Artículo de método

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

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DOI:

10.3791/56281

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19 de octubre de 2017

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1The Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

En este artículo

Resumen

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Resumen

En nuestros esfuerzos para determinar los patrones de expresión y localización subcelular de Drosophila RNAs en todo el genoma y en una variedad de tejidos, hemos desarrollado numerosas modificaciones y mejoras a nuestro fluorescente original in situ protocolo de hibridación (FISH). Para facilitar el rendimiento y la rentabilidad, se realizan todos los pasos, desde la generación de la sonda de detección de señal, utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos de exón. Digoxygenin (Cave)-sondas con antisense RNA son producidas utilizando clones de cDNA o DNA genomic como plantillas. Después de la fijación del tejido y permeabilización, sondas son hibridadas de las transcripciones de interés y luego detectado usando una sucesión de anticuerpos anti-DIG conjugado con biotina, estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) y conjugado fluorescente tyramide, que en presencia de HRP, produce un intermediario altamente reactivo que se une a regiones densas del electrón de proteínas inmediatamente adyacentes. Estos pasos de localización y de amplificación producen una señal robusta y altamente localizada que facilita tanto localización celular y subcelular de la transcripción. Los protocolos proporcionados han sido optimizados para producir señales muy específicas en una variedad de tejidos y etapas de desarrollo. Para variaciones adicionales que permiten la detección simultánea de múltiples transcripciones, o transcripciones y proteínas, al mismo tiempo, dispones de referencias.

Introducción

Nuevos métodos de detección del RNA del genoma como RNA-seq han expandido enormemente nuestro conocimiento de Cuándo y dónde se expresan los genes y en qué niveles1. Sin embargo, estos ofrecen relativamente pobre resolución temporal y espacial. RNA el hibridación in situ permite la distribución espacial de las transcripciones para ser observada visualmente en los tejidos fijos, revelando así los detalles de la localización celular y subcelular2. Mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) permite más resolución espacial que permite el uso de técnicas de microscopía de gran alcance, tales como microscopia de confocal y luz la hoja3. Marcadores fluorescentes como DAPI pueden utilizarse también para establecer relaciones subcelulares4. PECES también facilita la observación de varios RNAs y proteínas al mismo tiempo con claras indicaciones de superposición en el nivel subcelular. Únicos reactivos y pasos necesarios para el etiquetado doble pueden encontrarse en las siguientes referencias3,5.

Los procedimientos descritos aquí utilizan las placas de microtitulación de 96 pozos para todos los pasos, incluyendo la producción de la plantilla de cDNA (colony PCR), producción de sonda de RNA (con transcripción de escorrentía dependiente de la polimerasa T7, T3 o SP6), hibridación in situ , y desarrollo de la señal fluorescente. Un número suficiente de embriones o tejidos se agregó a cada pozo de la placa de 96 pocillos para permitir la evaluación de consistencia y variabilidad. Pues bien, cada uno recibe una sonda diferente. Después del desarrollo de la señal, embriones o tejidos de cada pozo se vistió en portaobjetos individuales para el análisis microscópico.

El uso de amplificación de la señal de tyramide (TSA) para la detección de la sonda produce señales robustas con excepcional resolución subcelular 5,6,7,8. La localización subcelular de RNAs es un importante mecanismo regulador 9 que parece ocurrir con casi todos RNAs 4,10,11. Estos análisis también han mostrado que muchos expedientes que no son detectados por RNA-seq son fácilmente detectados por peces 8. La adaptación de RNA en situ hibridación para placas de 96 pocillos permite el análisis de genes hasta 96 de interés en un momento (se utilizan más si más placas), posibilitando el análisis de grandes conjuntos de datos. Cortando las placas en secciones más pequeñas, el método se adapta fácilmente a pocas muestras. El protocolo siempre es apropiado para el análisis de distribuciones de RNA en la mayoría de los tipos de tejidos. Aunque no se muestra, es adaptable a no - tejidos deDrosophila así.

Protocolo

1. amplificación por PCR de cDNA plantillas de plásmidos

Nota: uso de plásmidos de alta calidad o plantillas de la DNA generados por PCR para RNA sonda síntesis. Las bibliotecas de Drosophila Gene colección (DGC) generadas por el proyecto genoma de Berkeley Drosophila proporciona cobertura de la mayoría de los genes codificación en el genoma de Drosophila (ver tabla 1a). También permiten el uso de cebadores universales para la amplificación de cualquier inserto cDNA. Estas amplificaciones de PCR se realizan en el plásmido DNAs presentes en los lisados de cultivos bacterianos que contienen el plásmido. Los productos de ADN entonces se utilizan como plantillas para la transcripción en vitro para generar sondas de RNA antisentidas (ver cuadro 1b).

  1. Diseño de cebadores para amplificar una región del exón específico de un gen de interés mediante PCR (por ej. de la DNA genomic), preferiblemente con el sitio de reconocimiento de polimerasa T7 en el extremo antisentido.
  2. Para experimentos con menos de 96 muestras, corte porciones innecesarias de placas de 96 pocillos. Placas con sellado de cinta (ver materiales) para todas las incubaciones y almacenamiento. Si se utilizan tubos de microcentrífuga, Ayuste volúmenes.
    Nota: placas de 96 pocillos permiten el uso de pipetas multicanales para mayor rendimiento, así como volúmenes más pequeños para ahorrar costos.
1a mesa

Vector		 Antibióticos
trabajo concentración 1: 1000
Primers		RNA polimerasa
para
antisentido		ARN-polimerasa.
para
sentido
pFLC-IAmppBst_SK (-) _F/RT3T7
pBSt(-)AmppBSt_SK(-)T7T3
pOT2CloropOT2_F/RSP6T7
pOTB7cloropOT2_F/RT7SP6
Tabla 1b
Primersecuencia
pOT2_Forward 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 '
pOT2_Reverse 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 '
pBst_SK (-) _Forward 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 '
pBst_SK (-) _Reverse 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 '

tabla 1: A) información de clon General DGC para amplificación de ADNc inserta en plásmidos. B) secuencias de los Primers universales para plásmidos DGC.

