Personalizada péptido matrices para la detección de aloanticuerpos HLA en trasplante de órganos

Resumen

Desajustes en las secuencias de leucocito humano antígeno (HLA) entre pares de receptores y donante de órganos son la causa principal de rechazo mediada por anticuerpos en el trasplante de órganos. Aquí presentamos el uso de matrices de antígeno personalizados basados en secuencias HLA de donantes individuales para sondear aloanticuerpos HLA de anti-donantes en receptores de órganos.

Resumen

Trasplante de órganos, la función y la longevidad del injerto críticamente confían en el éxito del control de la reactividad inmunológica del rechazo contra antígenos leucocitarios humanos (HLA). Directrices de histocompatibilidad se basan en pruebas de laboratorio de inmunidad anti-HLA, que presenta como preexistente o de novo generado anticuerpos HLA que constituyen una barrera importante del trasplante. Pruebas actuales son construidas en una plataforma de granos solo antígeno (SAB) usando un conjunto fijo de ~ 100 preseleccionados antígenos recombinantes de HLA para trasplante sera la punta de prueba. Sin embargo, en los seres humanos existe una mayor variedad de tipos de HLA, no dos individuos que no sean gemelos idénticos pueden compartir la misma combinación de secuencias HLA. Mientras que tecnologías avanzadas para el mecanografiar de HLA y la secuencia directa precisamente pueden capturar cualquier desajustes en la secuencia de ADN entre un donante y HLA del receptor, el ensayo SAB, debido a su limitada variedad en representación de la secuencia, es incapaz de detectar precisamente aloanticuerpos específicamente contra los desajustes HLA del donante. Se intentó desarrollar un método complementario utilizando una tecnología diferente para detectar y caracterizar anticuerpos HLA del donantes de forma personalizada. La herramienta de análisis es una matriz de péptido personalizado de donantes HLA-derivados secuencias sondeo poste-trasplanta suero del receptor órgano para evaluar el riesgo de rechazo mediado por anticuerpos. En una sola matriz para un par de donantes y receptores, hasta 600 péptidos únicos son hecha basado en secuencias de proteínas HLA del donante, cada péptido llevando al menos un residuo no coinciden en una secuencia de ácido amino-15. En nuestros experimentos piloto para comparar patrones de antígeno para pre y poste-trasplanta sera de estos arreglos de discos, hemos sido capaces de detectar señales de anti-HLA con la resolución que también nos permitió identificar los epítopos inmune involucrados. Estos personalizados matrices de antígeno permiten alta resolución detección de epítopos HLA específicos de donante en trasplante de órganos.

Introducción

Terapia de reemplazo de órganos que habitualmente se lleva a cabo en todo el mundo ha salvado millones de vidas. Trasplante sólido del órgano ocurre en aproximadamente 100 pacientes por millón de personas en los Estados Unidos anualmente, mientras que un mayor número todavía están en listas de espera recibir órganos de donantes debido a una grave escasez de suministro (de acuerdo con información proporcionada por el órgano Adquisición y trasplante de la red - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Trasplante de órganos es altamente regulado con el fin de reducir los residuos de órganos y salvar vidas, pero las herramientas científicas utilizadas para informar de estas ....

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Junta de revisión institucional para la Universidad Noroeste (IRB protocolo #: STU00104680). Un flujo de trabajo general del Protocolo se ilustra en la figura 1.

1. Análisis Bioinformático de donante y receptor HLA secuencias

1. recuperar secuencias de base de datos IMGT/HLA ¹⁵.
   1. Informes mecanografiar HLA obtener de la donante de órganos y su destinatario.
      Nota: Asegúrese de que se utilizan los procedimientos adecuados para proteger los registros médicos confidenciales. Por lo general, la aprobación de la J....

Resultados

En el estudio original utilizando la matriz de proyección método¹⁷, inscribieron un total de 5 temas de trasplante de riñón. Obtuvimos el HLA mecanografía resultados de nuestra cohorte y sus respectivos donantes. Su historial médico y los títulos de anticuerpos alélica de SAB pruebas también estaban disponibles para nosotros. En nuestro estudio experimental de estos 5 pacientes, hemos elaborado dos metodologías diferentes: una matriz estándar consta de un panel fij.......

Discusión

El diseño de la matriz de punto descrito aquí es para el estudio experimental de la especificidad del aloanticuerpo en el trasplante contra los antígenos HLA del donante de órganos. En contraste con el ensayo SAB existente ampliamente utilizado en clínica, el método de matriz de antígeno tiene una gran ventaja en su diseño flexible que puede acomodar el verdadero secuencias HLA del donante individual. La nueva plataforma explota las potencialidades de la tecnología de secuenciación de ADN rápido avance que pronto serán c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matriz de péptidos	INTAVIS Bioanalytical Instruments
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Solución Ponceau S	Sigma-Aldrich	P7170
Leche descremada	Bio Rad Laboratories	1706404
TBST Santa	Cruz Biotechnology	10711454001
IgG antihumana de cabra; HRP	ThermoFisher Scientific	A18811
Clarity Western ECL Sustrato Bio	Rad Laboratories	1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientifics	21059
ChemiDoc sistema de imagen en gel	Rad Laboratories 1708265

Bio