Evaluación de los efectos del sistema endocrino interrumpir compuestos en el desarrollo de la función de red neuronal vertebrados utilizando electrodos múltiples

Resumen

Exposición a toxinas ambientales agudo puede afectar a los embriones en desarrollo. Productos químicos disruptores endocrinos como bisfenoles se saben que negativamente afectan al sistema nervioso. Aquí describimos un protocolo usando un modelo de red neuronal en vitro vertebrado (embrión de pollo) para estudiar el impacto funcional de la exposición de la toxina en embriones tempranos.

Resumen

Bis-fenoles, como el bis fenol A (BPA) y bis-fenol-S (BPS), polimerización a agentes ampliamente utilizados en la producción de plásticos y numerosos productos de uso cotidiano. Se clasifican como compuestos disruptores endócrinos (EDC) con propiedades similares al estradiol. La exposición prolongada a interruptores endocrinos, incluso en dosis bajas, se ha vinculado con varios defectos de salud, incluyendo cáncer, trastornos conductuales e infertilidad, con mayor vulnerabilidad en períodos tempranos del desarrollo. Para estudiar los efectos del BPA en el desarrollo de la función neuronal, hemos utilizado una en vitro red neuronal derivada del cerebro embrionario temprano de pollo como modelo. Hemos encontrado que la exposición a BPA afectó el desarrollo de la actividad de la red, específicamente clavar actividad y sincronización. Un cambio en la actividad de la red es el vínculo crucial entre la diana molecular de una droga o compuesto y su efecto sobre el resultado conductual. Electrodos múltiples arreglos de discos se están convirtiendo en herramientas útiles para estudiar los efectos de las drogas en la red actividad in vitro. Existen varios sistemas disponibles en el mercado y, aunque hay variaciones en el número de electrodos, el tipo y la calidad de la matriz de electrodos y el software de análisis, los principios subyacentes, y los datos obtenidos es la misma a través de la diferentes sistemas. Aunque actualmente limitado al análisis de dos dimensiones en vitro culturas, estos sistemas MEA están siendo mejorados para permitir en vivo la actividad de red en rebanadas de cerebro. Presentamos un protocolo detallado para exposición embrionaria y el registro de actividad de la red neuronal y sincronía, junto con resultados representativos.

Introducción

4, 4′-Isopropilidendifenol, comúnmente conocida como Bisfenol A o BPA, un aditivo antioxidante se encuentra en una amplia variedad de policarbonato y epoxy resina basado en productos que van desde papel, CDs y romper a prueba de vidrio, en el interior de la capa de latas de bebidas. Aunque el BPA se ha sabido para ser un agente disruptores endocrino que imita el estrógeno¹, estudios sobre sus efectos nocivos debido a la cotidiana exposición casual al BPA han salido sobre todo en los últimos 10 – 15 años. Las consecuencias de los aún bajos niveles de exposición BPA son más profundas en períodos tempranos del desarrollo, incluyendo durante la embriogénesis a través de la exposición de las madres^2,3. En el útero exposición de embriones femeninos al endocrino interrumpir productos químicos también se ha relacionado con enfermedad mayor susceptibilidad de vaginal para el cáncer de mama^4,5. Estudios en animales han demostrado la exposición a BPA conduce a la estructura cerebral anormal y anormalidades funcionales que se manifiesta en el comportamiento⁶. Como consecuencia, se ha prohibido el uso de BPA en biberones infantiles por las agencias reguladoras más en Europa y Norteamérica, incluyendo la FDA. Para cumplir con las regulaciones, muchos fabricantes han cambiado a 4, 4'-sulfonyldiphenol o bisphenol-S (BPS). Basado en el hecho de que BPA y BPS son análogos estructurales y que informes recientes demostraron potencia comparable de BPS en transcripción estrogénicos⁷, es importante para el estudio de la toxicidad de este compuesto en relación con BPA.