  1. crecer 250 μl del plásmido que contiene la cultura bacteriana en placas 96 pocillos añadiendo 240 μl de medio LB por pozo con adecuada selección antibiótica (dilución 1: 1000 de una acción antibiótica de 1000 X) y 10 μl de la original bacterias que contienen el plásmido (de un stock de glicerol). Sello con lacre.
  2. Incubar por agitación en rpm 215 a 37 ° C durante la noche (O/N).
    Nota: Hacer una copia nueva del stock de clon de plásmido bacteriano glicerol cDNA para reemplazar el original. No vuelva a congelar la acción bacteriana original, como esto puede matar las bacterias.
  3. Para producir las plantillas de la polimerización en cadena, diluir 10 μl de la cultura bacteriana O/N en 90 μl ddH autoclave 2 O en cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos nueva. Desnaturalizar el ADN por 5 min a 95 ° C en un termociclador. Colocar inmediatamente la placa de hielo durante al menos 5 min
  4. Reacciones de preparación PCR usando las cartillas universales apropiados según la tabla 2.
de < /TR >
reactivosreacción de 50 μl muestra96 bien mezclar
(112 x reacción)		concentración Final
2 X PCR polimerasa Mix25 μlμl 28001 X
Primer_For (25 pmol/μl)0,5 μl5 6 μl0,25 pmol/μl
Primer_Rev (25 pmol/μl)0,5 μlμl 560,25 pmol/μl
22 μlddH2Oμl 2464
total48 μlμl 5376

tabla 2: PCR Master Mix.

  1. con una pipeta, alícuota 48 μl de la mezcla principal de PCR en cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos nueva. Añadir 2 μl de cada plantilla de la DNA plasmídico desnaturalizados por bien.
    Nota: Utilice entre 1 picogramo (pg) a 1 nanogramo (ng) de ADN plásmido. Reduce la excesiva plantilla de la DNA PCR rendimiento y especificidad.
  2. La máquina PCR de 96 pocillos según tabla 3 del programa y realizar la amplificación de.
    Nota: Se determina el tiempo de extensión a 72° C por el tamaño del producto PCR (45 s para ≤ 2,0 kb, 1,5 min para ≤ 3,0 kb, 3 min para ≤ 4,0 kb y 3,5 minutos para 4.0-5.0 kb). La temperatura de recocido (Tm) está determinada por la secuencia de los primers. Cuando un primer es igual o superior a 20 nt, la Tm se calcula como:
    Tm (° C) = (4 X número de CG) + (2 X número de AT) -4.
por < fila td span = "3" > 30 ciclos por
pasotemperaturatiempociclos
Desnaturalización inicial95 º C3 minutos1 ciclo
amplificación
desnaturalización, recocido y extensión		95 ° C45 seg
54-58 ° C45 seg
72 ° C45 seg-3,5 min
Extensión Final72 º C7 min1 ciclo
Almacenamiento4 º Cmantener

tabla 3: programa recomendado de la PCR.

  1. PCR producto de precipitación con etanol (EtOH) y sodio acetato (NaOAC) (ver tabla 4).
    Nota: Si el volumen de reacción de PCR es menos de 50 μL, llene a 50 μL con ddH 2 O.
    1. Para precipitar el ADN, mezclar los componentes de la tabla 4 y almacenar muestras O/N a-20 ° C o durante 30 min a-80 °C.Centrifuge la placa de 96 pocillos por 45-60 min a 2.250 x g a 4 pipeta múltiple de C. uso un canal 8 del ° carefully remover el sobrenadante. Lave una vez con 160 μl de frío 70% EtOH (libre de ARNasas) por 30 min a 2.250 x g a 4 ° C.
      Nota: Se aprecia el ADN precipitado en el fondo de los pozos. Productos PCR más cortos requieren más centrifugados.
    2. Invierta suavemente la placa de 96 pocillos sobre papel absorbente para eliminar las últimas gotas de líquido de cada pocillo (tanto como sea posible). Secar el pellet de ADN por 1 h a temperatura ambiente (RT). Resuspender el ADN precipitado en 25 μl de agua Rnasa gratis.
      Nota: El aire de 1 h seco permitirá todos los rastros de EtOH se evapore. Sin embargo, un muy pequeño volumen de líquido (aproximadamente 1 μl) debe permanecer en cada pocillo para evitar que el pellet de ADN seque completamente. Utilice 25 μl de una reacción de PCR de 50 μl. No utilice agua con DEPC tratado en esta etapa para evitar la interferencia con la transcripción en vitro en los pasos siguientes.
de
componentevolumenporción
Polimerización en cadena50 μl
100% etanol125 μl2.5 X vol. de la polimerización en cadena
3 de M de NaOAc (pH = 5.2, libre de ARNasa)5 μl10% vol. de PCR
Total180 μl

tabla 4: ejemplo de una reacción de PCR de 50 μl.

  1. Compruebe el tamaño y rendimiento de productos de la PCR mediante la ejecución de 5 μl de la solución de ADN resuspendida en un gel de agarosa al 1% en Tampón TAE X 1.
    Nota: Un total de 250-500 ng de plantilla de la DNA se requiere para la reacción de 15 μl en vitro de la transcripción. Muestras con rendimientos más altos se pueden diluir más. La producción de RNA también depende de la secuencia y la longitud de la plantilla de la DNA. Según la guía general para el etiquetado de DIG-RNA con T7 ARN polimerasa, se produce aproximadamente 10 μg de ARN marcados con DIG de plantilla lineal de 1 μg.

