD LIFE SCIENCES31010-01Para cosechar calvaria
PinzasRWD LIFE SCIENCEF12006-10Para cosechar calvaria
100 µ PipetasL Eppendorf3120000240Para incrustar partículas en suspensión en las calvatias
100 µ L puntas de pipetaAXYGENT-200-YPara incrustar partículas en suspensión en las calvatias
5 ml MicrotubosTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4% ParaformaldehídoServicebioG1101Fijación
Micro Tomografía Computarizada SkyScanSkyScan1176
Etileno Diamino Ácido tetraacéticoServicebioG1105Descalcificación
ParafinaServicebio#0001
Cortadora de parafinaLeicaRM2125RTS
Portaobjetosde vidrio ServicebioG6004
Cubierta de vidrioServicebio200
kit de tinción HEServicebio#1-5Microscopio óptico de tinción HE
NikonE200
de Nanjing macho ratones de desinfección

Referencias

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
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  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

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