Aquí se describe un protocolo para probar los efectos del BPA (y otras EDCs) en redes de neuronas mediante un modelo de vertebrados, el embrión de pollo. Cultivos in vitro de neuronas forman contactos sinápticos y generan potenciales de acción (también llamados picos). La actividad spiking de estas culturas puede grabarse utilizando sistemas de arreglos de electrodos múltiples (MEA). Los puntos se consideran en sincronía cuando ocurren dentro de 5 m uno del otro. Actividad clavaba al azar inicial que eventualmente se sincroniza es una característica clave del desarrollo de redes neuronales^8,9. Sincronía puede medirse usando varios métodos y varios algoritmos se describen en la literatura^9,10,11. En nuestros análisis, se utiliza un algoritmo desarrollado por Paiva y colaboradores¹² , que está integrado en el software de grabación que impulsa el sistema de adquisición de MEA. La robusta actividad spiking de neuronas embrionarias de pollo proporciona un prototipo para estudiar el efecto del BPA en red de los nervios actividad¹³. Usando electrodos múltiples arreglos de discos de registro actividad spiking, observamos que la exposición BPA inhibe el desarrollo neuronal spiking sincronía^9,14. Aquí, ofrecemos una metodología detallada para el estudio de la exposición BPA en las neuronas de embriones chick en cultura con resultados representativos en el desarrollo de sincronía neuronal clavaba en culturas embrionarios de pollo.

Protocolo

El protocolo siguiente se ha estandardizado para probar los efectos de la exposición BPA durante la embriogénesis (temprano) y puede ser modificado para su uso con BPS, BPF u otros EDC en neuronas embrionarias de pollo.

Este protocolo sigue las políticas institucionales de la Universidad Estatal de Delaware y la política del NIH para embriones aviares. El protocolo también está en la confirmación con material y normas de seguridad química del ESD.

1. material instalación

1. BPA (m.w. 228.29) se disuelven en etanol al 10% (v/v) en agua para hacer una solución madre de 1 mM (0,23 mg por mL de etanol al 10%). Hacer diluciones subsecuentes (0.1 μm, 0,5 μm, 1 μm, 5 μm y 10 μm) en medio de neurobasal.
   PRECAUCIÓN: BPA es una toxina ambiental y debe tener cuidado al manipular el polvo.
2. Incubar huevos de pollito en una incubadora de huevo de mesa disponibles en el mercado a 37 ° C. Incubar los huevos durante 7 días para embriones de E7.
3. Preparar medidas esterilizar el número requerido de los AMUMA sumergiéndolos en etanol al 70% durante 3 a 4 horas y luego enjuague tres veces en aproximadamente 10 mL de agua destilada estéril en la campana BSLII.
   Nota: Las MEAs contienen 64 electrodos nanoporosos platino dispuestos en una cuadrícula de 8 x 8. El diámetro del electrodo es de 30 μm y el espaciado entre los electrodos es de 200 μm. No utilice etanol desnaturalizado para esterilizar las MEAs como esto conduce a la corrosión de la MEA.
4. Coloque las MEAs dentro un recipiente estéril con tapa (para mantener las condiciones de esterilidad) y pasar a una incubadora de mesa. Hornear durante al menos 6 horas a 55 ° C. Este paso es vital para la correcta esterilización y la temperatura no debe exceder los 60 ° C. Mantenimiento de la esterilidad, mueva el plato que contiene medidas a la campana BSLII para el almacenamiento hasta su uso posterior.
   Nota: Usamos un plato de la hornada horno vidrio seguro con tapa de plástico y superficie la esterilice con etanol al 70% y en la campana BSLII para el secado.
5. Parte alícuota de la solución de la matriz extracelular MEC. Descongelar el frasco a 4 ° C durante la noche y congelar alícuotas de μl 100 a-20 ° C.
   Nota: ECM se envía congelado. ECM no deberán a temperatura ambiente hasta que esté listo para cubrir que polimeriza a temperatura ambiente y, una vez polimerizado, es imposible cubrir. ECM sin factores de crecimiento es preferible para evitar efectos adicionales debido a factores desconocidos.
6. Esterilizar todos los instrumentos de disección (pinzas Dumont #5 fórceps curvos, pequeñas tijeras y tijeras de primavera) y material autoadhesivo recubierto platos disección con etanol al 70% y deje secar en la campana de la disección.