2. Transcripción in vitro para generar sondas antisentidas.

Nota: es fundamental trabajar en un ambiente libre de Rnasa. Todos los reactivos y accesorios de laboratorio deben ser Rnasa libre (por ejemplo certificados artículos plástico libre de DNasa/Rnasa).

componenteconcentración Stockvolumen Concentración final
ATP100 mM7 μl10 mM
CTP100 mM7 μl10 mM
GTP100 mM7 & # 956; l10 mM
UTP100 mMμl 4.56.5 mM
Dig-11-UTP10 mM25 μl3,5 mM
agua libre de ARNasa< /td > μl 19.5
Total70 μl

tabla 5: preparación de la mezcla de DIG-NTP.

< tabla frontera = "1" fo:keep-together.within-página = "1" fo:keep-con-next.within-página = "always" > componente de reacción de 15 μl 96 bien mezclar
(112 x reacción) Concentrado final 5 X Buffer de transcripción μl 3.00 3.00 μl 1 x Dig-NTP (10 mM) de la mezcla 0,75 μl μl 0,75 0,5 mM inhibidor de la Rnasa 0,25 μl 0,25 μl 0.67 U / μl ARN polimerasa (T7 o T3 o SP6) μl 2.00 2.00 μl 2.67 U / μl Agua libre de ARNasa 1.50 μl μl 1.50 Total μl 7.50 7.50 μl

tabla 6:2 X transcripción mezcla maestra.

Mezcla
  1. preparar el DIG-NTP según la tabla 5.
    Nota: Para evitar errores, siempre Alinee la placa de manera que A1 está en la esquina superior izquierda de la placa de.
  2. Agregar componentes descritos en la tabla 6 para cada bien en una placa PCR de 96 pocillos nuevo (placa de la sonda). Añadir 7,5 μl del producto de PCR (plantilla de ADN) a cada uno corresponde bien, usando una pipeta multicanal. Cubra la placa con cinta de sellado.
    Nota: La cantidad óptima del producto de PCR añadido por reacción de transcripción debe ser entre 0,5 y 1 μg. Si las bandas en el gel están significativamente más débil o más intensa, el volumen de ADN añadido a la reacción puede ajustarse en consecuencia. La cantidad exacta no es importante.
  3. Incube la placa de la sonda a 37 º C por 3.5-4 h. mezcla 15 μl de sonda sintetizado con 35 μl de DEPC tratados ddH 2 O, 125 μl del 100% EtOH y 5 μl de NaOAC M 3 (pH = 5.2, libre de ARNasa). Almacenar a-80 ° C durante al menos 30 min centrifugar y lavar como se describe en los pasos 1.10.2 y 1.10.3.
  4. Resuspender el precipitado sonda en 25 μl de DEPC tratados ddH 2 O. correr 5 μL en un gel de agarosa 1% (tiempo de funcionamiento < 20 min) para comprobar la integridad y el rendimiento de la sonda ( figura 2).
    Nota: El gel de la agarosa debe hacerse con DEPC tratado ddH 2 O y Tampón TAE. Aparato de electroforesis en gel se debe asignar para el ARN sólo trabajan. Gel más largo tiempo de funcionamiento a baja velocidad puede conducir a la degradación del RNA durante electroforesis.
  5. Mezclar el restante 20 μl de la sonda sintetizada con 100 μl hibridación solución (tabla 7) y tienda a-80 ° C hasta que sea necesario.
    Nota: La concentración de la sonda se puede diluir más si las bandas están particularmente robusto (ver figura 2 para ejemplos). Solución de hibridación es muy eficaz en la prevención de la contaminación de la Rnasa. Inmediatamente añadir solución de hibridación con la sonda resuspendida para evitar la degradación del RNA. Solución de hibridación debe ser filtrada a través de un filtro de 0.2 μm. Para las muestras de tejido, aumentar la concentración de detergente en la solución de hibridación mediante la adición de Tritón X-100 para una concentración final de 0.3%.
de de de de
componentevolumenconcentración Final
DEPC tratados ddH2Oml 11,85%23.7%
20 X SSC12,5 ml25% (5 X)
25 mlformamida50%
0,1 mlheparina (50 mg/ml)0. 2% (0.1 mg/ml)
Esperma de salmón solo trenzado DNA0.5 ml1.0%
Tween 200,05 ml0.1%
Total50,00 ml100%
< clase p = "jove_content» fo:keep-together.within-página = "1" > Tabla 7: solución de hibridación.

3. colección de drosophila cría y embrión, larva y adulto tejido.

Nota: para pequeña escala (botellas) y masa (cajas) cría de la mosca, utilizan protocolos estándar lab mosca en la comida de harina de maíz basado en 25 ° C. mantener adecuada adulto y larval densidad y proporcionar polvo de levadura activa adicional en alimentos superficies de.

  1. Recoger embriones siguiendo protocolos estándar. Los pasos principales de la colección embrionaria se ilustran en la figura 3.
    Nota: Después de aclarar los embriones devitillinized en metanol, los embriones fijados pueden almacenarse a-20 ° C hasta por un año. Permeabilización del embrión y la fijación se realizan el día 1 del protocolo pescado.
  2. Solución madre de preparar fresco 40% PFA. Solución de 40% paraformaldehido (PFA) mezclando 10 mL de DEPC
    1. Prepare un recién hecho tratados ddH 2 O a 3,68 g de PFA y 70 μl de KOH 2N en un vial de centelleo de vidrio 20 mL que contienen un pequeño revolver bar
      PRECAUCIÓN: El PFA es altamente tóxico con efectos de salud agudos y crónicos. Leer MSDS (hojas de datos de seguridad de Material) y utilizar protección adecuada para ojos, piel y vías respiratorias.
    2. En una campana de humos, calentar y agitar el frasco durante 3-5 minutos sobre una placa calefactora a 200 ° C hasta que la PFA se haya disuelto completamente. Retire la solución PFA del fuego tan pronto como la PFA se disuelve (no sobrecalentar).
    3. Enfriar la solución madre de la PFA disuelta del 40% en hielo durante 5 minutos y filtrar con una jeringa 0.2 μm filtro y 10 mL.
  3. Tercer instar las larvas (L3) o fijación del tejido adulto, apagando y permeabilización
    Nota: este Protocolo debería ser terminado en un día. Incluye tejido disección, fijación, amortiguamiento de endógeno HRP, permeabilización y posteriores a la fijación.
    1. Prepare soluciones de fijación (fijar-I y Fix II) según la tabla 8.
      Nota: el ácido pícrico se utiliza como un fijador adicional cuando el tejido tiene una estructura delicada que debe ser preservada. No es un buen fijador debe preservarse la ultraestructura de tejidos para microscopía electrónica (EM).
      ADVERTENCIA: el ácido pícrico es inestable y tiene la capacidad de reaccionar con otros materiales y crear compuestos explosivos. Utilizar y almacenar según normas de seguridad.
    2. Lugar larvas o moscas adultas en un tubo de plástico de 50 mL que contiene 10 mL de frío 1 X PBS y 100 μl de solución-solución. Chill en hielo por 2 minutos reducir la motilidad mosca larvas o adultos.
    3. Corte frente a la punta de una punta de plástico de 1 mL para crear una abertura de 2-3 mm. Transferencia de larvas de 10-30 o adulto vuela con la punta de 1 mL en una placa Petri (9 cm diámetro) con una capa superficial de 1 X PBS desde el tubo de 50 mL (paso 3.3.2). Agregar un poco de PBTT puede disminuir la tensión superficial. Disecar cuidadosamente larvas (abierto de anterior y apriete los tejidos de posterior a anterior) o de tejidos adultos de interés con un par de pinzas afiladas bajo un disección alcance.
      Nota: Sobre 200-300 larvas o adultos testículos pueden disecados y fijo en un solo día por individuos experimentados.
    4. Transferencia diseca los tejidos con una pipeta μl 200 (con la punta cortada para crear una abertura de 2 mm de diámetro) en un tubo de 1,5 mL y tienda en el hielo. Completar cada ronda de disección dentro de 10-15 min antes de progresar al próximo paso.
      Nota: Seguir con rondas adicionales (dentro de una ventana de tiempo de 2 h) según sea necesario para generar suficiente material.
    5. Fijar los tejidos con 800 μl de solución-solución durante 30 minutos en un mezclador superior del Banco. Límite de tejidos de enjuague una vez con 800 μL 1 X PBTT y mantener los tubos en hielo por un máximo de 2,5 h. debido a los 30 min, este debe de realizarse batch-wise hasta que se ha recogido suficiente tejido.
    6. De la piscina todos los tejidos disecados y fijados en un tubo de plástico de 15 mL solo con malla en la tapa (ver figura 4 para el diseño del tubo). Aspire el exceso de líquido a través de la malla en la tapa del tubo. Lavar 3 X 5 minutos cada uno con 10 mL de 1 X PBTT. Enjuague dos veces con 10 mL de 1 X PBS para quitar el detergente. Esto evita el exceso de burbujas en el siguiente paso.
      Nota: Si los tejidos disecados se hunden hasta el fondo del tubo, pasos pueden realizarse en placas de microtitulación regular o 0.5-1.5 tubos de microcentrífuga de mL (volumen de 300-800 μl por tubo).
    7. Saciar la actividad endógena de HRP con 5 mL de 0,3% H 2 O 2 en PBS durante 15 min a TA. repetir una vez más. Mantener la tapa abierta durante este paso sin mezclar. Enjuague dos veces con 10 mL de 1 X PBTT. Lave dos veces durante 5 min con 10 mL de 1 X PBTT.
    8. Permeabilizar los tejidos con 10 mL de acetona al 80% (-20 ° C, enfriada previamente) a-20 ° C durante 10 minutos invertir el tubo dos veces durante el período de incubación. Lavar dos veces por 10 min con 10 mL de 1 X PBTT rehidratar los tejidos.
    9. Enjuague con 10 mL de una mezcla de hibridación PBTT plus 5 ml 5 ml de solución (1:1). mezcla de descartar y reemplazar con 10 ml de solución de hibridación. Las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta que se necesite. Para mejores resultados, no almacenar las muestras por más de una semana.
de
componenteme (10 ml) FixFix II (10 ml)
Valores PFA 40%1 ml1 ml
PBTT8,99 ml9 ml
solución de ácido pícrico10 μl–
< clase p = "jove_conte NT"fo:keep-together.within-página ="1"> Tabla 8: soluciones de fijación para los tejidos.

4. hibridación in situ

Nota: esta parte del protocolo requiere un mínimo de 2 días, con la preparación de la muestra, la hibridación e hibridación teniendo lugar el día 1 y sonda de detección en día 2. Si el número de muestras es relativamente alto, si esta familiarizado con el protocolo, o un día completo no es posible, el protocolo debe realizarse en 3 días con los pasos de amplificación de señal y detección de sonda, dividida en 2 días. Gran número de embriones o muestras de tejido disecado también puede requerir días adicionales para procesar. Muestras de tejido disecado, sustituya 1 X PBT con la PBTT de X 1 en todas las etapas, salvo que se indique. El detergente adicional se requiere para la penetración de muchos tejidos larvales y adultos, como el cerebro y testículos. Aunque no probado, 1 X PBTT también puede ser usada para embriones. Utilizar 100 μl por pozo para placas de 96 pocillos y 800 μL para tubos de 1.5 mL.