2. pollo embrionarias neurona cultura y actividad de la red

1. En el día de la galjanoplastia, retire un frasco del ECM del congelador de-20 ° C, rocíe con etanol al 70% y coloque en hielo. Diluir a 25% al agregar 300 μL de medio de neurobasal frío interior campana BSLII.
2. Con una P200 pipetteman añada 100 μl de ECM de 25% para el centro del MEA teniendo cuidado de no tocar los electrodos y retire inmediatamente dejando una película fina en la superficie. Cubrir el MEA y colocar en la incubadora de₂ CO (37 ° C y 5% CO₂) hasta que esté listo para las neuronas de la placa.
3. Esterilizar la cáscara externa de un huevo de E7 (embrionario día 7, se incubó a 37 ° C durante 7 días) con etanol al 70%. Decapitar el embrión en una bandeja de disección Sylgard inferior que contiene balanceados sales solución (HBSS de Hank estéril fría) sin calcio. Cortar alrededor de los ojos y quitar los globos oculares. Con DuMont #5 finas pinzas y tijeras de primavera hacen una incisión en el lado ventral y quitar las capas externas de la piel para exponer El tectum prosencéfalo y óptica. Pelar y quitar con cuidado la membrana pial. Transferir el prosencéfalo en otra placa de Petri y cortarlo en trocitos de unos 2 mm con tijeras de primavera.
   Nota: No debe haber ningún vasos sanguíneos conectados al forebrain después del retiro de la membrana pial. Si está disponible, es preferible realizar la disección en una campana de disección estéril, aunque hemos obtenido bastante buenos resultados cuando la disección se realiza fuera de una capilla como el área de disección y los instrumentos se esterilizan bien con etanol al 70% .
4. Con una pipeta de transferencia estéril, recoger los pedazos de cerebro anterior en un tubo de centrífuga de 15 mL y eliminar gran parte de la HBSS como sea posible después de dejar las piezas de forebrain fregadero a la parte inferior del tubo de centrífuga.
5. Añadir 1 mL de 0.05% tripsina/EDTA (previamente calentado a 37 ° C) e incubar a 37 ° C durante 15 minutos.
6. Utilizando una pipeta Pasteur, cuidadosamente Quite tripsina sin molestar a los pedazos de tejido y añada 1 mL neurobasal medio. Deje que las piezas de tejido fregadero a la parte inferior y quitarlo del medio. Repita este lavado una vez más. Este paso consiste en lavar el tripsina/EDTA.
7. Añadir 2 mL de medio de neurobasal y empezar a trituración. Trituración implica tomar una pipeta de Pasteur estéril fuego pulido y pasando el tejido a través de él varias veces suavemente hasta que no se ven más piezas de tejido. Si las piezas quedan pasadas repetidas, dejarlas a instalarse en la parte inferior.
   Nota: Evite espumar mientras trituración - si espuma forma, detener y quitar por la aspiración.
8. Diluir las células suspende de nuevo 1:10 con neurobasal medio y contar las células viables usando colorante de azul de tripano y un hemocitómetro. Mezcle 50 μl de las células diluidas con 50 μl de solución de azul de tripano en un tubo de centrífuga 0.5ml. Añada 10 μL en el hemacitómetro después de colocar el cubreobjetos y contar el brillantes células claras (células azul están muertos y no deben ser contadas).
   Nota: Número de células típicas de una sola gama de tectum óptico E7 entre 1 y 5 x 10⁷ células/mL.
9. Placa de la disociada células en ECM revestido MEAs en una densidad de 2.200 mm de células de la Plaza. Para nuestro sistema MEA, esto se traduce en aproximadamente 130.000 células por MEA. Añadir medio de neurobasal para llevar el volumen en el MEA a 1 mL y MEAs en la incubadora de CO₂ durante la noche para el accesorio de celular y extensión del neurite (figura 1).
   Nota: Para medidas de diferentes áreas y los números de electrodo, densidad celular diferentes podría ser juzgado - en general, mayor densidad celular resulta en una mayor actividad de la red, pero también conduce a culturas vividas más cortas.
10. Al día siguiente, añadir BPA a una concentración final de 10 μm de neurobasal medio del stock de 1 mM, hecha en el paso 1.1 al MEA tratado. Para el control de la MEA, agregar el mismo volumen del 10% de etanol en solución de agua (v/v).
11. Medio de reemplazar pasó con neurobasal medio que contiene 10 μm BPA cada otro día hasta 7 días en vitro (7DIV) y cada día después de eso, como los aumentos de actividad de red.
    Nota: A medida que aumenta la actividad de red, aumenta la actividad metabólica y cambios de los medios de comunicación deben ser más frecuentes. No deje que el medio vuelta naranja.