  1. La hibridación y la hibridación
    Nota: 4.1.1-4.1.6.2 pasos son para el embrión en situ hibridación. Para tejidos de larvas o adultos en situ hibridaciones, omitir estos pasos.
    1. Retirar 2 mL de embriones fijados (almacenado en metanol a-20 ° C) a un nuevo tubo de 15 mL. Lavar los embriones dos veces por 7 min con 10 mL de metanol en cada lavado. WaSH embriones por 7 min con 10 mL de una mezcla de metanol y 1 X PBTT (1:1). Lavar los embriones dos veces por 7 min con 10 mL de 1 X PBTT rehidratar.
    2. Para permeabilización de embrión, preparar una solución de intermedios de proteinasa K (40 μl/mL) mediante la dilución 1: 500 de solución (20 mg/mL). Almacenar a -20 ° C. Haga una solución de trabajo diluyendo la solución intermedia proteinasa K 1/15 en 1 X PBTT para una concentración final de trabajo de 2,667 ug/mL de proteinasa K.
    3. Permeabilize embriones con 10 mL de la solución de proteinasa K (uso menos para números más pequeños de embriones). Incubar el tubo a temperatura ambiente para min 13 invierta suavemente el tubo 4 veces durante la incubación. Incubar las muestras en solución de proteinasa K en hielo durante 1 hora sin mezcla de.
      Nota: La incubación relativamente largo con diluido proteinasa K asegura permeabilización reproducible uniforme y posterior tinción.
    4. Mientras que embriones permeabilizar, hacer un 2 mg/mL solución de glicina de stock de X 10 (20 mg/mL) en 1 X PBTT para un volumen total de 30 mL.
    5. Quitar proteinasa K solución, enjuague con 10 mL de solución de glicina (2 mg/mL) y lavar dos veces por 2 minutos cada uno. Enjuagar tres veces con 10 mL de 1 X PBTT quitar glicina.
    6. Posteriores a la fijación de los embriones.
      1. Preparar 10 mL 4% PFA (1 mL de 40% PFA en 9 mL de PBTT, filtrado mediante filtro de 0.45 μm).
      2. Incubar las muestras en el 4% PFA durante 20 min lavado 3 X por 2 min con PBTT.
      3. Preparar la solución de hibridación desnaturalizada, hervir la solución de hibridación durante 5 minutos. Para una placa completa de 96 pozos, uso tres tubos de 12 mL. Enfriar en hielo inmediatamente por 5 min
        4. Embriones
      4. enjuague una vez con 10 mL de 1 X PBTT: solución de hibridación (1:1). Enjuague dos veces con 5 mL de solución de hibridación. Alícuota ~ 20 μl por pocillo de colocado embriones (embriones de 30-40) o tejidos fijados en una placa PCR de 96 pocillos en el hielo. Retire la solución de hibridación de tejidos o embriones con una pipeta de 8 canales múltiple ( figura 1/video).
        Nota: La pipeta múltiple tiene una ‘ dejar de ’ que evita que las puntas de ir hasta el fondo de los pozos y extracción de muestra. Para los experimentos utilizando tejidos que flotan, eliminar el líquido cuidadosamente con una pipeta 100 μl de la parte superior.
    7. Agregar 100 μl de la solución de hibridación desnaturalizada a cada pocillo. Hibridar los embriones para un mínimo de 2.5-3 h a 56 ° C utilizando una unidad de calefacción baño seco que contiene cuentas de metal (ver materiales y figura 1).
    8. Desnaturalizar 100 μl de la sonda en una placa PCR de 96 pocillos utilizando un termociclador durante 5 minutos en 80 cool ° de la C. inmediatamente en hielo durante 5 minutos. Retirar la solución de hibridación previa de embriones o tejidos. Añadir desnaturalizadas sondas de genes específicos a cada uno la muestra, cubren con cinta e hibridan a 56 ° C durante 16-18 h. O/N, bajo cuentas de metal en baño seco de calefacción unidad.

5. Sonda detección

  1. caliente previamente las soluciones de la unidad de calefacción de 56 ° C en la tabla 9. Retirar las puntas de prueba de la placa.
    Nota: Las sondas pueden ser reutilizadas entre 2 - 3 veces si se almacenan a-80 ° C (nunca almacene cualquier RNA de muestras en-20 ° C). Después de la hibridación, el RNA trenzado doble es más estable que el RNA de cadena única y es menos susceptible a la degradación causada por la contaminación de la Rnasa.
    Si se usa un un sistema de filtración de vacío de varios pocillos de la placa para los tejidos, se debe incluir una placa de colección debajo de la placa de filtro para recoger las puntas de prueba (ver video de detalles de armado). Tejidos hibridizados tendrá que ser transferido de la placa de microtitulación de 96 pocillos regular utilizada por hibridación a una con membranas PVDF tamaño 1,2 μm de poro en la parte inferior de cada pocillo.
< t r >
pasopreviamente calentado solución (56 ° C)tiempo de Volumen por bien
1Solución de hibridación: PBTT (3:1)15 min100 μl
2Solución de hibridación: PBTT (3:1)15 min100 μl
3Solución de hibridación: PBTT (1:1)15 min100 μl
4Solución de hibridación: PBTT (1:3)15 min100 μl
53 PBTT lava5 min100 μl

Tabla 9: lavar las puntas de prueba después de la hibridación.

  1. si utiliza placas normales, las muestras de lavado según la tabla 9 en una unidad de calentamiento a 56 ° C. Si utilizando el sistema del colector de vacío, utilizar soluciones de calefacción con sistema de vacío en Banco y retire soluciones inmediatamente de abajo vaccuum. Después del 3 º lavado con PBTT X 1, se puede quitar la placa normal de calefacción unidad.
  2. Preparar anticuerpos.
    1. Preparar 11 mL de solución de anticuerpo primario (2,5 μg/mL) de caldo (1 mg/mL) por dilución de anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con biotina anti-DIG (véase lista de materiales) en PBTTB (1: 400). Si procesa muestras menos, Ayuste volúmenes.
    2. Preparar 11 mL de solución de estreptavidina-HRP (1 μg/mL) de caldo (1 mg/mL) mediante la dilución 1: 1000 estreptavidina-HRP conjugado (véase lista de materiales) en PBTTB. Si con menos muestras, Ayuste volúmenes.
  3. Bloque embriones o tejidos con PBTTB (leche descremada 1% 1 X PBTT) por 20 min en un mezclador superior de banco en RT.
    Nota: Filtro PBTTB con papel de filtro (3 º grado, 6 μm) antes de usar en placas de 96 pocillos filtro para evitar la obstrucción de los filtros. En lugar de PBTB, PBTTB (PBTB con adicional 0.3% Tritón X-100) se utiliza para todos los tejidos durante el protocolo de.
  4. Incubar embriones o tejidos en la solución de anticuerpo (100 μL/pocillo) de 2 h de mezclador de mesa muestra. Enjuague dos veces con 1 x PBTTB. Lavar 3 X 5 min y 5 X 10 min con PBTTB. Incubar embriones o tejidos con solución de estreptavidina-HRP (100 μL/pocillo) de 1,5 h, con un mezclador de sobremesa muestra. Lavar 2 X durante 5 minutos con PBTTB. Mantener las muestras en la oscuridad de este punto en.
    Nota: durante los lavados de anticuerpos, si el tejido se está perdiendo debido a la opacidad producida por la leche, trate de lavar sin leche (PBTT en vez de PBTTB).
  5. Preparar una solución DAPI diluyendo 100 X DAPI en PBTTB (1: 100).
  6. Incubar embriones o tejidos con la solución de DAPI (100 μL/pocillo) durante 15 minutos en un mezclador de sobremesa muestra. Lavar 4 X 10 min con PBTT. Almacenar la placa de 96 pocillos con muestras O/N a 4 ° C o proceder al siguiente paso.
    Nota: El procedimiento puede hacer una pausa aquí.

6. Detección de anticuerpos mediante tyramide (ver figura 5)

Nota: aquí se utilizó caseros Cianina 3 conjugado tyramide, que fue preparado según el protocolo descrito en 12 . Si realizar muchos experimentos o pruebas muchas muestras, esto ahorra una cantidad importante de dinero y es eficaz en comparación con reactivos comerciales (de experiencia). Para pocas muestras y experimentos, puede usarse comercialmente disponible Cianina 3-tyramide (ver materiales).

  1. Muestra de lavado placas de 3 X 5 min con 1 X PBTT.
  2. Prepare tyramide activación tampón (tampón de activación) que contiene 0,006% de H 2 O 2 en PBTT (diluido 30% (w/w) H 2 O 2 acción 1: 5000).
    3. < lYo > Lave las placas con el tampón de activación.
  3. Prepare la solución de Cianina 3 tyramide diluyendo en buffer de activación en un tubo de 15 mL.
    1. De embriones, uso de dilución de 1: 80 (137 μl de Cianina 3-tyramide en 11 mL de tampón de activación). Para los tejidos larvales, utilice dilución de 1: 150 (73 μl de Cianina 3-tyramide en 11 mL de tampón de activación). De los testículos adultos, usar dilución 1: 200 (55 μl de Cianina 3-tyramide en 11 mL de tampón de activación). Los ovarios adultos, utilice 1:300 dilución (36 μl de Cianina 3-tyramide en 11 mL de tampón de activación).
  4. Incubar las muestras con solución de Cianina 3 tyramide para 2 h de mezclador de mesa muestra. Lavar cuatro veces con PBTT. Lavar 6 X durante 10 min con PBTT. Lavar 3 X durante 5 minutos con PBS para eliminar el detergente.
    5. Medios de montaje de
  5. Agregar 150 μL/pocillo de anti-fade. Mantener muestras de O/N a 4 ° C para permitir que los tejidos o embriones a hundirse hasta el fondo del tubo. Montar las muestras en portaobjetos (bajo disección alcance los tejidos) y cubrir con cubreobjetos. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
  6. Imagen usando un microscopio de fluorescencia.
    Nota: analizar control negativo primero para tener una idea de ‘ no específicos ’ fondo.

Resultados

La figura 6 muestra ejemplos de los resultados obtenidos usando este procedimiento. Los paneles superiores 3 muestran ejemplos de embriones de Drosophila tempranos (figura 6, paneles A-C), el próximo 3 paneles muestran ejemplos de embriones de Drosophila con señales en diferentes tejidos (amnioserosa, músculos y sistema nervioso central, respectivamente (figura 6, paneles D-F). A continuación son ejemplos de estadio 3 tejidos larvales (figura 6, los paneles de G-J). Paneles de K y L muestran imágenes representativas de adultos gónadas (ovario y testículo, respectivamente). Cientos de imágenes se han subido y anotado en nuestra página 'fluorescente en situ mosca de la fruta base de datos' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).