3. registro de actividad de la Red Neuronal

1. En el día de la adquisición, cambio el medio de cultivo con medio fresco neurobasal y retomar las MEAs de la incubadora de CO₂ por un mínimo de 2 h antes de grabar. Inicie el software de grabación y ajuste la temperatura de la MEA a 37 ° C haciendo clic en el icono de temperatura (suplementario Figura 3.1a-b).
   Nota: La grabación puede comenzar tan temprano como el día 3 de la galjanoplastia y puede continuar mientras las culturas están vivas.
2. Configurar los parámetros de adquisición haciendo clic derecho sobre el icono de "Musa" (debajo de corrientes en el panel izquierdo de la ventana) y seleccione "Añadir procesamiento" y "Detector de pico" y haga clic en aceptar en el ventana emergente. "Detector del punto (x 6 STD)" aparecerá debajo del nombre del archivo (suplementario Figura 3.2a-b).
3. A continuación haga clic derecho sobre el Detector de punto, seleccione "Añadir procesamiento" y "Detector de la explosión" y haga clic en aceptar en el ventana emergente. "Burst Detector" (ISI) aparecerá debajo del icono de Muse (suplementario Figura 3.3a-b).
4. A continuación haga clic derecho sobre Detector de explosión, seleccione "Añadir procesamiento" y "Compilador de estadísticas nervios." En el pop-up ventana, asegúrese que se seleccionan el encabezado del archivo, agregan también estadísticas y sincronía. Haga clic en Aceptar. "Compilador de estadísticas" aparecerá debajo (suplementario Figura 3.4a-b).
   Nota: Esto ajustará el cruce del umbral adaptativo (filtro STD de 6 x), el intervalo entre pico en 100 ms con un número mínimo de puntos a 5, la media cocción detección de tasa en 10 s con un parámetro de sincronía a 20 ms y la tasa mínima spike 0,083333 picos por minuto.
5. Configurar la grabación programada para el tiempo de grabación de 5 minutos (300.000 ms) haciendo clic en el icono de reloj en la parte inferior. Esto se logra al cambiar la información en la sección de configuración para registrar cada 5,1 minutos y grabar durante 5 minutos. Esto inmediatamente se iniciará y se ejecutará una vez (suplementario Figura 3.5).
6. Asegúrese de que la temperatura de la MEA ha llegado a 37 ° C antes de mover el MEA. Quitar el MEA de la incubadora, coloque en la unidad de grabación y bloquear el MEA. Empezar a grabar la actividad de red haciendo clic en el registro de inicio en la sección de grabación programada o el icono de registro en la ventana "Archivo jugar". Por lo general, un tiempo de grabación de 5 minutos (300.000 ms) es suficiente, aunque pueden obtenerse grabaciones más largas de hasta 10 minutos.
7. Después de la grabación, vuelva el MEA a la incubadora.
   Nota: Debe tenerse cuidado para mantener la esterilidad y para reducir al mínimo el tiempo de que la MEA se encuentra fuera de la incubadora.