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Figura 1. Esquema de fluorescente en situ del hibridación (pescado) protocolo clave equipo y. (A) amplificación PCR de cDNA. (B) In vitro transcripción para generar específicos de gen antisentido DIG - etiquetado de sondas de RNA en una placa de 96 pocillos (foto de la placa que se muestra en b). (C) y (D): adultos (hembra: relación hombre 2:1. 300-400 moscas/botella) moscas se les permite aparearse durante 3-4 días. Embriones de una colección durante la noche alimentos de harina estándar a 25 ° C se transfieren a una caja de plástico bien ventilada (1 L de alimentos de harina de maíz en un recipiente de tamaño: 8 "X 8" X 3" LWH) o a nuevas botellas, mantener una adecuada densidad larvaria. Para la colección de tejidos, polvo de levadura activa debe ser asperjado sobre los alimentos a las 24, 48 h después de la postura (AEL). (E a H): Fluorescente en situ hibridación experimentos realizados durante 3 días consecutivos. Para embriones o tejidos que no flotan, utilice una placa de PCR de 96 pocillos como se muestra en la fotografía b con aspirador de 8 canales (foto c). Para los tejidos que flotan, como la mayoría de los tejidos larval, utilice una placa de filtro de fondo (foto d) y eliminar el líquido desde la parte inferior con un aspirador colector de baja presión (foto e). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Determinación del rendimiento de la sonda de RNA. Recién sintetizado sondas antisense RNA observadas en gel de agarosa 1% (5 μl/carril). El rendimiento se puede categorizar (basado en la intensidad de la banda) como 'rendimiento bajo' en rutas 3 y 10, rendimiento de típico en los carriles 1, 4, 5, 6 y 8, 'alto rendimiento' en pistas 2, 7, 9, 11 y 12. Para muestras con 'típicos rendimientos', utilice 10-15 μl de la sonda diluir en 100 μl de solución de hibridación para cada experimento en situ . Diluir las muestras con 'alto rendimiento' de la sonda con solución de hibridación adicional según la intensidad de la banda en relación con la intensidad de un 'típico ' de la sonda. Objetivo tienen concentraciones de aproximadamente igual probe final en cada pozo. La flecha señala a una de las sondas de RNA la banda superior de cada carril es la plantilla original de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Principales pasos para una colección de embriones en gran escala y de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Tubo casero para eliminar el líquido de los tejidos larvales o flotantes. Algunos tejidos larvales y adultos flotan en solución durante la fijación. Esta sencilla herramienta consiste en una malla de nylon por una 200 μL cortar la punta, seguido por una punta de 1 mL como un adaptador para conectar a un aspirador. Líquido se puede quitar sin perder cualquier tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. Amplificación de la señal de Tyramide. (1) sonda de RNA antisentido DIG marcado se hibridiza con sentido endógeno RNA. (2) inmuno afinidad de unión entre anticuerpo primario conjugado con biotina y DIG-UTP. (3) HRP había conjugado estreptavidina biotina de ATA. (4) HRP cataliza la reacción de Cianina 3-tyramide y peróxido de hidrógeno para formar a radicales de breve duración Cianina 3-tyramide. (5) radicales de Cianina 3-tyramide se unen a residuos de tirosina en proteínas cercanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6. Representante en situ imágenes hibridación. Cada panel muestra un ejemplo de un RNA diferentes (mostrado en cian) y núcleos teñidos con DAPI (mostrado en rojo). (A-C) Ejemplos de los primeros embriones de Drosophila . (D, F) Ejemplos de finales embriones de Drosophila . (G-J) Ejemplos de 3er instar tejidos de larvas de Drosophila (túbulos malphigian del midgut, glándulas salivales y el músculo respectivamente). (K) ovario adulto. (L) testículo adulto. Cada panel muestra el nombre del gen que la sonda se cruza por hibridación a. Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo descrito proporciona un método altamente reproducible, sensible y económico para la detección de ARN más en fijos Drosophila embriones o tejidos. Aunque un poco más complicado que el más tradicionalmente utilizan método de fosfatasa alcalina de la detección de la sonda, la resolución obtenida por los peces es mucho mayor y la sensibilidad es comparable o mejor 7,8. Utilizando placas de microtitulación total o parcial, pueden utilizarse los protocolos de análisis a gran escala o limitados de genes de interés. Cabe señalar que las puntas de prueba generados pueden detectar todos o empalme de transcripción múltiples formas a menos que las puntas de prueba están diseñados más específicamente (es decir, solo exones). Aunque hemos probado tan pequeñas como 200 nucleótidos con razonable éxito de sondas, sondas más pequeñas suelen ser menos efectivas y pueden ser menos específicas. Claramente, este Protocolo no es apropiado para la detección de pequeños intrones, exones, o procesado microRNAs.

Aunque este enfoque utiliza un paso enzimático para aumentar la fuerza de las señales, intensidad de la señal parece ser proporcional a la expresión del gen Diana en una relativamente lineal y amplia gama de niveles de expresión. A mayor aumento, la señal se ve como orificio o puntos dentro de las células y tejidos. Para transcripciones relativamente raras se ven solo unos orificio pequeño. Medida que aumenta la abundancia de transcripción, estos crecen en número y tamaño. Como sola molécula peces (smFISH), único orificio pequeño puede corresponder también a RNAs sola y debe también ser fácilmente cuantificado utilizando el software de la proyección de imagen y la informática. Comparaciones de imágenes publicadas obtenidas mediante smFISH con imágenes que nos hemos curado para los objetivos de la misma sugieren que la general, la sensibilidad y la resolución de los dos métodos son relativamente similares, aunque esto debe ser probado por comparaciones más rigurosas. Teniendo en cuenta el gasto mucho más alto de smFISH, el método que aquí debe dar resultados similares a una fracción del costo. Sin embargo, si el objetivo es detectar pequeñas transcripciones o partes distintas de las transcripciones, se recomienda smFISH.

Debido al menor tamaño de algunas sondas FISH, este método también puede ser mejor para penetrar los tejidos que son grandes o que tengan barreras significativas. Sin embargo, el uso de mayores niveles de detergente y ajustes fijación y permeabilización del tejido parece que han solucionado este problema. Por último, aunque desarrollado para los tejidos de la Drosophila , los buffers detergentes alta aquí descritos para los tejidos disecados también deberían funcionar para los tejidos, así como la mayoría otros organismos y embriones de Drosophila .

Divulgaciones

Autores tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Fondos para este proyecto fue proveído por una beca a HMK por los institutos canadienses de salud investigación (concesión 133473 fregona).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
15 ml Tubos de centrífuga cónicos de polipropilenoFrogga BioTB15-500Certificado Libre de DNasa y RNasa
2x PCR Master Mix con colorante (Ambiogene)Biomart (Canadá)141106-1KCertificado Libre de DNasa y RNasa
50 ml Tubos de centrífuga cónicos de polipropilenoFrogga BioTB50-500pocillos sin DNasa y RNasa
(1,2 mmm, PVDF hidrófilo membranaEMD MILLIPOREMSBVS1210Se utiliza para eliminar liguid del fondo de la placa con tejidos flotantes Placa de
PCR de 96 pocillos (200 μ l)DenvilleC18096-10
Acrodisc (0,2 u)PALLPN4612
Filtro de jeringa Acrodisc (0,45 u)PALLPN4614
AgaroseBioshopAGA002.500
Placas de almacenamiento de ensayo AXYGEN de 96 pocillosUltiDent Scientific24-P96-450V-CPara almacenar existencias de glicerol bacteriano
AXYGEN Aluminio Sellos de placasUltiDent Scientific24-PCR-AS-200Para sellar placas
AXYGEN Puntas de diámetro ancho (200 ul)UltiDent Scientific24-T205-WB-CPara transferir muestras
Biotina-SP (espaciador largo) Fracción IgG Monoclonal de ratón Anti-DigoxinaJackson ImmunoResearch Lab200062156Anticuerpo primario para in situ (conc. de stock 1 mg/ml, conc. de trabajo 2,5 μ g/ml o dilución 1/400.
MARCA Colector de 8 canales (esterilizable en autoclave)BrandTech Scientific Inc.704526Para eliminar líquidos de la parte superior de las placas de PCR de 96 pocillos
CloranfenicolSigma-aldrichC1919Concentración de existencias 34 mg/ml disueltos y 0,2μ m filtrado en 100 % EtOH (usar como 1/1000)
Cianina 3 Tiramida (Cy3-TSA)Hecho enSe puede pedir a Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano)Sigma-aldrichD2522Reactivo antidecoloración en medios de montaje
Digoxigenina-11-uridina-5'-trifosfatoRoche11-209-256-910
Jaula de recogida de embrionesInicio hechoN/ATamaño: 75 cm X 75 cm X 75 cm hecho con polimetacrilato de metilo
Centrífuga Eppendorf 5804EppendorfModelo 5804Centrífuga para placas de 96 pocillos en rotor A-Z-DWP
FormamidaBioshopFOR001.500
GlycerolBioshopGLY002.4
GlycineBioshopGLN001.500
HeparinaSigma-AldrichH4784-250MGStock: 50 mg/ml. Concentración de trabajo 1 mg/ml en solución de hibridación
Lab Armor BeadsDiaMedLAA42370-001 Llenado enunidad de calefacción
Labnet Gyro M Mini mezclador nutanteFisher Scientific50-998-347Mezcla de muestras
Malla - 100 miconesFlyStuff57-103Para la recolección de embriones
Malla - 800 micrasSEFAR - Nytex06-780/53Para atrapar tejido suelto / se puede utilizar para un tubo especial en la figura 4.
Micro cubreobjetosVWR48366-067Tamaño: 22 X 22 mm
Micro portaobjetos,frstdVWR48312-003Tamaño: 25 X 75 mm
Colector de vacío de placa multipocilloPall CorporationN/P 5017Retire el líquido del fondo de la placa de filtro de 96 pocillos
Paraformaldehído (PFA)BioshopPAR070.500Máquina
PCRBio-RadModelo: DNA Engine PTC-200Placa de 96 pocillos PCR y desnaturalización de sonda
Solución de ácido pícricoSigma-aldrich80456Para fijación de tejidos I solución
Cloruro de potasio (KCL)BioshopPOC308
Tapa de PP para placas de 96 pocillos, 100/cajaUltiDent Scientific24-P-LID-PPTapa para almacenar placas
Progene desechables Depósitos de reactivos (50 ml, estériles)UltiDent Scientific825-1-50-5S Manipulación delíquidos
Progene Perforable Papel de aluminioUltiDentScientific 87-CFILM-ALSeal Placa de 96 pocillos, libre de DNasa y RNasa
Proteinasa KSigma-aldrichP2308- 5MGPerpermeabilización embrionaria
RiboLock Inhibidor de la ribonucleasaThermo ScientificEO038140 Unit/ul
Juego de trifosfato de ribonucleósido (NTP)Roche11277057001sonda de ARN siera siera
libre de ARNGIBCO10977015-500mlsonda de ARN sierba
RNaseZapAmbionAM9780Eliminar la contaminación por ARNasa
ADN monocatenario de testículos de salmónSigma-aldrichD9156Para solución de hibridación
Leche desnatada (potencia descremada)BioshopSKI400.500La concentración de trabajo es del 1 % en 1 X PBT o PBTT como reactivo bloqueante
Acetato de sodio (NaOAc) 3 M, pH = 5,2 (libre de RNasa)BioshopSAA333concentración de trabajo es del 10 % (v/v) para la precipitación de ADN o ARN
SP6 ARN polimerasaThermo ScientificEP013120 Unit/ul
Granalla de acero inoxidable para baño de arenaVWR13259-274.Para llenar la unidad de calefacción
Microscopio estereoscópico y fuente de luz de cuello de cisneModelo Leica: MZ6Disección de tejidos y montaje
de estreptavidina, peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugadoSondas molecularesS911Stock de anticuerpos secundarios: 1 mg/ml, uso de dilución 1/1000 (1 μ g/ml) para in situ.
T3 ARN polimerasaThermo ScientificEP010120 Unidad/ul
T7 ARN polimerasaThermo ScientificEP011120 Unidad/ul
Estación de punta (10 ul)AxygenT-300-STK-SCertificado DNasa y sin RNasa
Estación de punta (200 ul)Sorbio27770TCertificado Puntas libres de DNasa y RNasa
( 1ml)Sorbio10200Certificado Libre de DNasa y RNasa
TRITON X-100BioshopTRX506concentración de trabajo es del 0,3% en 1 X PBT para tejido in situ
Tween 20BioshopTWN510concentración de trabajo es del 0,1% en 1 X PBT para el embrión in situ
Papel de filtro cualitativo Whatman, Grado 3Sigma-aldrichWHA1003917
NameCompany Número de catálogoComments
SolutionsPreparación
DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano) glicerol anti-decoloración medios de montajeDABCO (1,25 g), glicerol (35 ml o v/v 70 %) y 1 X PBS (15 ml, o v/v 30 %). Manténgalo oscuro y mecerlo en una habitación fría. tienda a -20 ° C
1 X PBT (1L)1 X PBS con 1 ml Tween 20 (0,1 %)
1 X PBTT (1L)1 X PBS con 1 ml Tween 20 (0,1 %) y 3 ml de Triton-X-100 (0,3 %)
1 X PBTB (1L)1 % Leche desnatada en 1 X
PBT 1 X PBTTB (1L)1 % Leche desnatada en 1 X PBTT
Placa de filtración de 96 Filtro de jeringa casa de de fijación agua La La La

Referencias

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