4. Análisis de datos

1. Puede realizar un análisis de los datos en bruto sin conexión utilizando el software de grabación. Haga clic en el menú desplegable archivo y abra la grabación. Seleccione el archivo de datos a analizar. Reproducir las grabaciones de raws para capturar los parámetros requeridos de spiking.
2. Para obtener el número promedio de puntos, utilice el módulo Detector de pico y para obtener el índice de la sincronía, el módulo de nervios compilador de estadísticas.
3. Coloque los Spike Detector, Detector de la explosión y módulos del compilador de estadísticas como antes (sección 3).
4. Los menús desplegables en el Spike Detector, Detector de explosión y compilador de estadísticas módulo windows, seleccione lista de Spike, red Burst lista y métricas avanzadas, respectivamente.
5. Haga clic en el botón de grabación para comenzar a grabar el archivo de datos que se creará un archivo CSV en la carpeta dirigida. Los parámetros de punto - el número total de puntos y el índice de sincronía - se registrarán en el archivo CSV.
   Nota: análisis en tiempo Real durante la grabación de datos sin procesar no se recomiendan ya que esto podría consumir tiempo de procesador y recursos computacionales.

Resultados

Examinamos el efecto de BPA en el desarrollo de la sincronía en cultivos neuronales de embriones de pollo. Sincronización de clavar actividad es un indicador del desarrollo normal de las redes neuronales in vitro. Cuando dos puntos se producen dentro de 5 m uno del otro, se consideran síncronas. In vitro las culturas neuronales inicialmente Mostrar actividad clavaba al azar — picos ocurren al azar y los intervalos entre punto presentan una distribución normal. Como los cultivos maduran, la actividad spiking se convierte más sincronizada y los intervalos entre punto son constantes. Actividad spiking síncrona de una cultura se cuantificados por análisis de correlación cruzada de la espiga veces usando grabación software¹² para derivar un índice de sincronía (SI). Hemos encontrado que exposición BPA afecta negativamente el desarrollo de la actividad de red reduciendo actividad spiking y el índice de sincronía (figura 2a y 2b). En Resumen, hemos demostrado que los efectos perjudiciales de la exposición BPA en un embrión afecta su desarrollo, incluyendo la función neuronal que se puede evaluar mediante el desarrollo de la sincronía en las neuronas de chick en la cultura.

Figura 1: Esquemático del protocolo que representan los pasos de disección del prosencéfalo de chick a la disociación, la galjanoplastia y registro de actividad de la red. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: (A) el número promedio de espigas es significativamente menor en BPA tratados culturas de forebrain E7 chick comparado con cultivos control. El número promedio de espigas se extrajo utilizando el software de grabación. Los medios (control, 14.890 ± 949.0, N = 15 y BPA, ± 5.624 465.9, N = 22) fueron significativamente diferentes (prueba de t no pareado, p < 0.0001). (B) el índice promedio de sincronía (SI) es significativamente menor en BPA tratados culturas de forebrain E7 chick comparado con cultivos control. El SI fue extraído mediante el módulo de nervios compilador de estadísticas dentro del software de grabación. Los medios SI (control, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 y BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) fueron significativamente diferentes (prueba de t no pareado, p < 0.0001). Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Fases de rápido crecimiento y desarrollo como la embriogénesis son particularmente vulnerables a los efectos perjudiciales de distintos compuestos interrumpiendo endocrinas incluyendo BPA. Ofrecemos protocolos detallados para estudiar los efectos de la exposición BPA en un modelo de red neuronal vertebrados en vitro . Usando este protocolo, se estableció que el BPA reduce la tasa de aumento así como el índice de sincronía en las redes neuronales en desarrollo (figura 2a-b).

Nuestra metodología fue diseñada para estudiar la exposición BPA durante la embriogénesis temprana y puede ser fácilmente adaptada para estudiar los efectos de otras EDCs. Culturas neuronales embrionarias de la chica son relativamente fáciles de establecer en comparación con otros modelos de vertebrados, incluyendo de la rata o el ratón. Por otra parte, no hay ningún requisito para una sala de animales — una incubadora simple en un banco de laboratorio es suficiente para llevar a cabo estos ensayos. Describimos el uso de un sistema de electrodos múltiples (MEA) para evaluar el efecto de la EDC, BPA, en actividad de la red. Los protocolos aquí descritos pueden aplicarse a otros sistemas. Un aspecto crítico de este protocolo es el mantenimiento de la esterilidad. Esto incluye la disección del embrión en condiciones estériles, esterilizar instrumentos con etanol al 70% y la utilización de equilibrada en la solución estériles de Hank de sales es suficiente. Como los datos se recogen en un período de semanas, es fundamental para mantener el manejo estéril de los AMUMA. Las culturas neuronales una vez establecidas pueden cultivarse a largo plazo - hasta tres meses y por lo tanto son útiles para estudiar la exposición a largo plazo a interruptores endocrinos y otros compuestos en las redes neuronales. Otro aspecto importante de este protocolo es el momento de la disección de chapado. El tiempo óptimo es de 30 minutos, incluyendo la incubación del tejido con tripsina. El más largo el tiempo, los más pobres la supervivencia de las células.

Describimos aquí un protocolo básico que puede ser aplicado a la evaluación de cualquier producto químico o droga que afecta el comportamiento y la función neural. Aquí, hemos utilizado una densidad celular de 2.200 células por mm²; sin embargo, esto puede ser modificado y otras densidades de células pueden ser utilizadas. En general, hemos encontrado que aumentar la densidad celular aumenta la actividad de la red - más picos en menos tiempo. El método descrito, aunque muy útil para evaluar los efectos de productos químicos en la actividad de la red tienen limitaciones. Una de las mayores limitaciones del método es que estos cultivos in vitro son dos dimensiones pueden no reflejar la arquitectura tridimensional del cerebro vertebrado. Esto se puede solucionar mediante el uso de grabaciones de la rebanada. Otra alternativa es aplicar los tratamientos en el embrión de pollito en desarrollo por medio de una ventana pequeña en el extremo ancho del huevo¹⁵, diseccionar el cerebro al final del régimen de tratamiento, hacer secciones gruesas en un vibratome y coloque en el MEA de registro de actividad de red.

Nuestro protocolo es significativo que permite examinar el efecto de EDCs en el desarrollo de la actividad de red y ofrece la exploración de la base mecanicista de los efectos de estos productos químicos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#5 foreceps	Fine Science Tools	11251-10
Axion Muse MEA	Axion Biosystems	M64-GL1-30Pt200	Se llamará sistema MEA en el manuscrito
Axis Software	Axion Biosystems		Se llamará software de registro en el manuscrito
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
pinzas curvas	Fine Science Tools	11272-50
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
Huevos de gallina fertilizados	de cualquier granja local o Spafas
HBSS Fisher		14170112
Hemacitómetro	Fisher	02-671-6
Matrigel Factor de Crecimiento Reducido, Libre de Fenol Rojo	BD Biosciences		356231 Se llamará Matriz Extra Celular (ECM) en el manuscrito
Medio Neurobasal	BrainBits	Nb4-500
Neuroexplorer software estadístico	Nex Technologies	Neuroexplorer versión 5
Pipetas Pasteur	Fisher	13-678-20A
tijeras de resorte	Fine Science Tools	15514-12
Platos de disección de fondo Sylgard	Living Systems Instrumentaion	DD-90-S-BLK-3PK
Tinte azul Trypan	Fisher	15-250-061
Trypsin-EDTA	Fisher	15400054